文摘
本研究的目的是为了提高生物聚合物载体的机械稳定性和细胞生存能力和发酵过程中添加壳聚糖涂层产品存储。乳制品起动文化(1% (w / v))在乳清和与海藻酸钠混合溶液稀释和珠子是用挤压技术。涂层的机械稳定性和裸露的珠子,释放行为和封装的可行性益生菌乳制品发酵乳清饮料起动文化进行了分析。珠子的力学性能测定力-位移和工程根据压缩测试后获得的应力-应变曲线。是观察到的壳聚糖作为涂层珠子以及发酵过程增加了弹性模量的钙alginate-whey珠子和细胞生存。目前的研究显示,涂层不显著提高益生菌在发酵的可行性,但一个重要的影响在存储保护承运人的力量。我们的研究结果表明,whey-based衬底有积极影响的机械稳定性与封装益生菌生物高聚物珠子。
1。介绍
益生菌已被纳入各种乳制品和口头管理以各种形式,如食品、胶囊和药片。乳制品的好处是,这些产品添加益生菌,增强了它们的功能(1]。益生菌细胞的生存能力是非常重要的,因为他们的许多健康的好处但是所需数量的可行的细菌是难以实现其数量减少会影响的处理、存储和胃肠道的条件。益生菌生存能力差在酸奶和发酵的牛奶不会容忍暴露在高酸性的和充气媒体(2]。为益生菌活细胞提供一个物理屏障来抵抗不利环境条件是一种方法目前收到相当大的关注作为"益生菌"产品的可接受的系统可以实现(3- - - - - -5]。封装是一种有价值的方法,已被用于食品行业增加益生菌的可行性和稳定性对不利环境条件在处理和存储(6- - - - - -9]。多糖,如海藻酸,壳聚糖,结冷胶,κ角叉菜胶,是最常用的封装材料的益生菌(10- - - - - -13]。海藻酸是一个线性多糖组成的-D-mannuronic和-L-guluronic酸,用于封装的益生菌,蛋白质,抗氧化剂,茶多酚、维生素(14,15]。一些作者报道,海藻酸的机械和化学稳定性珠子可以改善通过使用不同的涂层材料,旁边的保护可以使细菌释放更大的控制和改进封装益生菌生物的生存能力12,16,17]。阳离子(1 - 4)2-amino-2-deoxy -壳聚糖-D-glucan,工业生产从海洋和真菌几丁质被用于食品行业。这种材料是生物可降解,生物相容性、无毒。由于它的成膜特性,壳聚糖用于益生菌和益生元的封装,芳香族化合物,酶和抗氧化剂18- - - - - -20.]。它具有高模量沿断裂伸长率较低但混合或共聚作用与不同的聚合物壳聚糖可以影响其形态和可塑性21]。
在最近的研究中,生物聚合物的结构性质不同成分进行测试的珠子。这些结果表明,机械响应变形的差异存在,因为不同的生物聚合物之间的交联反应网络(22]。
结构和物理性质,以及运营商的截留效率,极大地影响了生物聚合物浓度和总就业比率两个生物聚合物(23- - - - - -25]。
本研究的目的是评估准备的珠子的机械性能从海藻酸钠溶液含有乳清溶液与益生菌细胞与壳聚糖涂层挤压过程后形成的。细胞生存在准备过程也被调查。发酵培养基对细胞活力的影响,机械强度和弹性模量的生物聚合物载体存储时间之前和期间,还研究了使用万能试验机(AG-Xplus)。
2。材料和方法
2.1。材料
商用海藻酸钠粉(介质粘度)从褐藻(西格玛奥德里奇,美国)是用于生产的珠子。mannuronic 61%和39%的海藻酸由古罗糖醛酸的M / G比1.56。低分子量壳聚糖(美国穿越有机物)用作涂层材料。氯化钙CaCl2二水物(美国穿越有机物)用作胶凝阳离子。乳清和牛奶是来自国内乳制品工厂Imlek d.o.o。(贝尔格莱德,塞尔维亚)。乳清是总固体的化学成分% (w / v);蛋白质% (w / v);脂肪% (w / v);和乳糖% (w / v)。乳清发酵前的pH值为6.4。牛奶的化学成分是脂肪0.5% (w / v);蛋白质3.1% (w / v);碳水化合物4.7% (w / v);和钙0.12% (w / v)。乳清和牛奶巴氏杀菌在60°C 60分钟,冷却到室温。
2.2。细胞培养的准备
冷冻奶制品起动文化称为“Lactoferm偿- 6”(包含唾液链球菌ssp。酸奶,乳酸菌delbrueckiissp。发酵剂,保加利亚嗜酸乳杆菌和双歧杆菌bifidum学生物化学)是由S.R.L. (Monterotondo、罗马、意大利)。对于所有实验,cell-whey悬架是由溶解1.0% (w / v)的冰冻的起动文化乳清。
2.3。封装的益生菌
2.3.1。制备的珠子
海藻酸钠悬浮液混合cell-whey悬挂在比1:1 (v / v)。海藻酸盐珠是由挤压alginate-cell悬挂到2.0% (w / v)的氯化钙使用注射泵(Racel、科学仪器、斯坦福、CT、美国)。Alginate-cell悬挂含有1.70% (w / v)海藻酸钠。Ca-alginate珠子是在获得收集距离钝不锈钢针尖端之间的3厘米(18个指标)和氯化钙的解决方案。集合后,珠被允许为30分钟变硬。珠被过滤分离,转移到无菌培养皿中,和存储C在0.2% (w / v)酵母提取物溶液(26]。
2.3.2。涂层与壳聚糖海藻酸珠子
壳聚糖和海藻酸钠的解决方案准备根据周等人的方法。27]。珠子与壳聚糖涂层的准备如下:海藻酸珠子都沉浸在100毫升的壳聚糖溶液(4 g L−1在100 rpm),动摇了轨道振动器为涂料,40分钟,用无菌水冲洗去除多余的壳聚糖。所有步骤都是在无菌条件下进行。
2.4。发酵
在100毫升厄伦美厄烧瓶实验包含50毫升的介质(巴氏杀菌牛奶乳清和30% 70%)。基于初步实验(数据未显示)30%的牛奶是用于饮料配方浓度适合感官质量改进。样本接种通过添加6% (w / v)的封装起动文化。发酵实现在42°C。在孵化期间,采集标本每2 h pH值的测定。进行发酵,直到pH值4.6被快速冷却达到和停止。发酵后,样本存储C 21天来确定细胞的生存能力和机械稳定性的珠子。
2.5。在发酵细胞释放
海藻酸浓度的影响和壳聚糖的封装效率是由决心活细胞计数(日志CFU毫升−1)和细胞释放的珠子。准备珠子(1 g)溶解在无菌柠檬酸钠溶液(2.0% (w / v))轻轻摇晃在室温下为5分钟。细胞释放的决定基于商很多免费的细胞在发酵培养基(CFU毫升−1)和自由的总数(CFU毫升−1)和封装细胞(CFU g−1),提出了在文献[26]。
2.6。分析方法
2.6.1。枚举的封装益生菌
细胞生存能力的定量测量,有必要液化珠子和释放封装益生菌细胞。珠子被溶解在无菌柠檬酸钠溶液(2.0% (w / v))在室温下轻轻摇晃。的数量美国酸奶细胞是由M17琼脂上倾注平皿计数法。可行的细胞的数量l .发酵剂,保加利亚l .嗜酸的和b . bifidum由倾注平皿计数法在琼脂夫人(28]。结果提出了可行的细胞总数的衬底(M17星云和夫人)和细胞数量表达日志(CFU毫升−1免费)细胞和日志(CFU g−1对封装细胞)。
2.6.2。光学显微镜
珠子的形状和骨料的存在是使用光学显微镜检查后封装过程。随机选择湿珠子的直径测量蒸馏水通过光学显微镜(英国卡尔蔡司显微镜GmbH)使用放大的5×10。平均直径为30珠子的测量计算。
2.6.3。扫描电子显微镜
扫描电子显微镜(SEM)是用于分析的形态学Ca-alginate珠子的方法Stojkovska et al。29日]。样本固定在试样夹和可视化使用TESCAN MIRA3 XMU SEM (USA Inc .,蔓越莓Twp, PA,美国),在20岁的凯文。
2.6.4。珠子的机械性能
压缩测试单珠子淹没在蒸馏水进行使用万能试验机,AG-Xplus(日本岛津公司、日本),配备了100 N力负载细胞(力范围从0.01到100 N)。压缩了30%样品变形(位移比初始珠直径)的压缩速度1毫米/分钟和环境温度C根据以前的工作中描述的方法(30.]。压缩试验期间,一个培养皿中珠被淹没在蒸馏水和放置在一个平板。板之间的距离(直径50毫米)位置在给定变形和板与珠子的第一次接触测量。三十个珠子从每个样本被压缩和自动检测板之间的接触和珠进行了接触力为0.1 N在相同的条件下。弹性模量的值和最大力量确定使用力-位移和工程应力-应变曲线(剩下的文本中,应力-应变曲线)。
2.6.5。傅里叶变换红外光谱(FTIR)
红外光谱分析了海藻酸冻干珠子发酵前后的波数地区的4000 - 400厘米−1。红外光谱被用来验证化学海藻酸之间的相互作用和发酵培养基(红外光谱分光计Bomem MB,系列哈特曼和布劳恩)。
2.6.6。统计分析
实验进行了一式三份。所有的值表示为平均值±标准偏差。的意思是用单向方差分析值进行了分析。的图基事后测试手段进行了比较(起源Pro 8(1991 - 2007)电脑包;美国马起源实验室有限公司北安普顿]。数据被认为是明显不同的。珠子的平均值的力学性能测定使用设备软件,TRAPEZIUMX 1.13。
3所示。结果与讨论
3.1。珠子的大小、形状和形态
形成的平均直径Ca-alginate珠子毫米。珠子的形状没有改变和添加壳聚糖的平均大小的珠子涂层嗯,如图1。
(一)
(b)
从横截面的扫描电镜图像的样本,封装杆状和球形细菌及其绑定在承运人可以看到。益生菌被随机分组和放置在航空公司的空腔,如图2。
空白空间,记录周围的细菌在这项研究中也有类似的空间记录下Sathyabama et al。31日在SEM显微图的益生菌菌株,即葡萄球菌succinus(MAbB4)和肠球菌都有效海藻酸(FIdM3)封装在球体。基于观察到的显微图,它可以是说海藻酸凝胶化过程的珠子是中断尤其是在细菌周围地区。
3.2。影响涂层的封装益生菌细胞的可行性
初始可行的细胞数量(日志CFU g−1裸珠子和(日志CFU g−1海藻酸)涂布珠子。在发酵期间,可行的珠子没有壳聚糖的细胞的数量增加了0.79在珠子与壳聚糖他们增加了0.88(日志CFU g−1)记录单位和达到的值(日志CFU g−1),(日志CFU g−1),分别。基于这些结果,可以得出结论:添加壳聚糖没有显著影响细胞的生存能力在发酵。
此外,比较涂层和裸藻朊酸盐珠子,观察细胞释放的显著差异。细胞的数量从裸珠释放到发酵培养基%,而略低电池泄漏%都观察涂以壳聚糖海藻酸珠子。这可以用这一事实来解释,在发酵期间,壳聚糖海藻酸羧化物组和铵团体之间的静电相互作用导致细胞释放的抑制(32,33]。根据获得的结果,它可以表示,壳聚糖作为外套细胞减少渗漏和增强保留珠内的细胞。壳聚糖涂层的影响封装益生菌发酵活动和生存的细胞在模拟胃肠环境是我们之前工作的主题34]。根据结果提出摘要提到chitosan-coated珠子与海藻酸益生菌活细胞数高于样品珠子发酵后,特别是在模拟胃液条件下在pH值为3.0和2.5。Chavarri et al。35)也报道,壳聚糖涂层提供了更好的保护益生菌相比,裸露的微胶囊。
在这项研究中,涂层的影响细胞的生存能力在存储也被考虑在内。如图3,壳聚糖涂层提高了存储期间封装益生菌的生存能力。21天之后,发现,海藻酸chitosan-coated珠子,更多的细菌存活与那些裸珠相比,这表明涂层提高益生菌菌株的生存能力。这些发现与之前的协议结果封装的益生菌菌株l .杆菌与壳聚糖海藻酸珠子涂层(12]。因此,壳聚糖涂层没有不利影响在发酵过程中细菌的生长,但在存储刺激他们的生存。
3.3。影响发酵过程的化学结构的海藻酸珠子
红外光谱分析的结果和特征乐队的位置如图所示4。乐队在3370.2厘米−1对应于伸展振动与nh -哦2。乐队在1411.5厘米−1(与不对称COO-stretching振动)后成为更广泛的交互的珠子与发酵培养基(36]。结果显示峰值的变化前后的氨基和羧基组发酵,这表明离子之间的相互作用的羰基化合物海藻酸和氨基酸的蛋白质组。水凝胶是潜在吸收离子的介质中(37]。Ca的扩散2 +海藻酸进入网络是证实了这种转变。和C-O-H低频振动;此外,光谱变化的地区COO-antisymmetric和对称伸缩振动发生。乐队在1400厘米−1和1000厘米−1对应。,c, c组(38]。
3.4。发酵过程的影响,涂料,贮存时间的机械稳定性珠子
机械强度和弹性模量的运营商与益生菌细胞测定的目标定义的机械稳定性运营商可以为他们的进一步应用的意义。藻酸盐凝胶的粘弹性性质所评估迄今为止使用静态或动态压缩试验(24,39- - - - - -42]。测量的原理是对珠子的压缩应变和相应测量力和由此产生的压力。
结果显示在图5可以看到,添加乳清与益生菌细胞的海藻酸钠溶液导致稳定运营商和力值增加。在此基础上观察,它可以表示,牛奶和乳清的钙离子和蛋白质有一个额外的对运营商的稳定性的影响。这种效应可以解释为乳清蛋白质形成凝胶的能力在Ca2 +离子。这种类型的凝胶,从而从一个二聚的古罗糖醛酸协会的地区2 +“蛋盒”形成,类似于海藻酸凝胶(15,43]。pH值也是一个重要因素在发酵和机械稳定性有影响的珠子。牛奶和乳清中的蛋白质是pH值依赖、提高凝胶化过程中pH值范围4日盘中,544]。比较的结果迫使发酵前后,可以得出的结论是,海藻酸的发酵过程增加了强度珠子。
(一)
(b)
弹性模量的珠子使用最小二乘回归斜率的计算应力和应变的情节压缩测试数据。由此产生的力-位移数据对转换成相应的应力、应变值,基于初始珠直径。曲线拟合的力-位移和应力-应变试验数据和质量合适()如图5。由于海藻酸颗粒粘弹性,山坡上的切线弹性部分发酵前后的应力-应变曲线用于模量的测定。弹性部分的应力-应变曲线(大部分来自10%到20%应变)选择根据测试压缩后恢复程度和弹性极限研究文献数据(23,42]。Ca-alginate近似大小的珠子mm被用于压缩测试,因为比较与珠子涂布壳聚糖的可能性。
弹性模量的值获得的藻酸盐珠在发酵前(N)略高于珠子制成的藻酸钙不添加cell-whey悬挂(N)。然而,结果陈藻酸钙珠子报道的弹性模量et al。42)明显高于相比,在这个研究的结果。这两项研究的主要区别是压缩速度在化验使用。王等人。40]证明了压缩速度影响海藻酸模量珠子因为湿藻朊酸盐珠一般都认为是粘弹性和液体可能会失去在压缩。藻酸钙珠子的模数值(由介质粘度海藻酸没有添加cell-whey悬挂,M / G比1.56)获得30%样品变形结果有很好的一致性报告Ouwerx et al。24]。从显示的力-位移曲线如图5,它可以注意到壳聚糖涂层的存在降低了海藻酸之间的交互和发酵培养基导致减少涂层测量力的珠子后发酵过程相比,裸珠。弹性模量的结果如图的珠子6表明,涂层和发酵珠子的模量增加。
珠子的机械稳定性是很重要的在存储以假设的质量和保质期发酵饮料。从图7可以看到,它的最大力量海藻酸珠子增加在第一个24小时,因为它们直接接触2 +从发酵培养基离子。最大力量高藻朊酸盐珠子的第七天存储相比,涂层珠的力量。1天之后,海藻酸强度开始下降,这一趋势一直持续到结束的存储。另一方面,chitosan-coated珠的力量增加了第七天开始减少因为密集的细胞增长的材料的空腔和侵蚀的珠网络。根据结果,壳聚糖作为涂层材料强度的保护做出了重要贡献,承运人在存储。
4所示。结论
益生菌起动文化成功地封装在裸露的海藻酸和涂布珠子由挤压方法。目前的研究表明,发酵过程改进的生物聚合物的机械稳定性珠子因为钙离子的存在和蛋白质的牛奶和乳清发酵培养基。根据所得结果,壳聚糖涂层的存在提高了载体强度在存储。壳聚糖使细菌从外部环境的物理隔离,减少细胞释放在发酵。结果还表明,发酵提高最大力量与刚刚相比裸珠了益生菌细胞(发酵前)和延长产品的货架寿命。我们得出结论,whey-based发酵培养基有积极影响的稳定材料封装的益生菌,这是一个非常重要的发现为未来的应用whey-based发酵培养基结合生物聚合物珠为发酵饮料的生产。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者欣然承认教育部的支持,科学和技术发展的塞尔维亚共和国通过第三项目46010和174004。此外,作者想给特别感谢日本岛津公司分支贝尔格莱德(日本岛津公司公司(日本)的技术支持在实验和玛雅Vukašinović-Sekulić时,博士,副教授,贝尔格莱德大学教师的技术和冶金、光学显微镜的照片,以及Đordje Veljović,博士,扫描电镜测量。