Lignin-Carbohydrate复合物基于球面Biocarriers:制备、表征和生物相容性gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

球形biocarriers准备了lignin-carbohydrate复合物分离银杏(gydF4y2Ba银杏叶gydF4y2Bal .)木质部。的比表面积和平均孔径biocarriers 17.15米gydF4y2Ba^2gydF4y2BaggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别和21.59纳米。运营商在溶液中稳定pH值4.0 ~ 9.5。傅里叶变换红外(ir)光谱表明,球形载体木质素和多糖组成的,一个典型的lignin-carbohydrate复杂(LCC)结构。半乳糖的内容、木质素和总糖3.30%,23.9%,和64.62%,分别使球形biocarriers与肝细胞有良好的体力和兼容。这是使用扫描电子显微镜(SEM),观察肝细胞坚持球形biocarriers在文化。细胞计数表明,肝细胞的增殖的实验组明显高于对照组。白蛋白分泌(铝青铜)值与人类肝细胞葡萄糖消耗增加了51.7%和38.6%,分别到第四天biocarriers栽培。结果表明,银杏LCC非常不会引起排斥的,显示了使用承诺作为生物材料在人类肝细胞的文化。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

木质素是一种最丰富的天然产品绘制王国,形成通过酚氧化耦合过程(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。木质素大分子dehydrogenative聚合形成的三个monolignols:gydF4y2Ba-coumaryl、松柏和sinapyl醇(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。一些半纤维素的细胞壁木质化的植物与木质素形成lignin-carbohydrate复合物(LCC) (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。随着分析技术的发展,更多的信息已经在文献中报道描述LCC的结构和性能,特别是lignin-carbohydrate连杆(LC债券)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。如图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(Galacto)葡甘露聚糖是最常见的一个软木半纤维素,这被认为是与木质素通过化学键(半个gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。这是一个分支杂多糖组成的两个葡萄糖)异构体,gydF4y2BaβgydF4y2Ba-D-glucopyranose和gydF4y2BaβgydF4y2Ba-D-mannopyranose,半乳糖单位,是肝细胞的生物活性。最近,LCC作为生物材料吸引了注意力。许多研究人员发现,lignin-carbohydrate复合物是一个很好的天然可降解材料(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外,LCC包含疏水刚性木质素阻塞和亲水性灵活的多糖,使lignin-carbohydrate复合物amphipathy良好,生物相容性和机械强度gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。LCC的木质素和碳水化合物块共聚物不仅对生物材料有一个理想的结构,但也与动物细胞有良好的兼容性gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。刚性木质素块可以形成lignin-protein复合物与膜结合蛋白在动物细胞,使细胞生长(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。此外,灵活的多糖块包含2 - 5%半乳糖体有能力识别肝细胞由于asialoglycoprotein受体的存在(ASGPR)半乳糖作为特定粘合剂配体的肝细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。Galactosylated基质是有用的生物材料制备的支架为肝细胞的培养,因为他们的特定的相互作用与细胞表面的半乳糖基ASGPR [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在文献中描述木质素作为一种生物材料,有两种意见已争论多年。一些研究人员认为,尽管木质素有巨大的力量,它的疏水性可能影响动物细胞粘附在lignin-based biocarriers。其他研究人员表明木质素有许多具有生理活性的官能团,如甲氧基、酚羟基、醇羟基、羧基、羰基,可以促进动物细胞的正常代谢。最近,Erakovic等人研究了改性木质素支架的生物相容性材料和证明了木质素碎片在lignin-carbohydrate复合物不仅有很大的力量,但也有良好的生物相容性gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。此外,钟等。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba和公园等。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]表明,支架固定,半乳糖保留更多的肝细胞比那些被修改的或固定的支架与半乳糖,由于特定的肝细胞之间的相互作用和半乳糖根。杨et al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba和王et al。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]研究了水凝胶的能力准备galactosylated丙烯酸酯(GAC)和聚(N-isopropylacrylamide) (NIPAAm)支架增殖肝细胞和维护白蛋白和尿素合成的功能。他们发现肝细胞发生细胞粘附和增殖的主要表面的水凝胶,这表明掺入含半乳糖的广汽单位可以刺激细胞吸附和增长,相比与传统PNIPAAm水凝胶。在我们之前的研究中,吴等人报道,水凝胶由人工LCC,也就是说,脱氢聚合物——(设计马力)半乳糖复杂,具有良好的生物相容性与人类肝细胞(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。然而,自然LCC与肝细胞的生物相容性仍在接受调查。gydF4y2Ba

为了理解的可能性自然LCC的应用在组织工程领域,LCC是孤立的从银杏木材(gydF4y2Ba银杏叶gydF4y2Bal .)的裸子植物。球形生物运营商准备使用液态氮冷冻干燥方法。球形biocarriers相对大的比表面积可以为细胞培养提供更多的增长领域gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。肝细胞难以扩散在单层文化和很容易被胰蛋白酶消化和可能解决使用球形biocarriers [gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。在这个工作中,傅里叶变换红外光谱(ir)、光学显微镜、精度高的表面积,孔径分析仪用来描述球形biocarriers的结构和形态。biocarriers被用于人类肝细胞的文化。观察肝细胞的生长在biocarriers使用一个倒置生物显微镜和扫描电子显微镜(SEM)。细胞的代谢活动,包括白蛋白分泌和葡萄糖的消耗,也决定。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。材料gydF4y2Ba

银杏树从武汉植物园。人类肝细胞(L-02)是由Pricells公司(武汉,中国)。gydF4y2Ba

2.2。制备银杏LCCgydF4y2Ba

银杏木材餐(40 -网)提取使用苯/乙醇(2/1,V / V),后跟一个热水治疗7天,然后在真空干燥。extractives-free木机进一步为72 h与水冷振动球磨机。银杏LCC是然后使用Bjorkman提取和纯化方法(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.3。后处理的LCCgydF4y2Ba

LCC进一步处理热水在50°C,从而消除水溶性分数将导致LCC-based球形biocarriers肿胀。银杏LCC和蒸馏水放入一个锥形烧瓶。混合搅拌在50°C 8 h,然后过滤。不溶于水的LCC分数是通过冷冻干燥,收益率:21.7%。gydF4y2Ba

2.4。制备LCC-Based球形BiocarriersgydF4y2Ba

银杏LCC-based球形biocarriers使用冻干方法得到,如图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。首先,1克水不溶性银杏LCC溶解在5毫升90% (V / V)乙酸在磁搅拌。其次,解决方案是使用1毫升注射器放入液氮。第三,得到球形biocarriers干燥冷冻珠子使用冷冻干燥机(美国Labconco 195)。球形biocarriers的形态学特点是使用光学显微镜和扫描电镜。gydF4y2Ba

2.5。傅立叶变换红外光谱gydF4y2Ba

KBr丸准备从1毫克predried KBr研磨样品和60毫克。光谱被记录在4000厘米的范围gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}-400厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}使用傅立叶变换红外光谱仪(热费希尔6700,美国)。gydF4y2Ba

2.6。组成的球形Biocarriers材料gydF4y2Ba

Three-milligram球形biocarrier样品在室温下使用3毫升72%硫酸水解为60分钟。硫酸是然后用蒸馏水稀释至4%,样品水解45分钟在一次满121°C。混合1 g4玻璃过滤器过滤。滤液是用来检测样品的糖成分HPLC(20,日本岛津公司)配备Aminex hpx - 87 p列在85°C使用水作为洗脱液速度0.6毫升的分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。不溶于水的部分是用来确定酸不溶木质素(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.6.1。球形Biocarriers的扫描电镜观察gydF4y2Ba

球形biocarriers穿上硅片,喷金离子在真空。表面和横截面的形态结构是使用地产- 6390 lv SEM观察。gydF4y2Ba

2.6.2。直径的球形BiocarriersgydF4y2Ba

样本检查使用立体显微镜(日本奥林巴斯SZX16)配备一个规模。的平均直径球形biocarriers计算。gydF4y2Ba

2.6.3。为特定的表面球形Biocarriers测定预处理gydF4y2Ba

一个空的管是称重和标记为gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba球形biocarriers放入空管和治疗在120°C 4.5 h。干球biocarriers在冷却槽冷却到25°C。管包含biocarriers称重和标记为gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba的价值gydF4y2Ba-gydF4y2Ba球形biocarriers的重量。gydF4y2Ba

2.6.4。测定比表面积gydF4y2Ba

氮吸附法(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)是用于确定特定的表面使用BELSORP-mini II型精度高的表面积和孔隙大小分析仪(Ankersmid、荷兰)。Brunauer-Emmett-Teller(打赌)比表面测定是基于气体在固体表面的吸附特征。此外,对应于定义的压力,平衡吸附是明确的。平衡吸附确定相当于样品的比表面积。公式来计算这些gydF4y2Ba Sg是样品的比表面积(mgydF4y2Ba^2gydF4y2BaggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba});gydF4y2Ba饱和氮分子单层吸附(mL);gydF4y2Ba是样品的实际吸附(mL);gydF4y2Ba样品的重量(克);gydF4y2Ba常数相关样品的吸附能力;gydF4y2Ba吸附剂分压;gydF4y2Ba吸附剂饱和蒸汽压。gydF4y2Ba

2.6.5。孔隙大小的决心gydF4y2Ba

孔隙大小也决定使用BELSORP-mini II型精度高的表面积和孔隙大小分析仪(Ankersmid、荷兰)。气体吸附法被用来确定孔隙大小。这种方法是基于毛细凝聚和体积等效替换。相应的比例gydF4y2Ba ,有一个临界半径,家乡。临界半径计算使用开尔文方程如下:gydF4y2Ba

2.6.6。球形Biocarriers的尺寸稳定gydF4y2Ba

5毫克的球形biocarriers悬浮在5毫升的缓冲溶液在不同pH值(醋酸缓冲pH值4 ~ 5、磷酸缓冲pH值6.8 ~ 7.4,和碳酸氢钠缓冲pH值9.5)。球形biocarriers的大小和形态在不同的缓冲溶液测定使用立体显微镜(日本奥林巴斯SZX16)配备规模后15天。gydF4y2Ba

2.7。文化的人类肝细胞gydF4y2Ba

人类肝细胞(L-02),从Pricells公司(武汉,中国),获得与磷酸盐缓冲剂冲洗。肝细胞接种到12-well文化板块的密度3×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。球形biocarriers然后在120°C消毒4 h。这些被添加到井2.5毫克毫升的浓度gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。肝细胞的球形biocarriers孵化在37°C, 5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,100%的相对湿度。所使用的培养基是rpmi - 1640补充20%的边后卫,1%青霉素,链霉素的解决方案。人类肝细胞的粘附到球形biocarriers观察日常使用XDS-1倒置生物显微镜。浮在表面的游离收集日常检测细胞的代谢活动。gydF4y2Ba

2.7.1。细胞数量计数gydF4y2Ba

在1 ~ 5天的文化液体媒体每天收集。与磷酸缓冲细胞被洗两次,其次是0.25%胰蛋白酶1 ~ 2分钟。媒体含有胰蛋白酶被丢弃。然后添加了新媒体终止消化。细胞不再坚持但细胞悬液。二百毫升的悬浮液体被与相同体积的0.4%台盼蓝染色法和混合解决方案。一些染色的细胞放在血液细胞计数板。染色细胞的数量是计算使用显微镜。gydF4y2Ba

2.7.2。由扫描电镜观察细胞粘附的载体gydF4y2Ba

在细胞培养的第3天,有些球biocarriers被移除。球形biocarriers固定使用2.5%戊二醛(GA) 12 h在4°C。球形biocarriers被进一步使用0.1%锇酸固定30分钟。球形biocarriers洗后使用磷酸盐缓冲剂,梯度脱水进行了使用乙醇浓度为30%,50%,70%,80%,90%,100%。干球biocarriers被安排到硅片,喷金离子在真空。肝细胞坚持球形biocarriers使用地产- 6390 lv SEM观察。gydF4y2Ba

2.7.3。检测代谢活动gydF4y2Ba

白蛋白分泌的数量决定使用工具的方法根据指令数量A028(由南京建成生物工程研究所提供,中国)。简单地说,10gydF4y2BaμgydF4y2BaL蒸馏水,标准的白蛋白,浮在表面的游离是添加到试管中。添加2.5毫升溴甲酚绿缓冲区后,样品被动摇。反应进行了10分钟后在室温下,吸收值在628 nm监控使用紫外可见分光光度计(日本岛津公司2550年,日本)。gydF4y2Ba 其中铝青铜是内容(g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}白蛋白);gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba和gydF4y2Ba样品的吸光度值标准管,管,和对照组,分别。gydF4y2Ba(g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的浓度标准。gydF4y2Ba

由肝细胞葡萄糖消耗的数量决定使用工具的方法根据指令数量CAT361500(由南京建成生物工程研究所提供,中国)。在试管中,10gydF4y2BaμgydF4y2BaL蒸馏水,标准的葡萄糖,浮在表面的游离是补充道。后的1毫升的解决方案包含磷酸盐缓冲剂(pH值7.0),更易与酚10.6 LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}70年,aminoantipyrine更易与LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},样品被动摇。反应进行了15分钟后在37°C,吸收值使用紫外可见分光光度计测定在505海里。gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba是内容(更易与LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的葡萄糖。gydF4y2Ba和gydF4y2Ba的吸光度值标准管和样品管,分别。gydF4y2Ba(g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的浓度标准。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。傅立叶变换红外光谱分析gydF4y2Ba

的峰值3419.2厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}被分配到银杏LCC的羟基,如图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。切断伸展的强烈吸收1035.6厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}表明多糖的存在(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。峰值为1510厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和1423.2厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与芳香结构的振动在木质素(半个gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。傅立叶变换红外光谱分析证实,球形biocarriers有典型的LCC结构由木质素和多糖。刚性疏水性木质素和灵活的亲水多糖片段给了球形biocarriers amphipathy属性和高强度好,自然医学材料的基本要求。gydF4y2Ba

3.2。成分分析gydF4y2Ba

半乳糖可以被一个受体在肝细胞和肝细胞的生理活动(高gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。半乳糖是用来提高选择性biocarriers和肝细胞之间的相互作用。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,LCC高分子半乳糖单元的内容是3.30%。木质素和总糖的内容分别为25.5%和64.62%,分别,这给了球形biocarriers好体力(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。结果表明,球形biocarriers适合用作biocarriers人类肝细胞。gydF4y2Ba

3.3。从银杏LCC形态学的球形BiocarriersgydF4y2Ba

球形biocarriers准备与银杏LCC多孔材料由光学显微镜和SEM观测到的。如图gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba球形biocarrier是浅灰色。球形的形态学biocarriers证明了LCC颗粒多孔,适合细胞培养条件下biocarriers如图gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.4。直径的确定和稳定性gydF4y2Ba

作为生物材料,大直径biocarriers将减少的比表面积,而小直径会增加biocarriers的密度。都可能会影响细胞的生长。因此biocarriers必须在适当的直径范围为特定细胞。在这项研究中,干燥和潮湿的直径的球形biocarriers -2.1 1.8 -2.0毫米和1.9毫米,分别。有一些干和湿球biocarriers之间的区别。结果表明,球形biocarriers稳定的直径范围内,适合细胞培养。稳定的球形biocarriers决心在高浓度的球形biocarriers悬浮在pH值4 - 5的弱酸性,中性溶液pH值7.4,碱性溶液的pH值9.5。在图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,这是发现球形biocarriers保持完整的直径和风格在暂停后15天。这是发现球形biocarriers稳定性好,适合种植在不同的pH值。gydF4y2Ba

3.5。比表面积和平均孔径球面BiocarriersgydF4y2Ba

的比表面积和平均孔径球面biocarriers使用高精度表面测试仪测量。选择曲线如图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。的gydF4y2Ba使用线性斜率和截距值可以计算出图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。根据(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和开尔文方程(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)、比表面积和平均孔径球面biocarriers计算是17.15米gydF4y2Ba^2gydF4y2BaggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别和21.59纳米。结果表明,球形biocarriers有高的比表面积。因此,球形biocarriers可以为细胞的生长提供足够的表面,增加细胞密度。的单层细胞经历了胰蛋白酶消化过程,可以减少损害细胞的细胞很容易从媒介,与传统的单层细胞培养相比,因为3 d使用球形biocarriers文化结构。gydF4y2Ba

3.6。肝细胞的细胞生长和代谢活动坚持球形BiocarriersgydF4y2Ba

在biocarriers的存在,人类肝细胞(L-02)静态培养。如图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,发现大多数肝细胞坚持球形biocarriers,表明LCC是无毒的,不会引起排斥的,适用于肝细胞文化。利用细胞计数,细胞生长条件实验和对照组悬挂在1到5天观察图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。培养细胞的实验和对照组在第一次3天增长缓慢。第四天,细胞的增殖率增加,这是更大的实验组比对照组。gydF4y2Ba

在图gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,发现白蛋白分泌的内容(铝青铜)肝细胞培养在多孔biocarriers也显著大于对照组(没有biocarriers)。第四天培养铝青铜值达到10.45 g d的最高水平gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},而对照组有高价值的6.89 g dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。因此,铝青铜的示例使用biocarriers与控制相比增加了51.7%。如图gydF4y2Ba11gydF4y2Ba肝细胞的葡萄糖消耗显著增加使用biocarriers相比,控制实验。在第四天的培养,葡萄糖消耗达到最大值14.0更易与dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},最高价值是10.1更易与dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在对照组。这表明,样品使用的葡萄糖消耗价值biocarriers与控制相比提高了38.6%。这些结果表明,使用银杏biocarriers LCC与人类肝细胞的生物相容性。LCC是一种很有前途的生物聚合物,可用于组织工程文化的创建肝肝细胞器官。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

(1)gydF4y2Ba球形运营商准备使用lignin-carbohydrate复合物从杨树木材与液氮冷冻干燥方法。发现运营商在水溶液稳定。比表面积和平均孔径是17.154米gydF4y2Ba^2gydF4y2BaggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别和21.59纳米。比表面分析和扫描电镜结果表明,球形运营商准备从银杏LCC可以提供大量细胞生长的平台。gydF4y2Ba(2)gydF4y2Ba傅立叶变换红外光谱分析表明木质素和多糖组成的球形载体。球形biocarriers有典型的LCC结构。化学分析表明,半乳糖的内容,木质素,和总糖3.30%,23.90%,和64.62%,分别给予良好的体力和兼容性的biocarriers肝细胞。gydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba细胞计数表明,细胞比对照组增加更快。也发现,白蛋白分泌(铝青铜)值和人类肝细胞葡萄糖消耗提高了51.7%和38.6%,分别,当biocarriers栽培。结果表明,银杏LCC非常生物相容性材料和显示承诺作为生物材料在人类肝细胞的文化。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称他们没有利益冲突在这个工作。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢中国国家自然科学基金委的支持(补贴。31370574也没有。31300494)和绿色材料湖北省重点实验室轻工业(Q20131402)。作者感谢李教授薛峰说他的帮助biocarriers的准备。gydF4y2Ba

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