成人原发性/特发性微小病变T细胞亚群分析:一项初步研究

摘要

目的.描述患有原发性/特发性微小病变疾病的成年患者肾脏浸润性T细胞和循环淋巴细胞亚群的特征。方法．在一组9名在发病时连续招募的原发性/特发性微小变化的成年患者中，我们用免疫组化技术描述(1)肾脏中浸润的免疫细胞，(2)用流式细胞术描述循环淋巴细胞亚群。作为一项探索性分析，研究了肾脏浸润免疫细胞和循环淋巴细胞亚群的数量和百分比与肾脏结局的关系，包括肾功能和蛋白尿的恶化，以及完成临床缓解的时间(长达48个月的随访)。结果．在招募的原发性/特发性微小改变疾病患者中，我们观察到(a)肾间质中浸润性T辅助细胞17细胞和细胞毒细胞(包括细胞毒T细胞和自然杀伤细胞)超过Foxp3+ Treg细胞;(b)外周血循环总CD8+ T细胞增多;(c)其中一些参数与肾功能和蛋白尿的相关性。结论．在原发性/特发性微小改变疾病中，肾脏组织和外周血中可以观察到效应T细胞相对于调节性T细胞的数量优势。然而，需要进行更大规模的验证性研究。

1.介绍

原发性微小改变病(MCD)是特发性肾病综合征的常见病因。组织病理学上，它的特征是在光镜或免疫荧光显微镜下明显缺乏异常，但在电子显微镜下足突消失。我们认为足细胞损伤是本病的基本功能障碍。因此，MCD也被归类为一种原发性足细胞病[1］.在这种情况下，肾小球滤过屏障的破坏导致肾小球对蛋白质的渗透性增加，导致严重的尿蛋白丢失，包括白蛋白、免疫球蛋白、补体、脂结合蛋白和凝血因子。随之而来的并发症包括低白蛋白血症、全身性水肿和营养不良，以及患者易感感染、血栓事件和血脂异常的风险。

虽然足细胞损伤的机制可能包括非免疫因素和免疫因素[2，3.]然而，它们仍然主要是推测性的，人们对其了解甚少。MCD科学中一项有趣的突破是发现唾液酸缺乏型糖蛋白血管生成素样4的高血清水平和足细胞过度表达与人类和小鼠MCD的几个临床、功能和组织病理学特征（包括蛋白尿的严重程度）相关，足细胞足突消失、肾小球基底膜电荷丢失和对皮质类固醇治疗的敏感性[4]幸运的是，N-乙酰-D-甘露糖胺（唾液酸前体）治疗显著改善了受影响动物的蛋白尿。另一方面，免疫因素，特别是T细胞功能障碍和循环肾小球通透性因子（假定为细胞因子）的释放，是MCD发生后最常见的免疫改变因素[5- - - - - -7].鉴于Foxp3的众所周知的作用⁺调节性T（Treg）细胞作为免疫反应的主要调节因子[8，9，可以想象，Treg细胞生物学功能障碍或数量不足可能在MCD发病机制中起重要作用。

Foxp3⁺Treg细胞在维持免疫稳态中起着重要作用。它们通过控制先天防御和免疫系统中各种细胞的激活、增殖和效应功能来调节持续的免疫反应。值得注意的是，它们可以分为两个主要的亚群，胸腺Foxp3和外周Foxp3⁺Treg细胞，在生理和病理免疫情况下具有不同的来源以及不同和互补的功能[10- - - - - -12］.胸腺Foxp3⁺Treg细胞在胸腺中获得自身的免疫调节能力，并被胸腺中存在的自身主组织相容性复合体分子和自身抗原所选择。胸腺Foxp3的作用⁺因此，外周血Treg细胞似乎通过调节潜在的自体反应性T细胞克隆的激活、分化和增殖来维持免疫耐受[13，14］.另一方面，外围Foxp3⁺Treg细胞来源于在次级淋巴器官和炎症组织中用外源抗原或改变的自身抗原刺激幼稚T细胞[9].外围Foxp3的产生⁺Treg细胞由效应器T（Teff）细胞的伴随激活驱动，其作为IL-2和其他许可细胞因子的来源，这些细胞因子是其发育所必需的[15，16］.因此，外围Foxp3的作用⁺Treg细胞似乎正在向外国抗原免疫反应的控制和自体抗原表达胸腺,从而防止不恰当的炎症反应和自身免疫性疾病引发的炎症或感染,T辅助(Th) 17日,Th1和细胞毒性T细胞(CTL)被认为发挥积极作用[11，13，14，17].Foxp3的功能障碍⁺Treg细胞，包括数量和功能的Foxp3之间的不平衡⁺Treg细胞和Teff细胞可能导致免疫稳态的紊乱，这可能有助于MCD的疾病发病机制。

事实上，以前的研究表明Foxp3存在这种功能障碍⁺Treg细胞在原发性MCD发病中的作用。一项研究对38例原发性MCD或局灶性节段性肾小球硬化的儿童进行了研究，报告Foxp3的浸润较少⁺与对照组相比，受影响患者的T细胞[18]对21例原发性MCD成人进行的另一项研究显示Foxp3的抑制能力降低⁺Treg细胞，尽管患者的循环Foxp3数量相似⁺与对照组比较的Treg细胞[19]在另一份报告中，21名患有类固醇耐药肾病综合征的儿童循环中分泌干扰素（IFN-）γ的Th1细胞和分泌IL-4的Th2细胞的比率高于Foxp3⁺与22名临床缓解的激素敏感肾病综合征儿童和14名健康对照者相比，Treg细胞的变化[20］.Th17细胞与Foxp3的相互作用⁺两项研究也报道了Treg细胞。一项研究显示，与健康对照组相比，25例原发性MCD成年患者的循环Th17细胞比Treg细胞增加，这也与蛋白尿的严重程度相关[21］.另一项对36名特发性肾病综合征儿童进行的研究显示，与健康对照组相比，循环Th17细胞比Treg细胞增加，这与肾内IL-17表达增加有关[22］.

我们的主要目的是确认T细胞亚群的类似免疫失衡是否是我们人群中原发性MCD的特征。我们主要关注Th17和细胞毒性细胞（包括CTL和自然杀伤（NK）细胞）在Foxp3上的数量平衡⁺肾组织中Treg亚群的免疫组化，使用它们的相对比率作为这种平衡的任意测量。由于缺乏正常的肾脏组织，我们以病例系列描述了我们的组织结果，以作比较。我们还使用流式细胞术检测并定量了患者外周血中不同的Teff细胞，但我们主要分析Th17细胞、CD8⁺T细胞（CTL的替代表型）和Foxp3⁺Treg细胞。我们将这些患者外周血中的发现与健康对照组的观察结果进行了比较。最后，我们探讨了我们选择的免疫参数与临床结果之间的相关性，包括肾功能恶化和蛋白尿，以及完成临床缓解的时间。因此，这是一项初步描述性研究，报告了MCD患者肾组织和外周血中不同免疫细胞亚群的观察频率及其与临床结果的关系。

2.材料和方法

２.１.研究设计与患者

这是一项单中心前瞻性研究，对9名年龄在21-80岁的连续患者进行队列研究，新发的经活检证实的MCD被认为是特发性的。患者于2012年1月1日至2014年3月31日在新加坡总医院（SGH）肾内科招募，当时进行了新发肾病综合征的本地肾活检，并随访了48个月进行结果分析。在外周血研究的许多比较中，招募健康人作为对照组。所有参与者均签署知情同意书，我们的方案由我们的中央机构审查委员会批准（批准号2009/672/E）。

２.２.排除标准

排除标准为HIV感染、血液系统恶性肿瘤史、儿童、孕妇、认知能力差、囚犯、无法理解研究方案和给予同意。

2．3.临床数据

从患者硬拷贝病例记录和电子病历中检索基线人口统计学和临床特征。还记录了处方免疫抑制剂的使用和类型。

２.４.常规实验室调查

测定血清肌酐，通过尿蛋白与肌酐的比值或24小时收集的尿总蛋白对蛋白尿进行量化。通过改良肾病饮食(MDRD)方程计算估计肾小球滤过率(GFR)。所有实验室参数前瞻性地从电子医疗记录中检索，间隔6个月，从本地肾活检时间到随访48个月。所有的实验室调查都在SGH的临床实验室进行，该实验室是由美国病理学家学院认证的。

2.5. 免疫组织化学法检测自然肾活检中的T细胞亚群和B细胞

免疫组化检测T细胞亚群和B细胞在天然肾组织活检中是在SGH肾科和病理科的实验室进行的。简而言之，从福尔马林固定和石蜡包埋的肾组织标本中制备的切片，用与山葵过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的单克隆抗体进行染色，并针对不同的表型标记，包括CD4(用作CD4的替代标记)⁺T细胞)，CD8(用作CD8的标记⁺T细胞)，CD19(用作B细胞的标记)，IL-17(用作分泌il17的Th17细胞的标记)，颗粒酶B(细胞毒性细胞的标记，包括CTL和NK细胞)和Foxp3(用作Treg细胞的替代标记)使用自动染色机。使用这些酶各自的显色底物显示不同抗体在肾脏组织样品上的结合。同型匹配抗体作为阴性对照。扁桃体组织作为阳性对照。光镜半定量地观察和测量CD4浸润的百分比⁺, CD8⁺, CD19⁺细胞数，以每毫米细胞数表示²通过调整Olympus CellSens软件Foxp3测量的活检表面积，检测肾脏活检(细胞密度)⁺, IL-17⁺，或颗粒酶B⁺细胞。

2.6。T细胞亚群的流式细胞术表型分析

总CD3的定量⁺T细胞，CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和CD19⁺使用SGH血液学实验室提供的BD LSR II机器，使用针对CD45、CD3、CD4、CD8和CD19的荧光标记单克隆抗体，通过流式细胞术检测患者和健康对照组外周血全血中的B细胞。CD4的量化⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞、CD4⁺CD161⁺Th17细胞，CD4⁺CD45RA^-记忆T细胞，CD4⁺CD45RA⁺幼稚T细胞，CD8⁺CD45RA^-记忆T细胞，CD8⁺CD45RA⁺幼稚T细胞，CD3⁺CD56⁺自然杀伤T (NKT)细胞，CD3⁺TCRd1⁺T细胞，CD3⁺TCRd2⁺T细胞，CD4^-CD161⁺TCRa7.2⁺粘膜相关不变T（MAIT）细胞和CD3^-CD56⁺自然杀伤(NK)细胞存储的患者和健康对照组外周血单核细胞是由流式细胞术使用BD LSR II机可以在新加坡免疫学网络,使用fluorochrome-labelled单克隆抗体对不同表型标记包括CCR6, CD3, CD4, CD8, CD5, CD14、CD19, CD25、CD27、CD28、CD39、CD45RA、CD45RO、CD49d、CD56、CD127、CD152、CD161、GARP、tcr7.2、TCRd1、TCRd2。20色流式细胞仪采集所有染色细胞，使用FlowJo v9.5软件分析染色结果。为了补偿和校准目的，使用了市面上可买到的荧光铬标记珠作为对照。报告标记表达细胞的百分比，并按淋巴细胞计数的百分比进行调整。这些T细胞亚群的绝对数量是通过调整百分数与淋巴细胞计数的比例获得的，淋巴细胞计数是通过在SGH的临床实验室中测量全血计数获得的。

2.7。统计分析

作为一项在允许的招募期内对连续招募的患者进行的探索性描述性研究，未计算样本量。使用描述性统计显示我们从免疫组化研究中获得的结果。无法与健康对照肾组织进行比较。不同的淋巴细胞和使用Mann–Whitney法比较原发性MCD患者和健康对照组外周血T细胞亚群百分比和比率测试。Spearman相关性用于评估肾组织和外周血中淋巴细胞和T细胞亚群百分比和数量与不同临床结局的相关性，包括血清肌酐、MDRD GFR和蛋白尿的变化，以及完成临床缓解的时间，肌酐加倍，需要透析。所有分析均使用SAS V9.3软件(SAS Inc.， Cary, NC, USA)进行。

3.结果

本研究包括9例原发性MCD患者。所有人都有自己的肾活检标本，通过免疫组织化学检测不同的T细胞亚群和B细胞。无法获得正常肾组织（或正常的替代组织）作为免疫组化研究的对照。8名患者提供血样，通过流式细胞术测定外周血中不同T细胞亚群。多达12名健康人作为对照，通过流式细胞术检测外周血中的免疫细胞。招募患者的基线人口统计学和临床特征如表所示1. 大多数患者是患有完全性肾病综合征的年轻中国男性，活检时未服用类固醇或免疫抑制剂。每个患者的详细临床参数如表所示2．

图形1在原发性MCD患者中，通过免疫组化显示多个T细胞亚群和B细胞的表型。照片拍摄于T细胞和B细胞中度浸润的区域，以显示我们的检测能力，因为浸润稀少，大多数患者的整体染色是离散的，但足以进行亚群识别和定量。MCD患者细胞浸润以CD4为主⁺和CD8⁺有少量B细胞的T细胞。CD4浸润的中位百分比⁺T细胞，CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞，IL-17细胞密度的中位数(每平方毫米肾活检细胞数)⁺细胞(Th17细胞)，颗粒酶B⁺细胞毒性细胞(包括CTL和NK细胞)和Foxp3⁺细胞（Treg细胞）如图所示2．我们观察到与Foxp3相比，Th17细胞和细胞毒细胞的细胞密度更高⁺Treg细胞。因此，Th17细胞相对于Foxp3的比率⁺Foxp3上的Treg细胞和细胞毒性细胞⁺Treg细胞是对这些亚群之间数值平衡的任意测量，其数量增加。我们无法接触到正常肾组织来比较我们的发现，并调查我们观察到的频率和比率是否与在健康个体中观察到的不同。

在外周血中，我们测量了每微升血液中循环CD3的百分比(从淋巴细胞计数)和绝对值⁺T细胞，CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞,CD19⁺B细胞，单核细胞，以及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞、CD4⁺CD161⁺Th17细胞，CD4⁺CD45RA^-记忆T细胞，CD4⁺CD45RA⁺幼稚T细胞，CD8⁺CD45RA^-记忆T细胞，CD8⁺CD45RA⁺幼稚T细胞，CD3⁺CD56⁺NKT细胞、CD3⁺TCRd1⁺T细胞，CD3⁺TCRd2⁺T细胞，CD4^-CD161⁺TCRa7.2⁺MAIT细胞和CD3^-CD56⁺NK细胞。图形3.图示多色流式细胞术在原发性MCD患者中检测到的一些T细胞亚群。在外周血中，我们发现总CD3的百分比明显更高⁺T细胞( )和总CD8的百分比⁺T细胞( )，与健康对照组比较(图4（b）和4 (f))， naïve、记忆CD8的百分比和数量无显著性差异⁺T细胞在两组之间。Foxp3⁺与健康对照组相比，原发性MCD患者的Treg细胞没有显著减少（图4（o）和4（p））.另一方面，与对照组相比，原发性MCD患者的Th17细胞数量显著减少( 图形4（q）).在原发性MCD和健康对照组之间，研究的其他T细胞亚群或免疫细胞没有统计学上的显著差异（图5)，除了在原发性MCD患者中发现循环NK细胞较低外。最后，循环Th17细胞与Foxp3的计算比率没有差异⁺Treg细胞或循环记忆CD8⁺T细胞在Foxp3上⁺Treg细胞(图6）.

作为探索性分析，我们将选定的免疫细胞参数与临床结果相关联，以解决任何潜在的临床意义3.在我们的探索性分析中，循环和浸润性免疫亚群与血清肌酐、MDRD GFR和蛋白尿(在随访的不同时间点)以及完成临床缓解的时间之间发现了具有统计学意义的相关性。这些患者达到完全的临床缓解，中位时间为28天(图)7)随后血清肌酐稳定。没有患者的肌酐翻倍或接受透析。根据我们最初的假设，在疾病开始时，循环CD8的数量⁺T细胞与血清肌酐呈正相关（图8（a）MDRD GFR呈阴性(图8（b）)，肾组织浸润CD4的百分比⁺T细胞(图8（c）)和循环naïve CD8的百分比⁺T细胞(图8（d）)与蛋白尿及Foxp3细胞毒性比值呈正相关⁺Treg细胞与MDRD GFR呈负相关(图)8（e））.

4.讨论

虽然原发性MCD的免疫发病机制是复杂的，在很大程度上仍未被破译，但有人提出，这可能是扰乱了Teff细胞和Foxp3之间的免疫平衡⁺Treg细胞起着潜在的致病作用[23］.本初步研究旨在描述不同Teff细胞和Foxp3的相对频率⁺组织和外周血中的Treg细胞，作为原发性MCD中免疫平衡的任意测量。尽管样本量较小，但其主要优势在于将组织数据与外周血中不同免疫细胞亚群的详细表型分析以及临床参数相结合。据我们所知e、 这在以前的研究中没有尝试过。

在组织中，我们发现原发性MCD患者肾间质中T细胞的浸润是最小的(图)2）.我们发现原发性MCD患者的肾间质浸润主要由T细胞而不是B细胞组成，这与原发性MCD从根本上说是一种T细胞疾病的观点一致。此外，Foxp3似乎相对缺乏⁺Th17细胞和细胞毒性细胞上的Treg细胞。我们的研究表明Th17细胞与Foxp3的比率⁺Treg细胞，以及Foxp3上的细胞毒性细胞⁺Treg细胞升高(任意决定比率大于1)。尽管理想情况下正常健康受试者的浸润可用于比较，但在我们的描述性研究中，伦理上无法实现。其他研究将他们的观察结果与活体供体肾脏组织或薄膜疾病患者的观察结果进行了比较[18，24].在SGH，活体供体植入前没有获得活检，我们平行研究中招募的患者中没有一例诊断为薄膜病。在这些研究中，健康或“正常”对照组也被发现有罕见的细胞浸润，这可能与我们的MCD患者的细胞浸润相似，也可能不相似。因此，在本文中，我们主要描述和部分解剖观察到的浸润现象，并报告其相对频率，这是评估免疫平衡的常见方法。但我们确实承认，这是一种任意且不完美的评估免疫平衡的方法，特别是当在体内，在几种人类疾病中激活或功能失调的不同免疫臂的复杂功能和数值相互作用，而不仅仅是数值平衡时。然而，这种相互作用只能通过对疾病状态中存在的功能表型的多维询问以及对涉及的细胞和分子相互作用层次的详细评估来评估，但这超出了我们研究设计和目标的范围和范围。此外，我们的发现与已发表的数据一致，这些数据表明组织浸润Foxp3可能存在缺陷⁺原发性MCD中的Treg细胞[18］.此外，在2002年报道的一项研究中，在7个有轻微改变疾病的儿童中有2个检测到颗粒酶B的基因表达[25］.

与已发表的观察结果一致[19]，我们的原发性MCD患者显示出相似数量的循环Foxp3⁺Treg细胞与健康对照组比较。然而，与我们的假设和前面提到的两份报告相反[21，22]，我们没有观察到循环Th17细胞比Foxp3的比率增加⁺与健康对照组相比，原发性MCD患者中的Treg细胞。这些不同的观察结果可能是由于检测Th17细胞的技术方法不同。我们使用CD161作为Th17细胞的替代标记物（在CD3上⁺CD4⁺与健康对照组相比，原发性MCD患者外周血Th17细胞数量减少。相反，这些作者基于细胞浆内IL-17的表达检测，这确实可能是一个更可靠的标记。然而,在这些研究中,检测所需IL-17-expressing细胞体外刺激T细胞,这在我们看来(基于我们的未发表的观察与CyTOF质量血细胞计数在肾移植)在不同的项目可能会使有过多的代表的实际频率分组人口体内。不考虑这种可能性，我们的组织和外周血结果反映了自身，因为我们观察到浸润和循环的Th17细胞均明显减少，这意味着我们的观察不一定反映技术差异，但可能是这种情况的特征。同样，这还不是决定性的，因为我们缺乏组织对照来进行比较。

在我们的研究中值得一提的一个技术限制，即使用替代细胞标记物的单一染色免疫组织化学固有的，是假设所有CD4⁺表达细胞是CD4⁺T细胞，所有的Foxp3⁺细胞为Treg细胞，所有颗粒酶B⁺细胞是CTL和NK细胞。免疫荧光可以绕过这一限制，这可以在随后的拨款申请中考虑。

观察我们的免疫参数与临床表现和疾病结局的某种程度的联系是很有趣的。我们的大多数患者在开始类固醇治疗后立即获得完全的临床缓解，没有血清肌酐水平翻倍或需要透析。因此，我们将临床结局分析的重点放在发病时的蛋白尿水平和肾功能以及临床缓解时间上。与我们的整体假设一致，我们发现了CD4的浸润⁺T细胞和循环CD8⁺发病时蛋白尿较高的T细胞与循环CD8的相关性⁺T细胞和细胞毒性细胞在Foxp3上的浸润率⁺Treg细胞表现为肾功能恶化。总的来说，这些观察似乎支持长期以来的观点，即原发性MCD可能是一种T细胞介导的疾病，或者T细胞功能障碍可能在其发病机制中发挥重要作用。但是，这些观察是在有限的情况下进行的探索性分析得出的，应当有所保留。然而，我们报道它们是为了潜在的假设产生的目的，而不是从它们提出结论。

总的来说，我们的结果表明不同免疫亚群的数量不平衡，特别是Foxp3缺乏⁺Treg细胞或效应Th17细胞和细胞毒性细胞的优势可能是原发性MCD的一个特征。然而，有必要对生理致病机制进行更大规模的验证性研究。

5.结论

原发性MCD是成人特发性肾病综合征的重要原因。在MCD患者的肾间质中可以检测到不同的免疫亚群，其中Th17细胞和细胞毒性细胞的数量相对丰富，超过Foxp3⁺Treg细胞似乎是这种情况的特征。虽然我们的观察是初步的，但它们增强了目前关于这一主题的有限知识，尽管我们的论文没有提供功能数据，但我们的发现可能会激发进一步的详细研究，从更机械的角度评估所谓的Foxp3之间的免疫失衡⁺Treg和Teff细胞及其在原发性MCD足细胞损伤发病机制中的作用。更好地理解原发性MCD的免疫发病机制对于改进我们目前的诊断设备和发展可能涉及T细胞亚群调节的更具针对性的免疫治疗是必要的。

缩写

CTL：	细胞毒性T淋巴细胞
肾小球滤过率(GFR):	肾小球滤过率
干扰素:	干扰素
背景:	微小病变性肾病
MDRD：	肾脏疾病的改良饮食
MAIT：	粘膜相关不变T细胞
NK：	自然杀伤细胞
NKT:	自然杀伤T
SGH：	新加坡总医院
画眉草:	效应T
Th:	辅助T
Treg:	调节性T。

附加点

总结原发性微小病变是成人特发性肾病综合征的常见病因。感染、某些环境因素以及可溶性肾小球通透性因子水平升高引起的T细胞功能障碍被认为在这种疾病的发病机制中起着核心作用。因此，Foxp3的功能障碍或相对缺乏⁺调节性T细胞高于效应性T细胞，可能与其免疫发病机制有关。我们在这里提出一个初步表型分析的主要T细胞亚群浸润肾脏和外周血的成人患者原发性微小改变疾病。辅助性T细胞17和细胞毒性细胞明显多于Foxp3⁺原发性/特发性微小病变患者的肾间质中检测到Treg细胞，但我们没有对照正常肾组织进行比较。另一方面，在外周血中，我们观察到循环总CD8的增加⁺患者的T细胞变化极小。这些结果表明，在原发性/特发性微小改变疾病中，在肾脏组织和外周血中可以观察到效应T细胞相对数量上的优势。然而，需要进行更大规模的验证性研究。

伦理批准

该研究方案由新加坡新加坡健康中心机构审查委员会批准(批准号:2009/672 / E)。

同意

在接受本地肾活检之前，所有参与者都签署了知情同意书，这在我们的方案中是临床适应症，而不是实验程序。

信息披露

出于数据分析的目的，少数作者共享了未识别的数据。没有向第三方共享任何数据。

的利益冲突

作者和参与机构之间没有利益冲突，作者没有任何财务关系需要披露。

作者的贡献

Francisco Salcido-Ochoa设计了这项研究，修改了所有收集到的数据，分析和绘制了数据，并撰写和修改了论文;苏瑞珊(Susan Swee-Shan Hue)分析了组织病理学数据并修订了论文;Doreen Haase设计了这项研究并分析了流式细胞术数据;Jason Chon Jun Choo提供了临床建议并修改了论文;Nurhashikin Yusof进行了流式细胞术实验并收集了临床数据;李丽香(Reiko Lixiang Li)进行免疫组化实验并收集临床资料;小约翰·卡森·艾伦(John Carson Allen Jr.)执行并监督了统计分析并修改了论文;Jabed Iqbal分析了组织病理学数据并修改了论文;Alwin Hwai Liang Loh分析了组织病理学数据并修改了论文;Olaf Rotzschke设计了这项研究，提供了基本的科学建议，并修改了论文。

致谢

作者想要感谢他们的研究赞助商，SingHealth基金会(批准号为。SHF/FG398P/2008)和新加坡国立大学联合伙伴关系下的医学学术临床项目，以及他们的图书馆技术人员Rachel Liew女士，帮助他们获得最难获取的参考文献。

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