nha(猫。第1800号)购自上海富蒙基因生物科技有限公司DMEM完全培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、Lipofectamine 2000转染试剂、一步反转录试剂盒、TRIzol试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒均购自Thermo Fisher公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自生技生物工程(上海)有限公司。ELISA试剂盒购自上海日耳曼生物科技有限公司。RIPA细胞裂解液购自北京索来宝科技有限公司。LPS购自上海古辰生物科技有限公司异氟醚购自济南惠丰达化工有限公司BDNF一、二抗购自武汉爱美洁科技有限公司。

NHAs在含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养，在37℃、5% CO中培养<年代ub>2孵化器。培养液每天更换。所述通道在70〜80％的汇合度进行的，并且从通道细胞3到4被用于随后的实验。

药物治疗。在对数生长期n已被采取，并用不同浓度的LPS（0处理过的  μ0.2 g / mL, μ0.5 g / mL, μ克/毫升,1 μg/mL) for 24 h, and the appropriated LPS concentration was selected. After 24 h of treatment with LPS (0.5  μ克/毫升）中，n已被放置在封闭的麻醉箱。入口端连接到一个ISO气体挥发，和95％空气和5％CO<年代ub>2在获得通过该出口端被连接到麻醉气体监视器为ISO浓度检查。Different concentrations of ISO (0.7%, 1.4%, and 2.1%) were passed in for 2 h, and then cell proliferation, apoptosis, and inflammatory factors were measured.

n已在对数生长期拍摄，接种到6孔板中，并培养在37℃，5％CO<年代ub>2孵化器。当细胞汇合达到70〜80％，的miR-206模拟物，抗miR-206，NC-模拟物，及Si-BDNF转染到n已并且在5％CO培养<年代ub>2incubator at 37°C for 48 h before use.

n已的各组在对数生长期的测试中，密度被取出并接种在96孔板 1 × 10 4 细胞/孔。10  μL MTT solution was subsequently added when the cells cultured for 0, 24, 48, 72, and 96 h. After a further 4 h of incubation, the culture supernatant was aspirated, and 100  μ加入L-二甲基亚砜（DMSO）;finally, the absorbance (OD) was measured at 450 nm using a microplate reader.

NHAs to be tested in each group were collected and cultured for 48 h and digested with 0.25% trypsin and centrifuged at 1000 r/min for 5 min. After that, the cells were adjusted to a concentration of 5 × 10 5 细胞/ mL，和5  μ大号的膜联蛋白V-FITC溶液中加入并充分混合。After homogenization, the cells were incubated at room temperature for 15 min in the dark, then 5  μ加入PI染色液L，混匀，孵育5 min;最后用流式细胞仪检测NHAs的凋亡水平。

收集各组待测nhave制备细胞悬液，观察IL-6、IL-1的表达情况 β和TNF α根据相应的ELISA试剂盒说明书进行NHAs的测定。

使用TRIzol法提取总RNA，然后根据miRNA逆转录试剂盒的指令将其逆转录为cDNA。qPCR按照miRNA qPCR试剂盒说明书进行。以U6为内参照，引物序列见表 1。相对表达，使用2计算<年代up>- ∆∆Ct。

取对数生长期各组的NHAs, PBS洗涤2次。总数为0.5 μ实验组加入g/mL LPS，培养24 h后用PBS冲洗细胞2次。然后加入1ml PBS离心(3000 r/min) 5min。离心后弃上清，加入冰冻PBS洗涤3次后加入RIPA裂解缓冲液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每组取等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中阻塞1.5 h。加入一抗(1:10 00)，4℃孵育过夜。第二天，用TBST冲洗膜一次后，将hrp标记的二抗(1:50 000)加入样品中，室温孵育1.5 h。然后用TBST洗膜3次，用ECL试剂盒进行蛋白条带的形成。然后使用ImageJ软件分析各波段的灰度并计算相对表达。

母星数据库是用来预测的miR-206和BDNF的结合位点。的BDNF野生型载体（WT-BDNF）构建;基因突变技术被用来改变的miR-206和BDNF的结合位点，和BDNF突变载体（MUT-BDNF）中的溶液用相同的方法构成。WT-BDNF or MUT-BDNF was then cotransfected with miR-206 mimics or miR-NC into NHAs and cultured for 48 h, and the luciferase activity of each group was measured using the dual-luciferase reporter gene kit [ 8]。

在这项研究中所有实验重复三次，数据表示为 x ¯ ± 年代 。用于统计分析和相关的人物画中的GraphPad 7.0软件。 t -test用于比较两个组之间，并且被用于多组间比较单因子变异数分析。 p < 0.05 和 p < 0.01 表示有统计学意义的差异。

MTT结果表明，细胞增殖的能力以剂量依赖的方式处理n已用不同浓度的LPS（0.0后增加  μ0.2 g / mL, μ0.5 g / mL, μ克/毫升，和1.0  μ克/毫升）（图 1(一), p < 0.01 ），并且在细胞增殖活性没有差异显著LPS时以0.5的浓度  μ克/毫升,1 μ克/毫升。在NHAs之后，首先用0.5处理 μ加入g/mL LPS，不同浓度的ISO (0.7%， 1.4%， 2.1%)， 2h后NHAs的增殖活性最低为1.4%(图) 1 (b), p < 0.01 )。MTT，膜联蛋白V-FITC / PI，和ELISA来测量增殖活性，凋亡率，IL-6，IL-1 β和TNF αNC组，LPS组，和LPS + ISO组中n已表达。显示的结果表明，与NC组，增殖活性和IL-6的表达，IL-1相比 β和TNF α均显著增加，细胞凋亡速率的LPS组中显著降低，而LPS + ISO组颠倒上NHA增殖，细胞凋亡和炎症反应的LPS的附图中的效果（ 1 (c)- - - - - - 1 (e)所有 p < 0.05 )。综上所述，ISO可以逆转LPS对NHAs增殖和炎症反应的促进作用以及对凋亡的抑制作用。

的qPCR结果表明LPS显著抑制miRNA的表达[ 2, 11- - - - - - 13]与增殖相关和n已凋亡（ p < 0.05 , p < 0.01 ），以及加入的ISO扭转这些抑制效果在一定程度上。特别是，所有检查的miRNA中，的miR-206是最显著逆转一个（图 2, p < 0.01 )。因此，可以推断，ISO上调了NHAs中miR-206的表达。

生物信息学数据库母星被用于预测BDNF为的miR-206（图的潜在靶基因 3(一个))。双荧光素酶报告基因的结果显示了miR-206的过表达显著降低了WT-BDNF质粒的荧光素酶活性（ p < 0.01 );但对mutt - bdnf质粒荧光素酶活性( p > 0.05 )。Western blotting结果(图) 3 (c)）还证实了miR-206的过表达在n已显著抑制BDNF表达（ p < 0.01 )。这些结果表明了miR-206的针对性和下调BDNF表达。

Western印迹法检测表达BDNF在n已用LPS处理后，结果表明，撞倒BDNF后，在n已BDNF表达显著降低（ p < 0.01 );此外，BDNF和miR-206的同时敲弱后，BDNF表达显著单独用BDNF的敲低相比增加（ p < 0.01 )，与NC组比较无显著性差异。用LPS处理NHAs后，采用MTT、Annexin V-FITC/PI和ELISA检测其增殖活性、凋亡率和IL-6 IL-1 βNC组、ISO组、ISO+anti-miR-206组、ISO+si-BDNF组、ISO+anti-miR-206+si-BDNF组NHAs表达情况结果表明，与NC组比较，细胞增殖活性、IL-6、IL-1明显增强 β和TNF α而加入anti-miR-206有效逆转了ISO对NHAs增殖、凋亡和炎症反应的影响。而在ISO+si-BDNF组中，ISO组对NHAs增殖、凋亡和炎症反应的影响进一步增强。与ISO+anti-miR-206组相比，ISO+anti-miR-206+si-BDNF组NHAs细胞的增殖活性和炎症反应降低，而凋亡率升高。

与ISO + SI-BDNF基，增殖活性，并在ISO +抗miR-206 + SI-BDNF组升高n已的炎症反应，而凋亡率降低相比，示于图 图4（b）- - - - - - 图4（d）(所有 p < 0.05 )。采取的所有这些在一起，似乎ISO可以逆转LPS对n已影响包括促进增殖，炎症反应，和通过调节所述miR-206 / BDNF轴线抑制细胞凋亡。