载脂蛋白我水平相关的尿蛋白/尿肌酐比值在小儿特发性Steroid-Sensitive肾病综合症:病例对照研究

文摘

体液因素可能导致特发性steroid-sensitive肾病综合症(石头)。在目前的研究中,我们使用质谱(MS)分析血清蛋白质识别与儿科石头的病理生理学相关的蛋白质。我们收集了33名儿童的串行血清样本在每个石头阶段;类固醇治疗前阶段A1是急性期(STx),与STx A2代表缓解期阶段,阶段A3代表STx的缓解期完成后。儿童与正常尿液(B组)和儿童肾病综合症除了issn (C组)作为控制。无显著差异在尿蛋白/尿肌酐(/加州)比率之间的观察儿童阶段A1石头和组c我们使用表面增强激光解吸/电离飞行时间女士进行样本分析。四个质荷比的离子峰(m / z)的6444、6626、8695年和8915年明显升高在石头阶段A1和A2期相比,相位A3和组的强度m / z6626年显著相关/加州比和一个m / z6626年被确认为载脂蛋白我(Apo我)。Apo /加州比我水平与在儿科石头。我们的研究结果提供了新的见解的病理生理学石头。

1。介绍

特发性steroid-sensitive肾病综合症(石头)是最常见的一种慢性肾脏疾病在儿童和渗透率增加引起的肾小球滤过屏障(1]。大量的研究表明,渗透性因素潜在肾小球滤过屏障功能障碍相关的病理生理学的石头2- - - - - -5),但这些因素尚未确定。传统的血清蛋白质组学分析的局限性和电荷抑制干扰从丰富的蛋白质,除了造成的障碍非常宽动态范围(> 10个数量级)的血清蛋白浓度。此外,22个最常见的蛋白质种类约占总数的99%血清蛋白(6]。

表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)可以克服这些问题。使用这种技术,我们有相关的载脂蛋白A-II (Apo A-II)血清水平与石头的状态(7];Apo A-II发现诱导2型辅助t细胞(Th2) [7),主要是发现在肾病阶段在石头8]。在目前的研究中,我们试图找出另一种蛋白质与石头的状态使用SELDI-TOF女士。

2。方法

本研究进行了符合赫尔辛基宣言的原则,道德委员会批准有望医科大学(A08-13,阿- 055)。知情同意是获得所有的病人和/或他们的父母。

2.1。病人和控制

这项研究调查了33名患者issn是承认我们部门2004年3月至2009年11月。研究对象包括三组孩子,那些在阶段a1a3石头和两个时代——sex-matched对照组(B组和C组)(7]。表中描述的组织的特点1。阶段常见的入选标准的一组石头的存在,一个选择性指数< 0.1由免疫球蛋白(Ig) G /转铁蛋白间隙比,没有感染1周在研究开始之前,和一个6个月没有免疫抑制疗法在研究开始之前。33例患者在石头的肾病阶段类固醇治疗(STx)启动(A1)阶段,33例患者在缓解期issn STx (A2)阶段期间,和12个患者在缓解期阶段的石头在完成STx (A3)阶段。更少的病人在A3阶段的原因是33名患者STx-dependent 21。

B组由15名健康儿童正常的尿液,和C组由八个孩子除了石头肾病综合症(也就是,Alport综合征,红斑狼疮肾炎、紫癜性肾炎,溶血性尿毒症综合征,IgA肾炎,或者non-IgA系膜增生性肾小球肾炎;membranoproliferative肾小球肾炎I型)。

无显著差异蛋白/尿肌酐(/加州)的比率(),血清白蛋白(sAlb)水平(),血清总胆固醇(t .胆固醇)水平()被发现之间的阶段A1和组c sAlb水平显著降低阶段A1与阶段A3 ()和B组()。t .胆固醇。级别(在阶段A1与阶段显著增加A3 ()。学生的以及应用于比较阶段A1和每组之间的差异。Anticholesterol代理尚未进行任何研究的参与者。

2.2。表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱分析

SELDI-TOF女士根据制造商的指示执行一些先前描述的修改(7]。

2.3。ISSNS-Associated肽的纯化和鉴定

人类血清样本(100μL)和50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释(pH值9.0),装上一个阴离子交换柱(Q琼脂糖快流;通用电气医疗集团,小都,英国)。样本分离采用缓冲与pH值下降和净化被确认使用Q10 ProteinChip®(Bio-Rad实验室,Inc .,大力神,CA)。所需的分数被稀释50毫米醋酸缓冲(pH值4.0)和加载到阳离子交换柱(CM琼脂糖快流;通用电气医疗集团)。样品分离采用缓冲盐浓度增加和净化被确认使用NP20 ProteinChip (Bio-Rad实验室,Inc .)。所需的分数是由反相高效液相色谱(HPLC)(2×100毫米列,TSK-GEL超级ODS;TOSOH、日本东京)和净化进展确认使用NP20 ProteinChip (Bio-Rad实验室,Inc .)。所需的分数是使用高效液相色谱纯化列(2×150毫米)(TSK-GEL酰胺- 80;TOSOH、东京、日本)和净化的进步是监控和确认使用NP20 ProteinChip (Bio-Rad实验室,Inc .)。 After a series of steps, we electrophoresed the desired fractions on Tris-tricine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels (polyacrylamide gel 16.2% T, 6% C) to evaluate the purity. Tandem mass spectrometry was used to analyze the purified fractions using a Nanoflow-LC ESI in positive mode (Q-TOF Ultima API®; Waters Corporation, Milford, MA, USA). Database searches were performed using Mascot® (Matrix Science Ltd., London, UK).

2.4。血清载脂蛋白我测量

11名患者的血清样本收集阶段A1组与C组七个人来确定血清Apo我的水平。两组年龄和性别匹配(表2)。两组没有显著差异对他们/加州,血清白蛋白和总胆固醇水平(,,、职责)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)进行确定Apo我水平在两组的血清样本,使用人类载脂蛋白我酶联免疫试剂盒(美国密苏里州Assaypro LLC)根据制造商的指示。本试验采用定量夹心酶免疫测定技术。标准和每个样本浓度被稀释100倍浓缩与稀释剂(EIA稀释剂集中;Assaypro LLC)和50μL每个标准和样品的是添加到个人井和板在室温下孵化2 h。后洗盘子洗缓冲区(清洗缓冲全神贯注;Assaypro LLC), 50μL的生物素化的抗体(生物素化的Apo我抗体;Assaypro LLC)添加到每个好,板是在室温下孵化2 h。洗后的板洗缓冲区,50μL的streptavidin-peroxidase共轭(streptavidin-peroxidase共轭,Assaypro LLC)添加到每个好,板是在室温下孵化了30分钟。洗后的板洗缓冲区,50μL的过氧化物酶酶底物(发色体衬底,Assaypro LLC)添加到每个好,板是在室温下孵化了30分钟。后增加50μL停止解决方案(停止解决方案,Assaypro LLC)每个好,吸光度是由一个微型板块阅读器读取(基准加标;Bio-Rad实验室,Inc .)的波长450 nm。

2.5。统计分析

数据分析使用的小动物——一张长有克鲁斯卡尔-沃利斯测试,其次是小动物——一张长有Mann-Whitney测试Bonferroni调整检测峰值特定阶段A1组。我们还分析了数据来确定每个峰的强度之间的相关性和/加州比使用一个双尾斯皮尔曼等级测试。

学生的以及被用来比较不同血清Apo我阶段A1组与C组之间的水平。被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。检测峰值与石头的肾病阶段有关

每个石头代表蛋白质质谱相位和组B和C都呈现在图1。为了弥补加载样品的浓度变化,峰值强度规范化使用正常的离子电流和分析在生物标志物向导软件(Bio-Rad实验室,Inc .)。数据提出了任意单位。101个样本的光谱表现出与质荷比207年的峰值(m / z)在2000年和10000年之间使用以下参数为所有光谱:第一遍,5.0;信噪比,5.0谷深度;最低阈值,峰值5.0谷深度;阈值和最小峰值20.0%。四个山峰是否检测到一个特定的阶段A1m / z6444年,6626年、8695年和8915年(图2)。这些峰的强度有显著的阶段A1组大于阶段A2和A3或组c之间没有显著差异观察阶段A3的病人组和B组的峰的强度m / z6626年或8915年。与一个峰的强度m / z6444年和8695年被更大的患者相A3群比B组。

3.2。峰值强度之间的相关性和/加州比率

显著的相关性被发现之间的峰的强度m / z6626年、8695年或8915年/加州比率(图3)。的峰值m / z6626是唯一的肽离子值< 0.01阶段A1组与阶段A3或组c .因此,我们试图找出原来的蛋白质了m / z6626股。

3.3。吉祥物的峰值的识别m / z6626年

我们确定的蛋白质m / z6626年的强度/加州比率显著相关的。我们这种蛋白质纯化从几个混合样品(图4吉祥物),通过搜索数据库,能够识别它作为Apo我片段407分。得分> 41表明身份或广泛的同源性()。

3.4。血清Apo我分析

平均血清Apo我水平的阶段A1组明显高于C组(87±18µ克/毫升与64±21µg / mL,)。平均血清Apo我水平阶段A1组高于40 - 70的等离子体的参考价值µ克/毫升,在C组在正常范围内。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们确定了我朊蛋白,是专门提升阶段A1的小儿石头,和其强度显著相关/加州比率。此外,血清Apo我水平阶段A1, ELISA测定,在c组明显高于发现因此,我们得出这样的结论:这个海拔不是次要的高脂血症与肾病综合症有关。我们所知,这些数据是第一个表明Apo我水平和石头之间的关联状态。

我们建议7月我可能与石头的病理生理学。

这个潜在的关联机制之一是增加血清Apo我水平反映了激活的巨噬细胞在肾病阶段儿科石头。13我是最小的载脂蛋白(6.6 kDa)确定日期和包括57个氨基酸(9,10]。13日我信使rna时调节单核细胞分化成巨噬细胞(11]。青年外交官访华团et al。12)报道,interleukin-18水平,这在很大程度上是被视为一个产品的巨噬细胞(13),在儿科的活跃阶段明显高于石头而缓解和控制。在先前的研究中,我们发现明显增加血清巨噬细胞炎性蛋白1的水平β(MIP-1β)在小儿肾病阶段STx之前石头,在缓解阶段相比STx缓解阶段在完成STx [14]。这些结果表明,巨噬细胞被激活在石头的肾病阶段,这可能会增加MIP-1的生产β。另一方面,陈等人。15]报道CD14的表达减少,单核细胞标记,从儿童外周单核细胞表面的石头在活跃的复发患者。然而,病人已经完成STx包含在他们的研究中,因此研究结果不精确反映小儿石头的病理生理学相关的现象。schleck et al。16MIP-1]表明,瘤内注射β增加肿瘤浸润的数量调控t细胞亚群),这表明MIP-1β招聘大量的亚群,在儿科石头的发病机制中发挥作用(17]。因此,巨噬细胞活化在肾病阶段的石头可能会增加MIP-1β生产和诱导缓解通过亚群的招聘。此外,增加血清Apo我水平在小儿肾病阶段石头可能反映了巨噬细胞激活,而不是低白蛋白血症。

另一个潜在的机制是Apo我与Th2细胞反应交互。儿科患者石头有过敏性疾病的发病率高18),特异反应性特点是Th2-dominant免疫机制(19),这表明Th2石头的发病机制中起着重要的作用在儿童(8]。Nagelkerken et al。10]表明,小鼠转基因的表达人类Apo我在肝脏和皮肤自发发展与特应性皮炎的症状。可能的致病机制之一是增强Th2活动促进皮肤完整性的丧失。同样,Apo我过度可能导致足细胞的功能或结构异常,这些异常可能引起Th2-dominant免疫机制的发展,这可能与小儿issn阶段有关。在我们之前的研究中,我们确定m / z8695年作为一个Apo A-II片段(7]。Apo A-II抑制干扰素-γ生产在人类CD4 t细胞(20.),可能导致Th2-dominant免疫机制。7月我可能在与Apo A-II合作工作。

第三个机制是CD80表达足细胞被Apo我影响。小鼠脂多糖(LPS)表示CD80的足细胞,导致足细胞足过程抹杀和蛋白尿(21]。这些发现表明,先天免疫有限合伙人可能参与微小病变性肾病综合症的发病机制(价值)。Berbe et al。22)表明,Apo我结合有限合伙人,这增强了LPS-binding炎症反应。因此,7月我可能促进CD80在足细胞的表达,可能参与其中的发病机制。

5。结论

我们发现Apo我水平升高在儿科石头的肾病阶段,和Apo我/加州比水平相关。从C组在本研究的样本量小,高度是否在7月我是一个二级反应与肾病综合征相关的高脂血症或不开放的讨论。然而,这些发现一个有趣的起点为进一步调查石头的病理生理学。

信息披露

作者获得版权所有者的许可复制数据2和3和表1以前发表的(7)(许可证编号3786270200624)。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持jsp KAKENHI批准号23791191,【Masanori纪念为促进儿科公共利益整合的基础。

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