文摘

光动力疗法(PDT)是一种新型的和有前途的抗肿瘤治疗。我们以前的研究表明,亲水/亲脂性的利乐-α——(4-carboxyphenoxy)酞菁锌(TαPcZn)介导的PDT (TαPcZn-PDT)抑制人肝癌bel - 7402细胞的增殖通过触发凋亡细胞周期和逮捕。然而,T的机制αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡尚未完全阐明。在目前的研究中,因此,T的影响αPcZn-PDT在细胞凋亡、P38MAPK p-P38MAPK、Caspase-8 Caspase-3, bcl - 2,报价,细胞色素c,和bel - 7402细胞线粒体膜电位或与P38MAPK抑制剂SB203580 Caspase-8抑制剂Ac-IEFD-CHO被苏木精和伊红染色(他)调查分析,流式细胞术分析膜联蛋白V-FITC / propidium碘(PI)双重染色细胞和5 5′,6′6 -tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘(JC-1)和免疫印迹分析。我们发现TαPcZn-PDT导致细胞凋亡诱导、激活P38MAPK Caspase-8, Caspase-3,投标,downregulation的bcl - 2,从线粒体细胞色素c的释放,破坏线粒体膜电位的TαPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞。相比之下,SB203580或Ac-IEFD-CHO减毒诱导细胞凋亡,激活P38MAPK, Caspase-8, Caspase-3,投标,downregulation的bcl - 2,从线粒体细胞色素c的释放,破坏线粒体膜电位的TαPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞。综上所述,我们得出这样的结论:Caspase-3, bcl - 2,报价,和线粒体参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

1。介绍

光动力疗法(PDT),也被称为光化学疗法,是一种发展战略,已经显示出有前途的抗癌功效。它是基于photosensitizing药物的概念,当暴露在适当波长的光,能够导致光化学破坏肿瘤的产生活性氧(ROS),如单线态氧和自由基(1- - - - - -4]。与传统治疗方法相比,如手术和化疗,PDT的突出优点是它破坏肿瘤细胞有选择性地因为它可以公开光敏剂光和专门目标肿瘤组织中来激活它。

敏在PDT起到至关重要的作用。目前,尽管只有少数敏(temoporfin, talaporfin、verteporfin 5-aminolevulinic酸),批准用于抗肿瘤治疗,已经被证明是有效的在一个广泛的抗肿瘤谱,他们存在各种缺陷,促进更好的发展光敏剂候选人(5- - - - - -7]。酞菁,组成的一个平面macrocycle 18π电子系统中,是最潜在的光敏剂候选人之一,因为理想的电子吸收和物理属性(8- - - - - -10]。此外,酞菁与亲水/亲脂性的结构可能成为有前途的候选人selectivephotosensitizers因为亲水基团有利于药物在体内的运输,亲油基提高癌细胞对药物的吸收。积累的证据显示高度选择性生长抑制效果的亲水/亲脂性的phthalocyanines-mediated PDT在各种肿瘤细胞(11- - - - - -13]。

细胞凋亡,在开发和维护中扮演着关键角色的组织内稳态通过消除旧细胞,不必要的细胞,细胞和不健康的过程可能发生在多细胞生物的细胞程序性死亡。细胞凋亡的特征是形态学和生化变化包括染色质缩合,细胞收缩,细胞核和细胞质碎片,DNA碎片,膜气泡的形成和凋亡的身体。累积证据清楚地表明,细胞凋亡是一个关键途径phthalocyanines-PDT过程中(11- - - - - -13]。

P38增殖蛋白激酶(MAPK)是MAPK激酶家族的一员,对压力的反应刺激(电离辐射、紫外线照射、氧化应激、FAS配体,和细胞因子),参与细胞增殖、分化、凋亡和自噬。如今,P38MAPK一直在记录中发挥至关重要的监管作用phthalocyanines-PDT-induced凋亡的肿瘤细胞(14,15]。

还存在,半胱氨酸蛋白酶家族,中央监管机构的凋亡信号(16]。发起者Caspase-8 proapoptotic信号紧密耦合。一旦激活,Caspase-8劈开并激活下游效应器Caspase-3,乳沟导致形态和功能的变化与细胞凋亡相关(17]。如今,Caspase-8和Caspase-3记录中起到至关重要的监管作用phthalocyanines-PDT-induced细胞凋亡的肿瘤细胞(18- - - - - -21]。

细胞凋亡调节bcl - 2家族的进化相关的蛋白质。这些蛋白质控制线粒体外膜透化作用和组成proapoptotic(伯灵顿,出价,贝克等)和凋亡(bcl - 2、Bcl-XL Bcl-w,等等)的分子。最近的研究表明,诱导proapoptotic蛋白和凋亡抑制蛋白可能是由于phthalocyanines-PDT在肿瘤细胞的凋亡11,21,22]。

线粒体是一种membrane-enclosed细胞器发现在大多数真核细胞。细胞色素c是一个小的血红素蛋白质松散与线粒体的内膜。膜电位(也跨膜电位或膜电压)的区别是在内部和外部之间的电势生物细胞。积累的证据表明,线粒体细胞色素c的释放和减少线粒体膜电位似乎phthalocyanines-PDT-induced凋亡的肿瘤细胞(关键事件19,20.]。

我们发现之前,利乐α——(4-carboxyphenoxy)酞菁(TαPcZn)介导的PDT (TαPcZn-PDT)(图1)导致抑制bel - 7402细胞增殖和诱导细胞凋亡(11),这是一种使用最广泛的肝细胞癌的实验模型。然而,T的机制αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡尚未完全阐明。在目前的研究中,我们研究的目的是探讨P38MAPK / Caspase-8 T的自身调节的反馈机制αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。基于体外模型,我们发现,Caspase-3 bcl - 2,报价,和线粒体参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。


图1
T的化学结构αPcZn [11]。

2。材料和方法

2.1。材料

Anti-P38MAPK、anti-phos-P38MAPK anti-Caspase-8、anti-Caspase-3 anti-Bcl-2, anti-Bid, anti-Cytochrome c抗体购自细胞信号(哦,美国)。P38MAPK抑制剂SB203580和Caspase-8抑制剂Ac-IEFD-CHO来自默克Calbiochem(达姆施塔特,德国)。JC-I (5、5′, 6,6′-tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘)染色设备购买从Genmed科学(硕士,美国)。Annexin-V-FLUOS染色设备购买从罗氏(瑞士巴塞尔)。DMSO购买从σ(美国密苏里州)。美国DMEM培养基从Gibco购买(CA)。胎牛血清是购自PAA (Coelbe,德国)。青霉素是购自哈尔滨制药集团(黑龙江,中国)。链霉素是购自大连Merro制药(辽宁、中国)。聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)膜从Amersham购买法玛西亚生物技术(美国新泽西州)。 TαPcZn合成中描述我们的以前的报告23]。T PcZn原液制备在DMSO和存储在黑暗中在4°C。使用时,股票的解决方案是适当稀释获得所需的浓度,最终DMSO浓度的0.1%。所有其他化学药品和试剂的分析级。

2.2。细胞培养和治疗

肝癌bel - 7402细胞是来自哈尔滨医科大学,中国,在DMEM培养基培养和补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素和100 mg / L链霉素在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C。bel - 7402细胞对数生长期被播种在文化板块、孵化24 h在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C。与磷酸盐被清洗后,与T细胞治疗αPcZn原液稀释在媒介2.5 h在37°C SB203580或Ac-IEFD-CHO的存在与否。然后这些细胞被辐照SS-B仪器(无锡Holyglow理疗仪器有限公司,江苏,中国)发射红光的波长范围内600到700纳米。光剂量约为53.7 J /厘米2。此后,细胞收获3 h。控制细胞治疗0.1% DMSO溶液在相同的条件下。

2.3。细胞形态学分析

在3 h后处理,bel - 7402细胞内载玻片6-well文化板块与10%甲醛固定15分钟,用磷酸盐洗净、苏木精和伊红染色(他)。细胞形态学当时IX70倒置显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。

2.4。流式细胞术分析膜联蛋白V-FITC / PI双染色细胞凋亡

确认细胞凋亡是由测量外部化磷脂酰丝氨酸残基的检测使用膜联蛋白V-FITC。收获bel - 7402细胞收集和清洗与冰冷的磷酸盐,然后悬浮在500年μL膜联蛋白V绑定缓冲a . 100μL整除拍摄,2μL的膜联蛋白V-FITC和2μL (propidium碘(π)补充道,和混合物在室温下培养5分钟在黑暗中。之后的400年μL具有约束力的缓冲区,1×104分析了细胞在FACSCAN流式细胞分析仪(美国,正欲CA)通过使用CellQuest软件。结果作为一个点所示图。在每个图中,可行的细胞的百分比,早期凋亡细胞,和晚期凋亡细胞,分别显示在左下角,右下,右上角象限;的y设在对应相对PI染色;的 设在对应的日志FITC的信号。

2.5。JC-1测定线粒体膜电位

线粒体膜电位检测使用JC-1荧光染料通过流式细胞术。收获细胞被孵化的新鲜培养基含有JC-1染料(2.5 ug /毫升)为20分钟37°C在黑暗中,然后约1×104细胞流式细胞分析仪使用CellQuest软件分析。结果作为一个点所示图。在每个图,y设在对应JC-1 oligomer-associated红色荧光 设在对应JC-1 monomer-associated绿色荧光,荧光从红色降档的绿色表明线粒体膜电位的崩溃。

2.6。免疫印迹分析

所有免疫印迹进行使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page) Bis-Tris凝胶电泳所概述的供应商。细胞总蛋白,bel - 7402细胞细胞溶解在缓冲包含25毫米玫瑰,pH值7.5,0.3 M氯化钠,1.5毫米MgCl20.2毫米EDTA,特里同x - 100 0.1%, 20毫米β德勤甘油磷酸盐,0.5毫米,1毫米钠原钒酸盐,0.1μM冈田酸,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物。等量的溶解产物蛋白质在12% sds - page和electrophoretically转移到PVDF膜。阻塞后,这些墨迹被孵化与特定的主要抗体(anti-P38MAPK、anti-phos-P38MAPK anti-Caspase-3, anti-Caspase-8, anti-Bcl-2,和anti-Bid抗体)在一夜之间在4°C和进一步孵化1 h和辣根peroxidase-conjugated各自的二次抗体。结合抗体被增强化学发光检测设备与Lumino图像分析仪(创始人,北京)。细胞的线粒体和胞质分数孤立收集细胞色素c的免疫印迹试验(如前所述)(24]。细胞色素c蛋白质化验使用anti-Cytochrome c抗体。

2.7。统计分析

值意味着±。三个独立的实验。统计学意义是决定使用学生的未配对的双尾t以及。P值小于0.05在所有情况下都被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。自动调整的反馈P38MAPK / Caspase-8 T至关重要αPcZn-PDT-Induced bel - 7402细胞的细胞凋亡

我们之前的研究表明,TαPcZn-PDT显然bel - 7402细胞的诱导凋亡[11]。评估是否P38MAPK Caspase-8参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞凋亡,T的影响αPcZn-PDT P38MAPK, p-P38MAPK Caspase-8,分别研究了在本研究通过免疫印迹分析。与控制治疗相比,TαPcZn-PDT P38MAPK造成什么影响,upregulation p-P38MAPK,激活的活跃Caspase-8(图2),建议积极P38MAPK和Caspase-8可能调节TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。


图2
T的影响αPcZn-PDT P38MAPK, p-P38MAPK Caspase-8,分别,没有或SB203580或Ac-IEFD-CHO TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡分析免疫印迹分析。贝尔- 7402 T细胞被使用αPcZn (54μ米)没有或SB203580 (10μ米)或Ac-IEFD-CHO (10μ米)2.5 h,暴露在红灯照射(53.7 J /厘米2),然后孵化3 h。表达P38MAPK、p-P38MAPK Caspase-8被免疫印迹试验分析。

确定衰减的P38MAPK、p-P38MAPK Caspase-8 bel - 7402 T细胞的影响αPcZn-PDT-induced凋亡,我们使用了P38MAPK抑制剂SB203580或Ac-IEFD-CHO Caspase-8抑制剂。相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580 p-P38MAPK的差别导致P38MAPK几乎没有影响,对这些,和Ac-IEFD-CHO 43/41-kDa亚基的差别导致了对这些活性Caspase-8 TαPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞(图2活跃的P38MAPK),这表明衰减和Caspase-8可能参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

确认是否Caspase-8 P38MAPK T调节细胞凋亡αPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞,SB203580或Ac-IEFD-CHO对细胞凋亡的影响,分别是由几种方法在目前的调查研究。首先,凋亡细胞的形态特征被他染色试验评估。而控制细胞,细胞治疗TαPcZn-PDT显然表现出凋亡细胞的形态特征,如细胞收缩,染色质缩合、细胞核和细胞质碎片,膜气泡的形成(图3(一个))。然而,相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580或Ac-IEFD-CHO导致T细胞凋亡的形态学特征αPcZn-PDT-treated细胞(图3(一个))。此外,凋亡细胞的流式细胞术分析是定量评价膜联蛋白V-FITC / PI双染色细胞。与控制治疗相比,TαPcZn-PDT明显诱导细胞凋亡(数字3 (b)和3 (c))。然而,相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580或Ac-IEFD-CHO导致减少对T细胞凋亡的影响αPcZn-PDT-treated细胞(数据3 (b)和3 (c))。这些结果表明,主动P38MAPK和Caspase-8 T至关重要αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
T的影响αPcZn-PDT对bel - 7402细胞的细胞凋亡在没有或者存在SB203580 Ac-IEFD-CHO。贝尔- 7402 T细胞被使用αPcZn (54μ米)没有或SB203580 (10μ米)或Ac-IEFD-CHO (10μ米)2.5 h,暴露在红灯照射(53.7 J /厘米2),然后孵化3 h。凋亡细胞的形态学分析他染色试验(a),凋亡细胞的比例是通过流式细胞术分析化验的膜联蛋白V-FITC / PI双染色细胞(b和c)。酒吧在每个小组代表50μ提出了m。值代表三个独立的实验(意味着美国南达科他州±; ,与之相比,控制治疗; ,而TαPcZn-PDT治疗)。

确定P38MAPK调节Caspase-8 Caspase-8是否调节P38MAPK, Ac-IEFD-CHO SB203580 Caspase-8和效应的影响在P38MAPK Tα分别PcZn-PDT-treated bel - 7402细胞,免疫印迹试验在本研究调查。相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580下调43/41-kDa亚基的活跃Caspase-8和Ac-IEFD-CHO下调p-P38MAPK TαPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞(图2),这表明自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。上述结果表明,自动调整的反馈P38MAPK / Caspase-8 T至关重要αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

3.2。Caspase-3和bcl - 2家族蛋白参与P38MAPK / Caspase-8 T的自身调节的反馈αPcZn-PDT-Induced bel - 7402细胞的细胞凋亡

确定Caspase-3和bcl - 2家族参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞凋亡,T的影响αPcZn-PDT Caspase-3, bcl - 2,和报价,分别在没有或存在SB203580 Ac-IEFD-CHO被免疫印迹试验在目前的调查研究。与控制治疗相比,TαPcZn-PDT导致upregulation Caspase-3 17-kDa亚基的活跃,downregulation bcl - 2, upregulation 15-kDa亚基的活性(图4),这表明Caspase-3、bcl - 2和投标参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。此外,相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580或Ac-IEFD-CHO Caspase-3 17-kDa亚基的差别导致了对这些活跃,15-kDa亚基的差别upregulation bcl - 2,对这些基因的活性(图4),这表明自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8可能调节Caspase-3, bcl - 2, T和报价αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。


图4
T的影响αPcZn-PDT Caspase-3, bcl - 2,和报价,分别没有或SB203580或Ac-IEFD-CHO TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡分析免疫印迹分析。贝尔- 7402 T细胞被使用αPcZn (54μ米)没有或SB203580 (10μ米)或Ac-IEFD-CHO (10μ米)2.5 h,暴露在红灯照射(53.7 J /厘米2),然后孵化3 h。bcl - 2表达裂解Caspase-3,出价被免疫印迹试验分析。
3.3。线粒体参与P38MAPK / Caspase-8 T的自身调节的反馈αPcZn-PDT-Induced bel - 7402细胞的细胞凋亡

确定线粒体参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞凋亡,T的影响αPcZn-PDT对细胞色素c和线粒体膜电位,分别在没有或存在SB203580 Ac-IEFD-CHO被免疫印迹试验调查,JC-1流式细胞术在当下研究的试验。与控制治疗相比,TαPcZn-PDT导致upregulation细胞色素c和减少红色比绿色的荧光强度,表明线粒体细胞色素c的释放和破坏线粒体膜电位的参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡(图5)。此外,相比之下,TαPcZn-PDT治疗,SB203580或Ac-IEFD-CHO的差别导致了对这些细胞色素c和红色比绿色荧光强度的增加(图5),这表明自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8可能在T调节线粒体αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
T的影响αPcZn-PDT bel - 7402细胞的线粒体在没有或者存在SB203580 Ac-IEFD-CHO。贝尔- 7402 T细胞被使用αPcZn (54μ米)没有或SB203580 (10μ米)或Ac-IEFD-CHO (10μ米)2.5 h,暴露在红灯照射(53.7 J /厘米2),然后孵化3 h。分析了细胞色素c的表达免疫印迹试验(a),和线粒体膜电位(b)和红色比绿色荧光强度(c)在bel - 7402细胞测定JC-1流式细胞术测定,分别。值代表三个独立的实验(意味着美国南达科他州±; ,与之相比,控制治疗; ,而TαPcZn-PDT治疗)。

4所示。讨论

积累的证据表明P38MAPK和Caspase-8参与phthalocyanines-PDT-induced凋亡的肿瘤细胞(14,15,18]。我们之前的研究已经表明,TαPcZn-PDT显然可以诱导细胞凋亡的bel - 7402细胞(11]。然而,目前尚不清楚自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8 T至关重要αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。因此,T的影响αPcZn-PDT P38MAPK, p-P38MAPK Caspase-8,分别在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡没有或SB203580或Ac-IEFD-CHO首先在目前的调查研究。结果表明,TαPcZn-PDT造成激活P38MAPK Caspase-8,但SB203580或Ac-IEFD-CHO分别活跃的差别导致了对这些P38MAPK Caspase-8,表明激活P38MAPK和Caspase-8可能参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。并确认是否Caspase-8 P38MAPK T调节细胞凋亡αPcZn-PDT-treated bel - 7402细胞,SB203580或Ac-IEFD-CHO对细胞凋亡的影响,分别研究了在目前的研究。结果表明,TαPcZn-PDT明显诱导细胞凋亡,但SB203580或Ac-IEFD-CHO减毒bel - 7402细胞的细胞凋亡在TαPcZn-PDT-treated细胞,这表明激活P38MAPK T和Caspase-8是必不可少的αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。积累的证据表明,Caspase-8调节P38MAPK或P38MAPK调节Caspase-8药源性凋亡的肿瘤细胞(25- - - - - -27]。然而,目前尚不清楚自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。因此,SB203580对Caspase-8的影响和效果的Ac-IEFD-CHO P38MAPK在本研究进一步调查。结果表明,SB203580减毒Caspase-8激活,Ac-IEFD-CHO减毒的P38MAPK激活TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡,表明P38MAPK / Caspase-8可能调节T的自身调节的反馈αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。上述结果表明,自动调整的反馈P38MAPK / Caspase-8 T至关重要αPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

几项研究已经表明Caspase-3, bcl - 2家族蛋白质,参与phthalocyanines-PDT-induced线粒体是细胞凋亡的肿瘤细胞(18- - - - - -22]。我们之前的研究已经表明,bcl - 2 TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡(11]。然而,目前尚不清楚是否Caspase-3,报价,和线粒体参与TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。因此,T的影响αPcZn-PDT Caspase-3,报价,细胞色素c,线粒体膜电位,分别在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡在本研究首先调查。结果表明,TαPcZn-PDT显然导致激活Caspase-3投标,从线粒体细胞色素c的释放,和线粒体膜电位的影响,表明Caspase-3,投标,线粒体可能调节TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。积累的证据表明,Caspase-3, bcl - 2家族蛋白、线粒体是下游P38MAPK [27- - - - - -30.]或Caspase-8 [31日- - - - - -33]。然而,目前尚不清楚自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8可以调节Caspase-3 bcl - 2,投标,线粒体在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。因此,T的影响αPcZn-PDT Caspase-3, bcl - 2,细胞色素c,线粒体膜电位,分别在SB203580或Ac-IEFD-CHO在本研究调查。结果表明,SB203580或Ac-IEFD-CHO减毒激活Caspase-3和报价,downregulation的bcl - 2,从线粒体细胞色素c的释放,和线粒体膜电位的影响,表明Caspase-3 bcl - 2家族蛋白质和线粒体参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

综上所述,我们的研究结果表明,Caspase-3, bcl - 2,报价,和线粒体参与自身调节的反馈P38MAPK / Caspase-8在TαPcZn-PDT-induced bel - 7402细胞的细胞凋亡。

利益冲突

作者没有任何利益冲突的内容。

承认

这个项目财务支持的黑龙江省自然科学基金(没有。ZD201318)。