文摘
大豆蛋白的使用对于年轻的单胃的动物限制是由于潜在的过敏原和高分子量。真菌发酵大豆蛋白影响的调查已经中断了基质消毒。维及霉素为0.05%添加在一起米曲霉固态发酵(SSF)在未杀菌的豆粕(SM)。相比答:oryzae社保基金,维及霉素没有造成真菌发酵的干扰,但阐明蛋白质退化。sds - page结果显示α和α′的子单元β-conglycinin显著退化。此外,免疫印迹结果表明,大豆蛋白的免疫反应性的信号是大大减少与未杀菌的SM virginiamycin-added发酵。此外,真菌发酵总蛋白质和必需氨基酸含量增加,表明SM产品的价值提升。综上所述,本研究首次证明维及霉素可以帮助调查对热敏性大豆蛋白发酵效果。发酵SM在饲料行业有几个潜在的应用。
1。介绍
豆粕(SM)是主要的蛋白质来源单胃的动物在美国(1]。但其纳入新断奶猪是有限的,因为一些营养因子和大豆抗原蛋白引起超敏反应(2]。迄今为止,34个大豆蛋白质已经被确认为过敏原(3]。所有三个部分β-conglycinin,酸性和大豆球蛋白的基本单元,意思是已经被确认为主要过敏原幼猪(3- - - - - -5]。一些研究表明,大豆抗原蛋白如纯大豆球蛋白或整合β-conglycinin的饮食会导致体重增加和饲料效率的降低以及增加猪腹泻的发生率[4]。此外,SM包含大型分子大小难以消化的蛋白质,因为许多消化的酶,如胃蛋白酶和胰蛋白酶不能执行他们的整个功能,直到小猪[3周的年龄4]。
发酵已经应用于改善大豆蛋白免疫和降解蛋白质分子的大小。歌等。6发现自然发酵,酿酒酵母,芽孢杆菌lactis发酵的SM减少80%,77%,和77%的免疫反应使用97.5夸/ l人血浆时,分别。Amnuaycheewa和de Mejia7]分析了profilin发酵豆制品。减少在profilin纳豆发酵芽孢杆菌纳豆酱12.8%到35.4%和12.8%到46.3%,相比,大豆面粉。至于SM免疫力,真菌发酵影响的研究是有限的。Frias et al。5)发现,米曲霉或根霉oryzae固态发酵生产减少68%或66%的豆粕的免疫反应性,分别。但两次发酵使用121°C前后15分钟消毒。因为高温可以变性蛋白(8)和降低其免疫(3),它不能说明是由发酵的演绎免疫力。真菌固态发酵的SM已经应用于增强SM作为单胃的动物饲料的营养价值9]。动物试验已经发现,喂食发酵SM (FSM)可以降低仔猪的免疫反应对大豆蛋白(10]。然而,与不同的起源有不同的酶水解效果(11]。需要找到合适的方法来研究一个特定的真菌固态发酵是否以及如何影响大豆蛋白的免疫反应性。
维及霉素是一种常用抗生素在饲料行业(12]。也被用于生产乙醇在发酵过程中防止污染(13]。在我们的研究中,我们应用维及霉素抑制细菌增长答:oryzae固态发酵在未经消毒的SMV。此外,我们展示了一个方法来执行未杀菌的条件下发酵,因此明显调查退化和免疫反应性减少热敏性大豆蛋白分子。
2。材料和方法
2.1。微生物文化
冻干的文化答:oryzae(写明ATCC 9362)从美国获得类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),重新在马铃薯葡萄糖肉汤两次。复苏后,文化是接种马铃薯葡萄糖(PDA)倾斜,孵化为7天30°C,然后储存在4°C的短期保存。常规实验,孢子的解决方案是使用。孢子收集从偏轻轻洗渐变为0.1% 80年获得大约10孢子悬浮液7孢子/毫升。此外,孢子悬浮在15%甘油和存储1毫升整除−80°C的长期保存。
2.2。衬底制备、发酵
SM是获得ADM联盟营养(阿比林,KS)。固态发酵进行了三种不同的基质,这是原始的SM与维及霉素,SM在100°C热压处理过的30分钟(SM100C),在121°C和SM热压处理过的15分钟(SM121C)。相应的发酵产品被认为是SMV SM100, SM121。SMV、维及霉素0.05%的比例添加了SM的干物质基础,基于我们的初步实验结果。4毫升的答:oryzae孢子的解决方案包含107孢子接种到20克/毫升衬底。水分是高压釜前调整。水分由接种被认为是。和最终的水分是50%。烧瓶孵化在35°C 36小时。发酵样品然后冻干和用于分析。
2.3。大豆蛋白样品制备
冻干FSM和迫击炮和杵磨成面粉。SM面粉是分散在蒸馏水的比率1:10。混合酸碱被调整至8.2使用2 N氢氧化钠。摇晃在室温下2小时后,混合物离心机在5000 rcf在4°C去除不溶性残渣。大豆蛋白在上层清液沉淀通过调整pH值4.8的上层清液的pH值。
2.4。差示扫描量热计(DSC)
大豆蛋白质的变性与差示扫描量热计(DSC)评估(DSC7,优秀的,诺沃克,CT)校准与铟和锌。湿大豆蛋白样品被密封在一个大型不锈钢锅概况。约10毫克大豆蛋白(dmb)与水分在60%左右。样本扫描从10到150°C的加热速度10°C /分钟。变性温度(从峰值温度)测定。变性焓变(H)计算领域的变性峰值。
2.5。sds - page
的湿蛋白质沉淀用蒸馏水稀释调整pH值使用2 N氢氧化钠pH值8.2。蛋白质浓度测定和布拉德福德的方法。sds - page的大豆蛋白样品进行叠加凝胶4%和12%的分离胶。50毫克的大豆蛋白为每个样本被接种到凝胶。prestained标准分子量从8 kDa 250 kDa。电泳进行2小时的120 V。凝胶染色在0.1%的考马斯亮蓝r - 250和使退色包含10%醋酸和40%甲醇溶液。分析了微凝胶的柯达1 d图像分析软件,版本4.6(柯达,罗彻斯特,纽约)。
2.6。与人血浆蛋白质印迹过程
免疫印迹的方法执行Frias et al。5与修改)。人血浆使用大豆IgE 10 PlasmaLab国际提供的夸/ L(埃弗雷特,佤邦)。转让后,膜是沾染了朱红色年代5分钟检查传输效果。朱红色年代然后用蒸馏水冲洗掉在继续下一步之前。饱和溶液,主要和次要抗体准备在tris-buffered盐水(TBS)而不是0.01%的渐变TBS (ttb)缓冲区,以避免在黑暗的背景。膜被暴露在柯达x射线胶片。
2.7。化学分析
农业试验站的直接成分分析化学实验室,密苏里大学(密苏里州哥伦比亚)使用以下方法:粗蛋白(采用AOAC公认的官方方法990.03,2006)14),粗脂肪(乙醚提取,采用AOAC公认的官方方法920.39 (A)) (14),粗纤维(采用AOAC公认的正式方法978.10,2006)(14)、酸性洗涤纤维(ADF)(采用AOAC公认的官方方法973.18(模拟),2006)(14],中性洗涤纤维(NDF) [14973.18),纤维素(采用AOAC公认的正式方法(模拟),2006)(14),胃蛋白酶消化率(971.09采用AOAC公认的正式方法,2006)14),氨基酸概要文件(采用AOAC公认的正式方法982.30 E (a, b, c), chp.45.3.05, 2006) (14),和可用赖氨酸(采用AOAC公认的正式方法975.22,chp.45.4.03, 2006) (14]。
3所示。结果
图1DSC结果显示大豆蛋白样品在不同预处理温度和相应的发酵产品。SM和SMV都有两个峰值,降解温度()在79°C和96°C。SM100C和SM100都有一个峰值温度在97°C。SM121C和SM121有一个看不见的峰值在97°C。
图2显示了豆粕的sds - page结果和样品不同的预处理。SM含有79%与分子量大于60000 kDa乐队,但SM100C只有4%的乐队,乐队SM121C只有6%的范围内。SMV、SM100 SM121,三个发酵样品,所有肽的分子量小于60000 kDa。所有发酵样品有2%的小肽分子量小于10000 kDa,控制未发酵的样品没有赋予。的α和α′子单元的SM SMV中没有显示,但和β-conglycinin不是SM100所示和SM121及其控制。
图3显示了朱红色年代染色膜的转移。比较图2,所有乐队在sds - page凝胶已被转移到膜。图4显示了immunodominant蛋白质与人类交流等离子体10夸/ L。SM呈现复杂蛋白质最高的概要文件和等离子体免疫反应性α- - -α′- (75 kDa)和β——(50 kDa) conglycinin子单元,意思是分数,和大豆球蛋白基本(30 kDa)和酸性(kDa 22日)亚基。其相应的发酵样品对SMV没有免疫反应性的蛋白质α- - -α(′)- 75 kDa conglycinin子单元。与SM相比,免疫反应信号β-conglycinin,意思是,酸性(kDa 22日)大豆球蛋白亚基SM100C很弱。没有明显的免疫反应性β-conglycinin SM100。SM121 SM121C和免疫反应性的蛋白质对基本(30 kDa)大豆球蛋白。
SM样品的成分变化如表所示1。热处理没有显著影响粗蛋白的含量,粗脂肪,粗纤维,总灰分、和胃蛋白酶消化率,但粗纤维的含量减少,酸性洗涤纤维、纤维素含量和增加了中性洗涤剂纤维。同时,热处理降低有效赖氨酸含量的内容。温度越高,越低赖氨酸含量的高温豆粕预处理。所有组件的内容增加发酵后,除了胃蛋白酶消化率下降的事实。发酵样品较高的热处理有更高的可用的赖氨酸。
氨基酸发酵样品内容如表所示2。热处理并没有显着影响的内容必需氨基酸,赖氨酸除外。发酵SM的总氨基酸含量增加,SM100C, SM121C 7%, 8%,和9%,分别。氨基酸发酵也增加了所有内容。温度越高,发酵样品的氨基酸含量越高。在SM121蛋氨酸、半胱氨酸和苏氨酸增加了11.4%,22.39%,和16.22%的发酵后,分别。赖氨酸和色氨酸SM121 SM121C相比,增加了13%和30%。
4所示。讨论
大豆蛋白质变性是一个吸热的过程(15),破裂造成的国际米兰和分子内的债券。其变性程度可以由DSC证明。Undenatured大豆蛋白有两个峰值的DSC曲线,代表两个主要大豆贮藏蛋白质,conglycinin和大豆球蛋白15]。大豆球蛋白比conglycinin(热稳定15]。的对大豆球蛋白的范围在96.3 - -97.7°C,而为conglycinin的范围在77.1 - -79.3°C(图1)。蛋白质变性是不可逆的过程15]。变性蛋白质不会在DSC图显示峰值。根据图1、蛋白质在SM和SMV nondenatured;7 s亚基在SM100C和SM100变性;在SM121C SM121 7单元完全变性而11年代子单元几乎完全变性。
sds - page是一种常见的方法来评估蛋白质分子的大小。但对于热处理样品,它不工作,根据我们的结果。大豆蛋白的变性7 s亚基是没有显示SM100C和SM121C车道。这并不意味着SM100C和SM121C少大分子量的蛋白质。蛋白质变性是次要的变化,三级和四级结构。热能输入中断弱者债券稳定天然构象,导致蛋白质展开[16]。变性的蛋白质可能形成大聚合(17),这可能成为不溶性,不会显示在sds - page。王等人。16]还显示,100°C加热20分钟导致损失的蛋白质SDS凝胶的乐队。添加维及霉素避免热预处理的豆粕。答:oryzae固态发酵可以降低大型成小肽的蛋白分子,如通过比较SM的分子量和SMV从图2。
约34子单元的大豆蛋白被认为是过敏原(3]。我们的结果也显示在SM免疫反应性的蛋白质的强烈信号。热处理可以影响过敏原构象抗原表位,降低其免疫反应性(18]。免疫印迹被用来说明蛋白质的免疫反应性。像sds - page,仍有问题引起的热诱导蛋白质变性。大豆蛋白亚基,β-conglycinin在SM121C SM100C SM121C和酸性大豆球蛋白,在免疫印迹不可见。这并不意味着他们没有免疫反应性,但他们并没有出现在SDS凝胶。维及霉素除了帮助研究发酵过程中大豆蛋白免疫反应性变化。SMV较弱的免疫反应性的信号,与SM相比,说明答:oryzae固态发酵可以减少免疫反应性的大豆蛋白。
自然发酵已被证明会降低大豆蛋白分子大小与nonheated样本(5]。在自然发酵,各种各样的微生物有关。不同蛋白酶的目标蛋白质亚基(19]。为了达到更好的降解,有必要调查特定微生物的发酵效果。维及霉素可以抑制细菌生长的培养液的真菌可以抑制其他污染真菌的生长,根据我们的研究结果。维及霉素还排除了热处理的必要性,这是有利于蛋白质的大小和免疫反应性调查。
答:oryzae分泌酸性和中性蛋白酶,这可能降低抗原表位(18]。根据我们的研究,答:oryzae发酵提供了手段,降低大豆蛋白分子大小,同时降低其免疫反应性的蛋白质。大豆蛋白与低分子量和弱或无免疫反应性的蛋白质已经被添加到新断奶仔猪的饮食喂养成本低(2]。发酵参数,如温度、湿度和发酵时间,需要优化最大化蛋白质降解和发酵豆制品生产低变应原的小猪。
酸性洗涤纤维主要包括纤维素和木质素。中性洗涤剂纤维主要包括半纤维素、纤维素和木质素。热处理可以降低木质素或催化纤维素和木质素和半纤维素之间的复杂结构形成与其他组件,如赖氨酸。赖氨酸是容易与其他化合物反应,还原糖等形式拉德化合物,导致可用赖氨酸的损失和减少营养价值。答:oryzae分泌的各种酶,如α淀粉酶、羧甲基纤维素酶、果胶裂解酶、蛋白酶、和endo- - - - - -β木聚糖酶(EC 3.2.1.8) [20.)帮助利用豆粕组件来满足经济增长的需求。所有组件的增强发酵主要是由于干物质造成损失答:oryzae消费,这集中的营养成分。适当的热量可以展开蛋白质结构,使蛋白质被蛋白酶更容易消化。胃蛋白酶消化率的降低可能是部分由蛋白质含量增加。
大豆蛋白富含赖氨酸和色氨酸但缺乏甲硫氨酸和苏氨酸,而谷类蛋白质。SM和玉米是主要成分为单胃的动物的饮食和提供补充氨基酸的概要文件。氨基酸的缺乏可能会降低饲料效率和采食量,导致体重下降,影响动物的生长性能(21]。答:oryzae固态发酵增强所有样品的氨基酸含量,特别是SM121。氨基酸的增加的一个原因是干物质损失,这已经说明了固态发酵(22]。第二个原因是蛋白质的水解蛋白酶分泌答:oryzae(22]。此外,增加的答:oryzae生物质可使氨基酸和蛋白质增加(22]。热处理可以暴露在肽债券和缓解酶法水解。适当的热处理可能受益随后的发酵过程。
答:oryzae固态发酵可以降低大大豆蛋白分子大小和大豆蛋白免疫反应性降低。答:oryzae蛋白酶有优先考虑α和α′的组件β-conglycinin。维及霉素的调查发酵降解大豆蛋白,通过避免加热的中断。发酵豆粕的营养价值,增强与更高的蛋白质含量。必需氨基酸含量也提高了发酵。适当的热处理促进发酵过程。附加值FSM比SM应该有一个更广阔的市场,特别是对刚断奶的小猪。
缩写
| 写明ATCC: | 美式文化收藏 |
| DSC: | 差示扫描量热法 |
| sds - page: | 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| ADF: | 酸性洗涤纤维 |
| NDF: | 中性洗涤剂纤维 |
| 采用AOAC公认的: | 协会的官方分析化学家 |
| SM: | 豆粕 |
| FSM: | 发酵豆粕 |
| SMV: | 与维及霉素发酵豆粕补充道 |
| SM100C: | 豆粕热压处理过的30分钟的100°C |
| SM100: | 发酵豆粕的热压处理过的30分钟的100°C |
| SM121C: | 豆粕热压处理过的15分钟的121°C |
| SM121: | 在121°C发酵豆粕的热压处理过的15分钟。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢盖durett系的生物化学博士,堪萨斯州立大学,帮助免疫印迹分析。作者感谢美国谷物科学与工业,堪萨斯州立大学,堪萨斯州大豆委员会资助这个项目。这是没有贡献。13 - 155 j从堪萨斯农业试验。