鱼类胶原蛋白促进基因的表达与成骨细胞的活动

文摘

罗非鱼I型atelocollagen (TAC)是一个强有力的候选人为临床应用其生物支架由于变性温度高和生物安全属性。本研究的目的是为了确认TAC的生物效应在体外对成骨细胞的细胞,模拟其临床应用。增殖和分化的典型preosteoblasts MC3T3-E1细胞,研究了使用微阵列分析,为矿化染色试验,实时PCR分析mineralization-related基因的表达。10基因的mRNA表达参与增殖和分化后增加三天文化TAC凝胶,平均得分比超过1.5相比,控制平衡。文化的两周后,这三个实验小组显示较强的碱性磷酸酶染色比后一个星期。的基因表达碱性磷酸酶、骨钙素和骨涎蛋白在实验条件下增加。骨桥蛋白基因表达的没有增加,无统计差异被发现在三个实验小组。现在和以前的研究结果表明,TAC不仅是一个合适的替代胶原蛋白产品来自哺乳动物也是小说再生医学生物材料与细胞分化的能力。

1。介绍

相同的天然生物材料的研究和开发将提高脚手架的安全性和载体在再生医学,这是有意义的和有益的,由于全球普遍存在的危险的传染病(人畜共患病)如牛海绵状脑病,禽流感和猪流感,tooth-and-mouth疾病牛、猪、和水牛,埃博拉出血热,Zika病毒发烧(1]。此外,胶原蛋白生成的猪和牛来源不能使用在一些国家由于宗教的反对。鱼,这是最遥远的亲戚从哺乳动物基因,最近关注作为替代来源的胶原蛋白。鱼类胶原蛋白(FC)的尺度,皮肤和骨感兴趣的许多实验室在世界范围内对其生物活性属性,如优良的生物相容性、低抗原性、高生物降解性和细胞增殖潜力(2,3]。

最薄弱的点鱼类胶原蛋白的变性温度相对较低(),这表明临床应用的稳定性差。然而,我们最近通过量热法显示实验胶原蛋白的解决方案来自热带鱼、罗非鱼(罗非鱼类型我atelocollagen (TAC)),是35-36°C (4),这表明已经完全克服上述弱点。此外,生物安全的TAC已经确认使用各种测试方法与ISO标准推荐(5]。柠檬酸在冷冻条件下的长期存储超过1年已经证明在我们实验室(未发表的数据)。这些数据和研究结果强烈支持TAC作为候选人临床应用生物支架。

在目前的实验中,我们证实了TAC的生物效应在体外对成骨细胞的细胞模拟其临床应用合适的替代品来自哺乳动物胶原蛋白产品。MC3T3-E1细胞的增殖和分化,这是典型的preosteoblasts,使用微阵列分析研究,为矿化染色试验,实时聚合酶链反应(rt - PCR)分析确定calcification-related基因的表达。

2。材料和方法

2.1。细胞培养的通道

使用MC3T3-E1细胞来自老鼠头顶是典型的preosteoblasts。他们在培养皿中100毫米1.5×10的密度⁶细胞αmem(美国Gibco,帕洛阿尔托,CA) 10%胎牛血清(的边后卫)(MP生物医学,圣安娜、钙、美国)和penicillin-streptomycin(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)然后孵化(6]。

2.2。TAC的解散

TAC(0.6%)产生的可溶性罗非鱼Nippi Inc .提供的皮肤Biomatrix研究所(日本茨城县)。在1.5倍浓度PBS稀释0.1% TAC方案(−)(pH值7.4)是用于生物实验。

2.3。微阵列的总RNA隔离

对于FC凝胶组,1毫升0.1% TAC是添加到60毫米培养皿。柠檬酸的解决方案是稠化在30分钟37°C的5%股份有限公司的一个条件₂和空气。MC3T3-E1细胞被播种在60毫米培养皿或不覆盖TAC凝胶密度为1.5×10⁶细胞。在为期3天的文化,从细胞总RNA是孤立使用试剂盒试剂(1毫升/ 10厘米²)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和纯化按照制造商的指示(6]。

2.4。微阵列基因表达的检测增殖和分化6]

cRNA放大和杂化是一个亲和力老鼠基因组430 2.0阵列(39000转录产品),由一个Affymetrix扫描仪扫描,计算使用Affymetrix表达式控制台™。

2.5。过滤器的标准数据分析(6]

然后,我们建立了标准调节基因(分数> 3.0,比> 1.5倍)。

2.6。rt - pcr芯片后

MC3T3-E1细胞被播种和培养(对于FC组,对照组)在同等条件下作为微阵列实验的总RNA隔离。引物所示表1。rt - pcr分析是根据类似的方法来进行我们的最近的研究(6),除了以下两个步骤。第一个是放大的协议和量化40周期(58-59°C, 1分钟)。第二个是,在最后的计算,数据规范化的核糖体蛋白肌力。

2.7。碱性磷酸酶(ALP)染色

FC凝胶组织,90年μL 0.1%的TAC涌入每。柠檬酸的解决方案是在37°C稠化30分钟的氛围中5%的股份有限公司₂和空气。在24-well MC3T3-E1细胞培养板的密度5×10⁴细胞/孵化1或2周。下列四组(井为每个组和每周)是用于比较:(1)对照组(培养基:αmem的边后卫),(2)FC-positive集团(培养基:αmem的边后卫),(3)FC-negative和BGP-positive组培养基:αmem补充的边后卫,50μ和光,g / mL抗坏血酸(kouichi有限公司,大阪,日本),和10毫米β甘油磷酸酯([东方]nakarai tesque,京都,日本)},(4)FC-positive BGP-positive集团(培养基:αmem的边后卫,50μg / mL抗坏血酸,和10毫米边界网关协议)。媒介是每三天更新。高山染色工具包(Stemgent Inc .,剑桥,妈,美国)是用于染色高山表达式按照制造商的指示。

2.8。rt - pcr Calcification-Related基因

FC凝胶组,1毫升0.1% TAC是添加到60毫米培养皿。柠檬酸的解决方案是稠化在30分钟37°C的5%股份有限公司的一个条件₂和空气。MC3T3-E1细胞被播种在60毫米培养皿或不覆盖TAC凝胶密度为1.5×10⁶细胞。上述四组也准备这个实验(为每个组)。经过三天的文化,rt - pcr应用于检查四个calcification-related基因的表达:高山,骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)。所有的方法与上述方法类似。这些基因的引物设计表来表示2。

2.9。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。统计学意义()之间的区别这两种不同实验小组使用成对的学生的证明以及。

3所示。结果

3.1。增殖和分化的基因表达

微量分析显示72的调节基因(分数> 3.0)。以下10个基因与成骨细胞的增殖和分化有关的细胞相比,控制使用rt - pcr:维生素D受体(Vdr) lumican(亮度),矩阵metallopeptidase 13 (Mmp13) SMAD家庭成员6 (Smad6),血小板源生长因子D (Pdgfd), Wnt抑制因子1 (Wif1),纤维母细胞生长因子受体3 (Fgfr3) septin 4 (Sept4)受体(降钙素)活动修改蛋白1 (Ramp1)和chordin-like 1 (Chrdl1)(表3)。rt - pcr分析显示,这10个基因的mRNA表达也增加了为期3天的文化FC凝胶后,平均平衡分数比超过1.5相比控制(图1)。

3.2。碱性磷酸酶染色(图2)

组(1)后2周的文化,very-weak-intensity高山染色观察,类似于集团(2)后1周。经过2周的文化,每组染色显示强于后1周。总的来说,spindle-like形状观察组(3)和(4)(数据2(c),2(g)2(d),2(h))。染色的强度增加而增加组数字组(2)组(4)。

3.3。基因表达的钙化

rt - pcr分析表明,四个calcification-related基因的mRNA表达三个实验小组分析了为期3天的文化后,与对照组相比(1)(图3)。尽管高山的基因表达、OCN和BSP增加而增加组数字组(2)组(4),显著增加在BSP公认的基因表达()。OPN表达的原始数据OPN在三组约1.0,虽然之间有显著增加(2)和(3)组()。

4所示。讨论

细胞培养方法使用最先报道了I型胶原凝胶Elsdale和吟游诗人7]。细胞良好生长在一个三维(3 d)结构的条件更接近于在活的有机体内成骨细胞的条件比传统的二维(2 d)文化。细胞增长3 d凝胶显示积极的矿物染色和诱导成骨细胞的标记基因比细胞生长在2 d文化8]。虽然目前文化条件是不精确的3 d凝胶系统,目前的环境非常类似于3 d文化环境,作为低浓度的柠檬酸溶液是稠化模拟湿和弹性条件(9]。

为检查基因微阵列和rt - pcr分析表明MC3T3-E1细胞增殖和分化分数数据上使用标准差的影响提出了FC MC3T3-E1细胞比原来的更清楚比的结果。十个基因,包括分泌Wif1调制器Wnt蛋白质(10),增加表达式而控制条件。这个数据第一次揭示FC直接加速MC3T3-E1细胞的活动,以维持preosteoblast性质。

在目前的实验中,MC3T3-E1细胞的功能是加速在FC-positive或BGP-positive组为期三天的文化后,也证实了calcification-related基因的表达的增加,OCN除外。高山是早期表达成骨细胞增殖所必需的标志(11),也证明了现在的高山染色结果和典型的细胞形状的变化。此外,之间的时间流逝mRNA表达(3天)和蛋白质合成(7天)似乎是合理的。尽管OCN OPN和BSP通常用作成骨细胞分化标记(11- - - - - -13),OPN也报道作为矿化剂调节晶体生长(14,15]。目前PCR OPN的数据清楚地表明OPN的监测功能。

尽管细胞内信号转导通路和成骨细胞分化相关基因表达被广泛研究[16- - - - - -22),成骨细胞增殖和分化的直接触发机制胶原蛋白尚未阐明。最近,一个有趣的研究显示,人类间充质干细胞对罗非鱼胶原蛋白的粘附在体外是更快,高于猪胶原蛋白或noncoated表面,可能由于纹理的灵活性和表面柔软的罗非鱼胶原蛋白,胶原蛋白之间的绑定和整合素容易触发和刺激增殖和分化preosteoblasts [23]。TAC 0.1%解决方案是用来制造一种凝胶在当下FC组。这种凝胶的性质很软,甚至2周后的有限公司₂孵化器,被认为是拥有足够的灵活性和表面柔软。这意味着培养细胞也可能像他们会在3 d的文化系统。

适当的生物降解和适合生物材料的生物相容性是不可或缺的。胶原蛋白的生物降解和依赖宪法密切相关的氨基酸在一个给定的物种。牛胶原蛋白相比,蛋氨酸的内容,异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸羟赖氨酸,较低在TAC (24]。随着这些氨基酸胶原蛋白相关刚度、罗非鱼胶原蛋白很容易退化在活的有机体内。这些氨基酸的特点给TAC其上述性质。

从我们之前的数据4,5),目前的结果,不仅TAC可能代表一个有前途的替代哺乳动物和鸟类的胶原蛋白产品也是一种新型生物材料与细胞分化的能力。TAC的最终目标是其临床应用脚手架在再生医学。atelotreatment的酶消化时间和消除酶TAC控制临床水平(个人沟通)。初步的实验数据对纸浆再生(24)使用TAC作为支架并没有发现排斥反应新再生纸浆组织狗(未发表的数据)。这些发现表明,TAC后可以用于临床应用进一步的动物实验。

5。结论

目前的在体外实验使用造骨细胞明显表明TAC胶原蛋白不仅是一个合适的替代产品来自哺乳动物细胞增殖和分化再生医学的脚手架。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突与本研究协会。

作者的贡献

马克Luigi Fabian Capati和Ayako Nakazono贡献同样这项工作。

确认

本研究支持部分资金用于促进社会体制改革和研究和综合发展,合同授予赞助:教育部、科学、体育、和日本的文化。

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