隔离和热稳定的细菌素乳酸链球菌肽来源于乳清为抗菌聚合物的修改

文摘

本工作描述小说选择提取细菌素从乳清发酵乳酸链球菌肽媒体利用聚乙二醇及其稳定矩阵具有高实用性。本产品与商用乳酸链球菌肽产品稳定和氯化钠的乳酸链球菌肽提取和稳定使用硫酸铵和聚山梨酯80。样品的稳定性测试通过长期存储在−18日4,25岁和55°C到165天。乳酸链球菌肽含量的高效液相色谱测定样品中的和电泳。此外,乳清强化效果与乳糖生产乳酸链球菌肽和抗菌活性研究金黄色葡萄球菌进行了测试。结果表明,稳定的聚乙二醇提高乳酸链球菌肽活动55°C 14天后和长期稳定在25°C保持抗菌活性。

1。介绍

乳酸链球菌肽是一种水溶性多环芳香肽具有优良的抗菌特性对革兰氏阳性菌株(1]。属于群lantibiotics的细菌素,在几个不同变体在氨基酸序列的结构,是由细菌菌株具有特定的基因组。细菌素是指定乳酸链球菌肽,乳酸链球菌肽Z,乳酸链球菌肽Q, F乳酸链球菌肽(Lactococcus lactis)、乳酸链球菌肽U(链球菌uberis)(2- - - - - -6]。最近,由乳酸链球菌肽H变体链球菌hyointestinalis被奥康纳et al。7]。

乳酸链球菌肽属于第一次描述了细菌素,它被认为是一种生物安全食品防腐剂由联合国粮食及农业组织和世界卫生组织已经在1968年(8]。通过发酵生产依然衬底,如乳清或牛奶的上述菌株(9]。

以来已经有越来越多的科学和工业对天然抗菌化合物可用于有效的抗菌素修改聚合物,乳酸链球菌肽是理想的修饰符显示抗菌活性在低浓度,预先确定其应用于食品包装、化妆品和/或医疗设备生产。此外,立法要求介绍乳酸链球菌肽改性聚合物体系在市场上可能会大大降低,因为它被认为是一个安全的化合物(8]。

由于乳酸链球菌肽稳定性有限,利用稳定剂是必要的延长其活动。进一步使用添加剂改善其稳定性。集中,商用乳酸链球菌肽通常是生产和加工成粉含有超过90%的稳定剂盐,尤其是食盐(氯化钠)10]。除了氯化物,硫酸盐(11)和/或表面活性剂(12可以使用)。然而,稳定的高浓度盐限制的应用程序处理纳入聚合物系统由于他们与大多数不相容矩阵。

几个作品处理抗菌改性聚合物的乳酸链球菌肽已经出版。然而,大多数的作品描述乳酸链球菌肽应用等离子体活化聚合物表面改性剂(13)或矩阵的水溶性聚合物(14,15]。热塑性并入热塑性淀粉矩阵也被报道(16]。另一方面,乳酸链球菌肽纳入相关文献中描述的化妆品成分很少。

无盐乳酸链球菌肽稳定的可能性之一是其附件通过共价聚合物链和共价债券。PEGylation就是典型的例子包括聚乙二醇(PEG) (17集团的]是完全生物相容性的高分子聚醚(18]。挂钩是常用的医学,制药学,和化妆品19]。因此乳酸链球菌肽作为抗菌剂和挂钩的兼容稳定器可以适用于大多数应用程序上面的介绍。

尽管事实上,乳酸链球菌肽PEGylation已经知道,描述PEGylation的详细研究影响乳酸链球菌肽的时间——温度稳定性及其与传统的盐比较稳定没有被报道。

这项工作重点是比较研究的长期稳定(165天)和温度(−4 55°C)的活性乳酸链球菌肽稳定盐和聚合物为基础的化合物。在这项研究中,实验准备了乳酸链球菌肽发酵乳制品的副产品乳清,随后稳定氯化钠、硫酸铵,非离子表面活性剂(渐变)和挂钩。研究不同温度下其长期稳定性通过高效液相色谱法(HPLC),电泳,微生物分析。

2。实验部分

2.1。材料

甜牛奶乳清是请提供由当地乳制品研究所(KROMILK稀世,捷克共和国)。硫酸铵(NH)₄)₂所以₄)、食盐(氯化钠)、氢氧化钠(氢氧化钠),硫代硫酸钠(Na₂年代₂O₃硫酸)、铜(II)五水化物(CuSO₄h·5₂O),酒石酸钾钠四水合物(C₄H₄O₆假名·4 h₂O)、甲醛溶液、醋酸、甲酸(85%)和甲醇买来五(布拉格,捷克共和国)。渐变80,三羟甲基氨基甲烷Pufferan液,Tricine Pufferan, tetramethylethylenediamine (tem)、十二烷基硫酸钠(SDS)、巯基乙醇,溴酚蓝Na-salt,过硫酸铵(APS)提供从P-Lab(布拉格,捷克共和国)。2050年聚乙二醇(PEG),乳糖,三氟乙酸(TFAA),碳酸氢铵(NH)₄HCO₃)、丙烯酰胺、N, N′亚甲基bisacrylamide, Pharmalyte,考马斯亮蓝R250,戊二醛,分子量(MW)和等电点聚焦(IEF)标记,乳酸链球菌肽标准(2.5%,平衡氯化钠和变性乳固体),和牛血清白蛋白(BSA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。盐酸(HCl),单磷酸(不₂阿宝₄)、磷酸钾(K₂HPO₄)、硼酸(H₃薄₃)、磷酸(H₃阿宝₄),硝酸银(AgNO₃)、乙醇(96%)和甘油提供从IPL (Uhersky布洛德,捷克共和国)。高效液相色谱梯度级乙腈(ACN)从化学实验室(Zedelgem、比利时)。乳酸菌汤(M369)和穆勒夫人辛顿琼脂(尼古拉斯)从HiMedia购买(印度孟买)。使用的所有化学试剂均为分析纯,收到。

bacteriocin-producing拉伤Lactococcus lactis无性系种群。lactis(CCDM 731)是来自乳制品微生物的集合,Laktoflora,乳制品研究所,布拉格,捷克共和国。nisin-sensitive拉伤金黄色葡萄球菌从捷克获得的4516年(CCM)是微生物的集合,马萨里克大学的布尔诺,捷克共和国。

2.2。样品制备

一个整除(一个接种循环)l . lactis无性系种群。lactis培养在50毫升的汤夫人(媒体推荐的培养乳酸菌物种)在厌氧条件下30°C 48 h。这preculture被转移到牛奶乳清强化与乳糖(0 - 200 g / l) 1: 50比率(即。,1 ml of preculture to 50 ml of fortified whey) and the medium pH was raised to 5.5–6.0 with 0.1 M-NaOH. The inoculated medium was incubated for 48 h at 36°C with constant shaking (245 rpm) in laboratory incubator (Incucell 404, BMT a.s., Brno, Czech Republic). The fermentation product was centrifuged (Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) for 25 min at 10°C and 15,000 rpm and the supernatant was collected and processed by three different methods. A designation of prepared samples is shown in Table1。

方法1:用硫酸铵沉淀(如)。(NH的数量₄)₂所以₄(35% (w / v))被添加到上层清液,不断动摇在4°C条件室(404年Climacell BMT其子as。捷克布尔诺)18 h。然后混合离心机25分钟在10°C和15000 rpm。上阶段分离和干后使用冷冻干燥机(ScanVac CoolSafe 110 - 4 PRO, Lynge,是丹麦)。

方法2:两相萃取渐变。该系统由溶解1% (w / v)二层80和20% (w / v) (NH)₄)₂所以₄在上层清液获得的。然后混合物动摇了30分钟左右站16小时。后相分离上层阶段分离和冻干。

方法3:两相萃取挂钩。第一介质的pH值调整到5.4 - -6.5与0.1 M-NaOH和15% (w / v)挂钩2050和13% (w / v) (NH₄)₂所以₄是补充道。提取时间是40分钟。混合之后,一直在4°C 1 h,然后上面的相分离和冻干。

2.3。总蛋白质含量的测定

蛋白质和多肽的总量是评估在发酵后的液相和离心布拉德福德(提出的利用比色法20.),与BSA作为标准。蛋白质含量测定spectrophotometrically(无限M200Pro NanoQuant,用ELISA读者,Mannedorf,瑞士)在595海里。

2.4。Tris-Tricine-Sodium十二烷基Sulfate-Polyacrylamide凝胶电泳(Tris-Tricine-SDS-PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶(PAA) (10% 3% T / C)作为一个统一的分离胶和股票的解决方案(缓冲区)Tris-Tricine-SDS-PAGE准备根据Schagger和冯Jagow [21]。样本的蛋白质结合缓冲溶液的混合物是变性5分钟前在80°C被加载到凝胶。电泳进行了恒定电压190 V蓝星(Blirt S.A.通过使用设备,Dantsic, Poland) and Mini Vertical Dual (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany), power supply Consort EV 202 (Consort bvba, Turnhout, Belgium). Finally, the proteins were fixed and stained with Coomassie Brilliant Blue R250 [22)或AgNO₃(当乐队中的蛋白质含量低于0.5μg)。

相对应的假设是乐队,分子量约为3.5 kDa根据MW标记包含乳酸链球菌肽的混合物和乳酸链球菌肽z电泳后,这些乐队是切除并提取。使脱色溶液由NH组成₄HCO₃和ACN(1: 1)和一个提取混合物由5%的甲酸和ACN (1: 2)。乳酸链球菌肽浓度是决定根据布拉德福德(20.)和高效液相色谱法。布拉德福德的方法,建立了校准曲线通过使用商业乳酸链球菌肽的存在相应的稳定剂(PBS NIS-AS(磷酸缓冲盐),渐变为NIS-Tween 80,和PEG2050 NIS-PEG样本)。

2.5。反相高效液相色谱法(rp)

使用高效液相色谱法测定乳酸链球菌肽浓度水域717 + Autosampler(水域GmbH,行星齿轮,捷克)配备了双波长UV / Vis探测器。XSelect,使用C18 CS(5列μ米,4.6×250毫米,水域,米尔福德,妈,美国)precolumn Reprosil 100 C18 (5μ米,50×4毫米,Watrex,布拉格,捷克共和国)使用。校准解决方案和样本准备用0.2盐酸和注射器过滤器过滤孔径0.45μm。流动相梯度和组织组成的0.05% (v / v) TFAA高效液相色谱梯度年级ACN(溶剂)和0.05% (v / v) TFAA蒸馏水(溶剂B)。20%的梯度由溶剂溶剂(A)和80% (B)在0 - 5分钟,80%溶剂(A)和20%的溶剂在6 20分钟(B),和80%的溶剂(A)和20%的溶剂在意向再次(B)分钟。注射量是25μl和流率为0.6毫升/分钟。在执行测量波长的200和220海里(乳酸链球菌肽浓度计算结果的200海里)。

2.6。琼脂扩散试验的抗菌活性

乳酸链球菌肽活动是由agar-well扩散法,使用金黄色葡萄球菌微生物指标。细菌培养(10的整除⁸CFU)应用无菌拭子表面的穆勒辛顿琼脂板。测试样本准备在去离子水的起始浓度的乳酸链球菌肽与25μ克/毫升。之后,解决方案被转移到无聊井直径8毫米(250μl /)和孵化24小时35°C。孵化后,抑制区域的直径被确定为四个独立测量的平均值。

2.7。稳定性测试

准备样本期间稳定存储了165天−18°C, 4°C, 25°C, 55°C。样本不断收集和测试通过使用布拉德福德方法,rp -,和琼脂扩散试验测定乳酸链球菌肽活动,如上所述。准备样品的热稳定性(TS)计算如下: 在哪里乳酸链球菌肽浓度在特定时间;开始乳酸链球菌肽的浓度。

3所示。结果与讨论

3.1。对乳酸链球菌肽生产乳糖含量的影响

充足的碳基质是必要的内容优化生产细菌素乳酸链球菌肽乳酸菌。乳糖是一个可能的碳源的副产品,乳清,包括发酵的主要部分媒体用于这项工作。在乳清,乳糖含量通常从6.0%至4.5不等(23,24]。

发酵的影响媒体强化对乳酸链球菌肽生产乳糖被评估在许多研究。最优生产乳酸链球菌肽时报道中包含30 g / l乳糖(25,26]。然而,反应的产量取决于许多因素,如菌株,发酵条件(即。、温度、pH值、和时间),和媒体的组成。

在这项研究中,乳酸链球菌肽生产检查各级的乳糖强化0 - 20% (w / v)。结果在图1作为乳酸链球菌肽生产有效性的依赖,表示为浓度确定后48小时的发酵。乳酸链球菌肽生产由rp技术决定。

可以看出,乳酸链球菌肽产量增加强度抗震设防水平的上升和高达4%的乳糖。进一步减少乳糖除了导致乳酸链球菌肽生物合成由于可能出现的竞争在媒体发酵过程和渗透压升高(27]。虽然4%的乳糖浓度被发现最好的乳酸链球菌肽生产,由于技术和经济方面(高粘度发酵媒体4 wt。%的额外乳糖含量),乳清强化2 wt。%的乳糖被选为进一步实验制备乳酸链球菌肽。

3.2。Lyophilisates中乳酸链球菌肽含量的定量分析

冻干样品准备的方法1 - 3是由高效液相色谱分析和电泳如上表示。表中给出的结果2本研究表明,这两种方法用于(高效液相色谱法和电泳)带来类似的结果。乳酸链球菌肽含量取决于后者方法是高效液相色谱法测定的高出15%,这两种技术的不同原则造成的。它是由这两种技术的选择性。而高效液相色谱法只考虑乳酸链球菌肽的一种形式(由于校准商用乳酸链球菌肽),电泳和随后的分析根据布拉德福德方法覆盖的蛋白质分子量约3.5 kDa,也包括乳酸链球菌肽Z形式(3]。样品中的乳酸链球菌肽含量稳定在硫酸铵(NIS-AS)和渐变(NIS-Tween)被发现是相同的(2.3毫克/克,高效液相色谱法)。另一方面,样品稳定通过使用聚乙二醇(NIS-PEG)乳酸链球菌肽含量明显高于5.3毫克/克(由高效液相色谱法)。这是超过2.3倍的NIS-AS NIS-Tween。

自初始物质乳酸链球菌肽提取方法(即是相同的。,nisin content in the fermentation media was constant), it is clear that extraction step efficiency is the crucial for the nisin content in the resultant samples. The results show that PEG interacts with nisin, which leads to noticeable bacteriocin separation from the fermentation media. The principles of PEG-nisin interactions has been described referring to the ability of formation of protein-polymer conjugates that can display unique combination of protein and synthetic polymer based material properties [28]。

3.3。测试热长期稳定

众所周知,蛋白质对热处理敏感,特别是在关系长期稳定和活动(29日]。在这项研究中,热稳定性观察乳酸链球菌肽产品在存储(165天)在四个不同温度下代表生产条件(−18°C,冻干法),存储(4和25°C)和处理(55°C)。乳酸链球菌肽含量的变化测试样本存储在不同温度55天图所示2。它可以注意到乳酸链球菌肽浓度在所有粉末样品储存在−18°C只改变可以忽略。存储在4°C引起的轻微减少乳酸链球菌肽含量和TS随后(NIS-Tween NIS-AS NIS-NaCl 9%, 33%, 18%, 25% NIS-PEG)。相反,存储在25°C导致急剧下降后TS值55天。乳酸链球菌肽的稳定性最低的是观察到的NIS-Tween(减少87%),其次是NIS-PEG (71%)、NIS-NaCl(85%),和NIS-AS (51%)。然而,TS的样品NIS-NaCl NIS-AS, NIS-PEG是相对较高的前15天内的实验。所有样本存储在55°C进行了TS值急剧下降。在所有情况下,减少乳酸链球菌肽浓度高于90%,55天。TS的发现NIS-AS 11天由于低乳酸链球菌肽稳定导致unreproducible样本分析的结果。此外,值得一提的是,尽管TS NIS-PEG系统与其他调查样本,乳酸链球菌肽浓度的绝对值是至少2.3倍(见下表2)(即。,absolute concentration of nisin is higher).

在图3乳酸链球菌肽产品,TS值确定后electrophoresis-Bradford方法(A)和(B)运用高效液相色谱法测定比较后165天。稳定损失165天的存储后−18°C约为5 - 10%所有测试样品和存储在4°C是约20%的样品除了NIS-AS, TS在40%左右。显著变化的稳定性观察在存储25°C和55°C,稳定性最高的注意到在NIS-PEG(28%在25°C和4% 55°C)相比,其他样品包括商业乳酸链球菌肽(NIS-NaCl)。

这些结果与发布的工作主要是在协议Rollema et al。30.]报道乳酸链球菌肽的化学稳定在20岁,37岁,各缓冲区在75°C的pH值范围从2到8。乳酸链球菌肽稳定3个月后存储在20°C导致细菌素减少50 - 70%的内容。

3.4。Lyophilisates检测乳酸链球菌肽抗菌活性

众所周知,乳酸链球菌肽具有很强的抗菌活性与革兰氏阳性菌株(15]。有两个死亡机制针对细菌细胞膜的特性(31日]。在低浓度、乳酸链球菌肽分子结合脂质二世,在正确的细胞壁合成和阻塞,导致细胞死亡。此外,在较高的浓度,nisin-lipid II复杂启动膜孔隙的形成引起膜电位和快速流出的耗散离子和胞质溶质(特别是氨基酸和核苷),也导致破坏的细胞。

乳酸链球菌肽的抗菌活动lyophilisates存储在不同温度(4−18日,25日和55°C)后立即准备和存储后通过抑制14和165天金黄色葡萄球菌菌株呈现在表中3。可以看出,刚做好的NIS-AS和NIS-NaCl NIS-Tween显示结果的可比性。另一方面,抑菌圈直径NIS-PEG略小于其他人。这个结果与有限的流动性的乳酸链球菌肽由于与挂钩(如上所述)的相互作用导致降低活性物质的扩散槽琼脂媒体。

的乳酸链球菌肽活动lyophilisates储存在−18°C是没有改变即使165天。相反,减少抗菌活性表达为观察抑菌圈直径在温度高于0°C。虽然变化抑制区域的大小没有观察到后14天的存储在4°C,这个温度在165天的治疗后引起NIS-AS抗菌活性降低31%,约10%的其他样本。存储在25°C导致抗菌活性显著下降。观察抗菌最低稳定后14天的NIS-NaCl(减少94%),其次是NIS-AS (68%)、NIS-Tween(29%),和NIS-PEG (18%)。存储在同一温度165天后导致减少在NIS-PEG NIS-Tween和抗菌活性高于90%的活动完全丧失NIS-NaCl和NIS-AS样本。

最后,抗菌活性的样品储存在55°C是注意到只有在NIS-Tween NIS-PEG后14天。对于NIS-PEG甚至超过70%。这个结果与挂钩乳酸链球菌肽的相互作用有关,也就是说,与常见的不饱和氨基酸(dehydroalanine dehydrobutyrine)或氨基酸的氨基和羧基组(17]。

4所示。结论

新方法对细菌素的提取和稳定乳酸链球菌肽通过介绍聚乙二醇(PEG)的研究。产品NIS-PEG与商用乳酸链球菌肽产品稳定氯化钠和乳酸链球菌肽提取使用(NH和稳定₄)₂所以₄和聚山梨酯80(渐变)。

研究结果表明,乳清(i)强化与乳糖在4 wt是最优的。添加乳糖的%;然而,2 wt。%方便由于技术原因;(2)定量测定乳酸链球菌肽的分析技术用于这项工作(高效液相色谱,电泳)相互对应;(3)热稳定性测试NIS-PEG可比与其他测试样品;(iv) NIS-PEG产品具有明显增强长期稳定保存165天时25°C;(v)挂钩稳定甚至更有效的样本保存14天55°C相比,商用产品(NIS-NaCl)。

新引入的方法显著扩大应用可能性乳酸链球菌肽的抗菌改性剂对疏水性和亲水性聚合物系统。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由农业部共同筹资的捷克共和国(批准号QJ1310254)和教育部、青年和体育的捷克共和国(批准号LO1504)。Pavlina Holcapkova感谢Zlin托马斯巴塔大学的内部授权机构(IGA / CPS / 2017/005)。

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