文摘
黄曲霉毒素与大豆11 s球蛋白共轭酸子单元和hapten-specific单克隆抗体(单克隆抗体)可交叉反应的四个主要黄曲霉毒素是通过使用间接竞争ELISA筛选过程。两种抗体(克隆1 B2和2 d3)也有类似的反应效率和黄曲霉毒素B1, B2, G1但显示G2的弱交叉反应。克隆4 c5表现出所有四个黄曲霉毒素的敏感性最高。的浓度黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2 50%抑制4 c5是1.1,1.2,2.1,和17.6 pg毫升−1。结果表明,大豆11 s球蛋白酸子单元是合适的小说运营商的黄曲霉毒素抗原免疫实验和克隆4 c5可以用于同时分析总黄曲霉毒素。
1。介绍
黄曲霉毒素是高度有毒和致癌物质,这是一组相关的结构产生的有毒代谢产物黄曲霉和曲霉属真菌寄生(1]。黄曲霉毒素的种类包括黄曲霉毒素B1、B2、G1, G2, M1。经常黄曲霉毒素污染范围广泛的食品和动物饲料。黄曲霉毒素B1 (AFB1)是最有毒的。这些发现黄曲霉毒素污染的饲料和食品供应在许多领域(2,3]。已报告的行之有效的方法分析各种食品系统的黄曲霉毒素,如近红外光谱(4),高效液相,液相色谱薄(5],immunoaffinity chromatography-performance液相色谱(6]。免疫测定方法,酶联免疫吸附试验(ELISA)非常适合快速、黄曲霉毒素检测的常规诊断应用程序(7]。这些方法有利于操作简单,设备的可移植性,牵手验证和可靠的大量样品的分析。
目前,传统的免疫原性载体用于ELISA牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA),锁眼坚守岗位的血蓝蛋白(KLH)。然而,当这些蛋白作为免疫原航空公司相应的抗体的亲和力是相对较弱的8]。此外,KLH和HSA也相对昂贵,并且不容易获得。本研究的目的是找到一个合适的蛋白BSA, KLH等。理想的载体应该有一个相对稳定的结构,水溶性强,无论是在任何有机溶剂的环境。大豆11 s球蛋白是一种非蛋白质的分子量范围从340 - 375 kDa [9)是由六酸单元(A1, A2, A3、A4、A5、A6)和六个碱性亚基(B1, B2, B3, B4, B5,和B6)。在本文中,我们报告一个方法中黄曲霉毒素与大豆11 s球蛋白共轭酸单元最初和泛型单克隆抗体的生产主要使用两步黄曲霉毒素筛选过程。生产所需的杂种细胞克隆的细节描述。
2。材料和方法
2.1。化学和仪器
牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA), (AFs)标准的黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2, M1, N-hydroxysuccinimide (NHS), 1 - (3-dimethylaminopropyl) 3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) tetramethylbenzidine(三甲),山羊anti-mouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶(IgG-HRP)和rpmi - 1640中谷酰胺和玫瑰(游离酸,283.3 g / L)从HyClone获得;次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(帽子),聚(乙二醇)(挂钩)1500,完全和不完全弗氏佐剂从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。鼠单克隆抗体同形像工具包是来自罗氏诊断公司(美国印第安纳波利斯)。SP2/0骨髓瘤细胞从中国购买类型文化中心集合(CCTCC)。96 -微量滴定板(Corning-Costar, 3590)和细胞培养板(6、24和96井)来自磐,日本。聚苯乙烯96 -微量滴定板被从配角(康宁,麻萨诸塞州,美国)。雌性Balb / c小鼠购自吉林省的疾病控制和预防中心。
450海里的吸光度检测通过使用光谱马克斯标(分子器件、美国)ELISA盘子洗了洗+和良好的吸光度测定微量滴定板的读者,这是由一个包含标准软件包方便软件的个人电脑。他们都是来自热电子有限公司(美国马)。荧光测量进行一个f - 4500分光光度计(日立、日本)配备了150 W氙灯和5纳米狭缝宽度的扫描速度和1.00厘米石英电池1200 nm分钟−1;数字水恒温器的温度控制。
2.2。制备大豆11 s球蛋白和大豆7 s球蛋白
大豆11 s球蛋白和大豆7 s球蛋白是孤立的一种新方法(10),这是一个修改程序的迪克等。
2.3。分离和纯化大豆11 s球蛋白酸子单元
1.5425 g德勤加入的溶液500毫升大豆11 s球蛋白(11毫克/毫升,PH值8.0)和动摇了1 h;然后蛋白质溶液被加热30分钟和离心分离的3倍(10000 r·分钟−1在4°C(20分钟)11]。冻干降水量的基本单元(BS),和冻干上层清液酸单元(作为)。酸亚基被sds - page鉴定模式。
2.4。的制备和表征黄曲霉毒素b1作为共轭
黄曲霉毒素B1首先转化为AFB1-O-carboxymethyloxime (AFB1-oxime)如前所述12]。结构表征AFB1-oxime是由NSI / MS(喷涂电压:2.8 kV,毛细管温度:270°C,毛细管电压:36 V,和透镜电压:115 V)。EDC-ester AFB1-AS配合准备的方法,避免不利的耦合活化试剂(DCC) (13]。短暂,2毫升溶液4.5毫克大豆11 s球蛋白酸子单元和50毫克EDC被添加到解决方案2.0毫克AFB1-oxime 2毫升干燥乙醇和最终的解决方案是动摇了48 h在室温下在一个封闭的小瓶。80毫升水中AFB1-oxime的解决方案是添加到230年2.0毫克的冰冷的解决方案μ6 h L耦合缓冲和动摇。轭合物的蛋白质(AFB1-AS)随后在交联葡聚糖提纯G-25列用PBS作为流动相(14]。AFB1-AS共轭特征使用紫外可见吸收分光光度计(uv - 2300, Techcomp)。
2.5。包被抗原的制备(AFB1-OVA)
AFB1-oxime与卵子结合,包被抗原(AFB1-OVA)准备。相同体积的甘油添加到AFB1-OVA解决方案,然后储存在透析后−30°C。
2.6。单克隆抗体的制备和表征
2.6.1。免疫接种
5周大的时候6雌性Balb / c小鼠皮下注射免疫与AFB1-AS轭合物在最初的免疫。初始剂量由50μ克AFB1-AS共轭腹腔内注射用弗氏完全佐剂和剩下的两个后续用弗氏不完全佐剂注射有间隔2周。每次注射后,抗血清收集从每个鼠标和化验的尾静脉anti-aflatoxin B1抗体(15)的间接竞争elisa (ciELISAs)与黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2的竞争对手。腹腔内增压给鼠标的抗血清反应表现出更好的大(CR)和更高的灵敏度与黄曲霉毒素细胞融合前3天。
2.6.2。细胞融合和筛选
一开始,SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞培养rpmi - 1640年媒体补充20%胎牛血清。进行细胞融合所描述的井斜et al。16]。骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞混合和离心机在5 - 10的比例:1。一毫升挂钩1500下降到细胞颗粒约1分钟37°C。之后的30毫升的rpmi - 1640约5分钟,细胞为5 - 10分钟。然后融合细胞与选择性半固体的混合媒体(RPMI 1640中补充了20% (v / v)胎牛血清(的边后卫),100年μ青霉素g / mL链霉素,100 U /毫升,1% (w / v)甲基纤维素、1% (v / v)消息灵通的,帽子,和2% (v / v)高果糖玉米糖浆)和镀6-well板(1.5毫升/)。板块进行杂种细胞的存在;然后文化上层清液从井里面有杂种细胞,化验后12天之后。只有那些杂种细胞保持吸收值选择进行进一步的选择,因为他们有很好的大黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2,与卵子没有大。根据标准方法做了一些调整,从每个感兴趣的细胞也被限制稀释,以确保subcloned monoclonality [15]。单克隆细胞菌株分泌的抗体筛选2 - 3限制稀释。根据冻结协议,30分钟在4°C,由此产生的杂种细胞克隆是低温贮藏和冷冻溶液中传播,在液氮罐气体一夜之间,然后储存在液氮(17]。
2.6.3。间接竞争ELISA筛选
间接竞争elisa中应用两步筛选过程。消除抗体和屏幕与卵巢反应积极的井,旁边AFB1-OVA(稀释1:250年涂料缓冲区),独自卵子(AFB1-OVA双重浓度)与AFB1-OVA间隔一行也涂板(100μ信用证)。间接竞争ELISA进行筛选克隆有好大,灵敏度高,四正从井中黄曲霉毒素18,19]。获得高亲和力抗体浓度梯度下降的四种黄曲霉毒素(添加浓度为100、50、20、10 ng毫升−1和相应的最终浓度是50,25岁,10 ng和5毫升−1resp)被用于第一筛查和以下两个或三个subclone后放映。
2.6.4。效价评估和同形像的决心
每一株杂种瘤细胞被注入三Balb / c小鼠。腹水液从这三个老鼠收集池,要么直接使用免疫测定(20.亲和色谱法)蛋白质A-sepharose列上。抗体效价被定义为最高的倒数腹水稀释使吸光度超过2.0倍的背景吸收的阴性血清的稀释21,22]。马伯抗体同形像进行商用ISO2-1装备从σ直接elisa。
2.6.5。评价抗体大和敏感
间接竞争ELISA格式(AFB1-OVA稀释1:1000年涂料缓冲区)被用来评估单克隆抗体的敏感性。大与黄曲霉毒素M1也执行,在主要的黄曲霉毒素。需要工作浓度、最佳稀释的抗体被定义为稀释了吸光度最接近1.0。这些数据被转换为抗体抑制,用%表示B/B0,B0是缺乏分析物和吸光度B是每个分析物浓度的吸光度23]。CR决心通过比较IC50值(分析物的浓度导致半峰抑制)为不同的黄曲霉毒素和计算CR (%) = (IC50 AFB1 / IC50分析物)×10024]。
3所示。结果与讨论
3.1。sds - page模式识别大豆11 s球蛋白酸子单元
包括m . Prestained蛋白质分子标记1、大豆11 s球蛋白标记2,大豆7 s球蛋白,标记3,大豆11 s球蛋白酸子单元,和标记4,大豆11 s球蛋白基本单元。大豆11 s球蛋白基本单元sds - page模式如图1。这一结果表明,大豆11 s球蛋白酸子单元成功做好准备。
3.2。电喷雾质谱AFB1-Oxime的识别
NSI /女士模式如图2。AFB1的相对分子质量是312.3的顶峰m / z408.06准分子离子峰羧甲基活化AFB1 - AFB1-O + Na +,符合产品C17H12O6应得的分子质量。的峰值m / z422.06可能的分子离子峰氮共轭AFB1的钠盐- [AFB1-O-N + Na] +;的顶峰m / z312.1 AFB1 quasi-ion峰值。结果可以初步得出结论,激活产品AFB1羧基activation-AFB1-oxime。
3.3。紫外可见吸收光谱图特征
紫外吸收光谱图AFB1-AS和大豆11 s球蛋白酸子单元如图3。的最大吸收AFB1-AS符合在290海里。这个结果表明AFB1-AS成功做好准备。
3.4。共振光散射光谱分析
荧光光谱分析AFB1-AS如图4在不同耦合比率。酸性的特征荧光峰子单元发生在350海里。AFB1的共轭酸单元不仅导致酸性亚基的荧光强度的降低,而且还导致了蓝移的最大发射波长从大约350到320纳米的耦合比率增加。
3.5。监测抗血清滴度和同形像的决心
AFB1-AS共轭诱导的所有六个Balb / c小鼠产生抗体hapten-specific初始免疫接种后12天。105天,4 6小鼠测试给高抗体滴度超过8000但呈现不同程度的反应能力和敏感性。1号、2号和4号老鼠先后选择细胞捐献者和随后用更高的灵敏度和更好的大融合实验。然后我们三个稳定的杂种细胞线注入Balb / c F1杂种小鼠和地位毫升腹水收集从每个鼠标。所有的三个职业专用单克隆抗体1 b2, 2 d3和4 c5与BSA免疫球蛋白类并没有大,卵子。同形像决心和滴定的结果如表所示1。
3.6。评价抗体大和敏感
大,灵敏度,提出了最小的三个单克隆抗体抑制值表2。如图5,图绘制为抑制百分比(B/B0)对毒素(pg mL的质量−1)。针对不同的单克隆抗体和黄曲霉毒素,与不同的毒素浓度梯度实验研究。抗体显示好大。变异系数在0.2%和8.8%之间,绝对吸光度(B0)在0.8和1.2之间的单位。两个单克隆抗体,1 B2和2 d3,类似的反应效率,B1, B2, G1,然而,显示与G2弱交叉反应。克隆4 c5亲和力最高四黄曲霉毒素,然后在3级分组。
三大与黄曲霉毒素单克隆抗体M1也执行。如图6、图形绘制抑制百分比(B/B0)对AFM1 (pg毫升−1),实验研究不同浓度梯度的黄曲霉毒素M1,针对不同的单克隆抗体。黄曲霉毒素的抗体显示好大M1。变异系数在0.5%和8.6%之间,绝对吸光度(B0)在0.8和1.2之间的单位。大,灵敏度,提出了最小的三个单克隆抗体抑制值表3。克隆4 c5显示最低的大,但表现出的灵敏度;接下来是1 b2和2 d3。比较的结果表明,克隆4 c5是最好的泛型单克隆抗体主要的黄曲霉毒素。
3.7。讨论
尽管程序已建立的生产aflatoxins-BSA /卵子轭合物和AFB1-BSA抗体/卵子,这项研究是第一个报道的黄曲霉毒素结合与其他运营商(如大豆11 s球蛋白酸子单元)和抗体反应灵敏度和大的评价。结果表明AFB1-AS共轭准备成功。大豆11 s球蛋白酸单元具有稳定的结构和水溶性强,这是共轭有机溶剂情况下与黄曲霉毒素的能力。AFB1-AS共轭可以诱导Balb / c小鼠产生hapten-specific抗体,这对所有四个黄曲霉毒素表现出最高的灵敏度。如今,大豆种子很便宜在中国和大豆11 s球蛋白酸单元可以轻易从脱脂大豆种子分离。我们的研究证明,大豆11 s球蛋白酸子单元是一个合适的载体AFB1-oxime免疫实验,可以表示为一个更便宜的替代传统的免疫原性运营商如BSA或卵子。
4所示。结论
这部小说AFB1-AS配合成功准备和三个通用的单克隆抗体建立了通过修改两步筛选过程总黄曲霉毒素的测定。克隆4 c5,表现出所有四种黄曲霉毒素敏感性最高,的浓度黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2, 50%抑制是1.1,1.2,2.1,和17.6 pg毫升−1,分别。结果表明,大豆11 s球蛋白酸单元适合黄曲霉毒素的小说运营商抗原在免疫实验和两步筛选法(间接竞争ELISA)被证明是优越尤其是代antihapten单克隆抗体。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作得到了安徽省教育振兴计划,“干细胞与转化医学”(Y05201374)和中国安徽省自然科学基金(批准号1508085 mh189);这些资金。