蛋白酶体活化剂,PA28α和PA28β,管理糖尿病肾病微血管损伤和视网膜病变的发展

文摘

糖尿病肾病(DN)和糖尿病性视网膜病变(DR)是1型和2型糖尿病的主要并发症。DN和博士主要是由损伤引起的血管周的支持细胞,在肾小球系膜细胞和周在视网膜上。基因和分子机制诱发视网膜和肾小球的周糖尿病损伤特征很差。在这项研究中,蛋白酶体的基因删除激活基因,PA28α和PA28β基因,保护实验STZ-induced的糖尿病小鼠糖尿病模型对肾损伤和视网膜微血管损伤和长期生存与野生型相比STZ糖尿病老鼠。改善健康和减少肾损害与减少的表达骨桥蛋白(OPN)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)肾小球的STZ-injected PA28α/ PA28β双基因敲除(Pa28αβDKO)小鼠和也在培养的系膜细胞和视网膜脱离Pa28周围的周αβDKO老鼠生长在高葡萄糖。高葡萄糖条件下的系膜PA28-mediated OPN的表达被抑制肽能抑制PA28的绑定20 s蛋白酶体。总的来说,我们的研究结果表明,糖尿病高血糖促进PA28-mediated改变脆弱的血管周围细胞的蛋白酶体活动导致微血管损伤和DN和博士的发展。

1。介绍

糖尿病高血糖或高血糖会导致死亡率和发病率在DN和博士通过破坏肾脏和视网膜血管功能。这些疾病与肾功能衰竭和死亡的主要原因失明的1型和2型糖尿病患者(1- - - - - -3]。类似的分子途径似乎控制糖尿病肾脏和视网膜微血管损伤的发展。这种猜测来自更高的巧合的DN和博士;即DN患者已经发达博士和博士很容易开发DN患者(4,5]。根据相似之处影响视网膜和肾脏病理背景,这是假设DN和博士可能出现在肾小球损伤血管周的支持细胞和视网膜。脆弱的血管细胞类型影响糖尿病高血糖是视网膜的周(RPC)及其类似物在肾小球系膜细胞。博士,RPC进行细胞死亡和脱离视网膜血管,诱发视网膜neoangiogenesis,血管渗漏和牵引性视网膜剥离以减少视觉或终端失明6- - - - - -8]。DN的特点是矩阵系膜扩张和肾小球毛细血管内的阻塞肾过滤单元,肾小球(9]。DN的glomerulopathy肾过滤效率降低,并在长期建立的情况下,触发终末期肾功能衰竭与死亡率(10]。

几种生化机制和途径投机引起的发病机理中描述这些机制包括博士DN或增强氧化应激,增强多元醇通路,PKC激活,炎症,和先进的糖化终产物形成(3,11- - - - - -13]。最广泛的调查机制的发展与DN和博士都是增强氧化应激和炎症引起的代谢变化。然而,大量的证据表明,免疫和炎症机制开发和发展的重要因素和DN(博士14- - - - - -17]。激活巨噬细胞的招募和增加代的炎症和促炎介质(TNF -α,il - 1βil - 6, MCP-1和OPN)在视网膜和肾环境与发展和恶化的DN和博士(17- - - - - -22]。然而,精确的分子和细胞机制仍然难以捉摸。

氧化应激是一种现象之间的平衡氧化自由基的生成和系统负责清除细胞干扰导致增强自由活性离子的形成包括活性氧(ROS)。增加细胞内ROS水平受到糖尿病高血糖驱动抗氧化基因表达保护细胞免受氧化损伤(23]。后一个目标基因的诱导氧化应激是NF-E2-related转录因子2 (Nrf2)。最近的两个特征基因受Nrf-2并提供防止氧化应激和胁迫适应蛋白酶体激活基因,PA28α和PA28β(24]。这是推测PA28蛋白质提高蛋白酶体降解活动清除氧化或错误折叠的蛋白质(24- - - - - -26]。的PA28α/β基因最初被确定为组件的immunoproteasomes诱导干扰素-的反应γ。PA28α和PA28β蛋白质形成heptameric复杂(4β/ 3α)充当开路的20多岁的水解酶,因此刺激nonubiquitinated短肽的降解。的特征函数PA28蛋白质抗原肽的生成是由MHC类我分子(27,28]。

的PA28α/β调节在高葡萄糖条件下培养的RPC和intraglomerular毛细血管的1型糖尿病小鼠秋田犬(1]。理解PA28的角色α/β基因在DN和博士的发展,Pa28αβDKO老鼠测试及其生理和生物指标与STZ-induced糖尿病野生型小鼠相比。糖尿病Pa28αβDKO老鼠提供了更高的存活率,更高的体重,更高效的肾过滤功能,降低微血管损伤的视网膜感觉与糖尿病野生型小鼠相比。肾小球系膜细胞,并从Pa28 RPC孤立αβDKO老鼠OPN水平较低和高葡萄糖条件下MCP-1。OPN称为促炎的糖尿病微血管损伤进展相关蛋白(19,22]。PA28-dependent监管OPN表达被高刺激的葡萄糖和废除的合成肽块绑定PA28 20年代的水解酶。因此,本研究的结果提供新颖的见解泛素蛋白酶体系统(UPS)的作用,特别是PA28蛋白质,在调节糖尿病的微血管损伤。

2。材料和方法

2.1。动物

动物维护、基因分型、治疗和分析方法是指导认证机构动物保健和使用委员会的威斯康辛大学医学与公共卫生学院。所有的C57BL / 6小鼠用于实验背景。细胞隔离,6岁的男性immorto老鼠(股票编号006553)和研究糖尿病、Pa28αβDKO雄性老鼠(股票编号021202)。糖尿病诱导的动物一个注射链脲霉素(STZ;180毫克/公斤柠檬酸缓冲,pH值4.2 ip注入)。三天治疗后,所有STZ-injected动物的血糖高于400 mg / dL。

2.2。Albumin-to-Creatinine比率(ACR)分析

ACR分析收集的尿液样本住房每个老鼠代谢笼(Tecniplast、意大利)24小时。尿白蛋白肌酐水平是衡量ELISA (Albuwell M, Exocell)和ACR测量进行了根据制造商提供的指导方针。

2.3。透射电子显微镜(TEM)和组织学分析

老鼠肾脏切片和immersion-fixed 2%多聚甲醛溶液(PFA)和2.5%戊二醛在0.1钠甲次砷酸盐缓冲,pH值7.4,一夜之间在4°C。组织是后缀在室温下2小时1%四氧化锇在同一个缓冲区。随后样本梯度乙醇系列脱水中,然后在丙烯氧化脱水,嵌入在环氧树脂环氧树脂。超薄部分准备使用徕卡UC6超微切片机和安装在200 -网状碳涂层铜网格。组织部分与飞利浦CM120电子显微镜,观察和图像捕获MegaView三世侧数码相机。

不是和JMS-H&E染色的福尔马林固定,石蜡包埋,5 - 6μm组织部分deparaffinized在二甲苯和水化按照分级比例的乙醇(100%,95%,80%,70%),经常沾推荐试剂。数字图像拍摄和NA PL APO目标(10 x / 0.25 NA, 40 x / 0.95 NA, 1.4和63 x / NA石油)ScanScope XT系统上使用透视仪版本10软件(Aperio Technologies Inc。)。

2.4。细胞分离、文化和肽转染

RPC的隔离和文化被描述之前(29日]。视网膜感觉短暂,从一个垃圾(6 - 7幼崽,可老)immorto老鼠收集在解剖显微镜下。收集到的视网膜感觉与血清杜尔贝科修改鹰的冲洗介质(DMEM),汇集,剁碎,与胶原酶消化45分钟II型(1毫克/毫升,沃辛顿)与0.1% BSA在无血清DMEM 37°C。细胞resuspended同等金额含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和旋转400×g 5分钟。4毫升的颗粒状细胞resuspended DMEM包含10%的边后卫,2毫米谷酰胺,100μ青霉素g / mL链霉素,100 U /毫升,以及重组小鼠IFN -γ(研发系统)在44 U /毫升。细胞被均匀地分为4井24-well的细胞培养板和维持在33°C公司为5%₂。细胞被逐步传递到更大的盘子和维护和传播在60毫米菜肴。

鼠标的隔离和文化娱乐是描述其他地方30.]。视网膜感觉从一个垃圾(为期6个月的6到7个幼崽,老中)immorto小鼠解剖解剖显微镜下无菌和保存在哈佛商学院含有青霉素和链霉素的缓冲区。视网膜感觉被汇集在一起,与哈佛商学院冲洗缓冲(生命技术),剁碎成小块在60毫米组织使用无菌培养皿刀片,和消化5毫升的胶原酶I型(1毫克/毫升在无血清DMEM,沃辛顿)为45分钟37°C。消化后,DMEM添加了10%的边后卫和细胞颗粒状。细胞通过无菌40μ米尼龙过滤器(BD猎鹰)和旋转400 g×10分钟到颗粒细胞,和细胞被洗两次DMEM包含10%的边后卫。这些细胞被resuspended 1.5毫升中(与10%的边后卫DMEM)和孵化anti-PECAM-1 antibody-conjugated Dynabeads(技术)。关联绑定后,磁珠被冲洗6次与DMEM 10%的边后卫,细胞在内皮细胞生长介质被镀成的单井24-well板预镀与2μ克/毫升的人类纤连蛋白(BD生物科学)。内皮细胞在DMEM包含20%的边后卫,2毫米谷酰胺、丙酮酸钠2毫米,20毫米消息灵通的,不重要的氨基酸,100年的1%μ青霉素g / mL链霉素,100 U /毫升,刚加入肝素在55 U /毫升(σ),内皮生长100年补充μ克/毫升(σ),以及重组小鼠IFN -γ(研发系统)在44 U /毫升。细胞被维持在33°C公司为5%₂。细胞被逐步传递到更大的盘子,维护和传播在1% gelatin-coated 60毫米菜肴。

肾小球系膜细胞的分离之前使用一个标准的过程描述(31日]。简单地说,8×10⁷Dynabeads(技术)被稀释在40毫升的磷酸盐,通过成年小鼠的心脏灌注。肾脏提取,机械地剁碎,与1型胶原酶消化,透过100年μm过滤器。收集肾小球磁铁和洗了三次以消除肾性细胞和碎片。肾小球是生长在两周生长介质建立系膜细胞培养。

KGEC被孤立于肾小球系膜细胞类似描述后隔离过程之前(32]。纯化肾小球播种,可以种植在矩形介质涂层35毫米板。confluency在80 - 85%,细胞被孵化与anti-PECAM-1 antibody-conjugated Dynabeads,洗,丰富类似矩形的文化。孤立的细胞的纯度由流式细胞仪和免疫染色。BPC BEC, KPC、HPC和LPC的过程类似于RPC后被孤立隔离。肽(中国共产党科学)和战车转染试剂(活动主题)重组和使用根据制造商的指导方针。

2.5。Trypsin-Digested视网膜血管的准备工作

无核的眼睛固定在4%多聚甲醛至少24小时。切割视网膜感觉洗一夜之间在去离子水和孵化3%胰蛋白酶(Difco™250年胰蛋白酶,和公司)正准备在0.1米三,0.1顺丁烯二酸,和pH值7.8包含0.2氟化钠为2 h 37°C。neuroretinal组织轻轻刷掉,结果分离血管树风干到玻璃显微镜幻灯片(33]。

2.6。RNA隔离和实时PCR

从细胞总RNA提取的总RNA隔离设备(Norgenbiotek)根据制造商的指示。细胞融合可以达到85 - 90%,与PBS冲洗两次,刮掉盘子,转移到RNase-free microfuge管。RNA是使用试剂盒纯化试剂(技术)。的互补脱氧核糖核酸合成了1μ克的总RNA。1/10-diluted cDNA微升之一是用作实时PCR模板完成一组和反应是使用SYBR绿色主混合Mastercycler Realplex(埃普多夫)指定的引物在补充实验过程。热循环被设定为95°C 2分钟;40的循环放大(95°C 15年代和60°C 40年代);和离解曲线步骤(95°C 15年代,60°C为15秒,15秒和95°C)。标准曲线产生已知的数量为每个目标基因的线性化质粒DNA。十倍稀释系列用于每一个已知的目标被放大SYBR绿色qPCR预混料。线性回归为ng DNA计算的相对荧光单位在一个阈值(Ct)荧光值量化放大目标从细胞提取物通过比较相对荧光单位在Ct标准曲线,规范化的同时放大RpL13A所有样品(管家基因)。

2.7。蛋白质分离和免疫印迹

对蛋白质分离、细胞80%汇合的菜肴是收获后添加裂解缓冲(150毫米生理盐水、1% Triton x - 100, 20毫米Tris-HCl (pH值7.4),蛋白酶抑制剂鸡尾酒(亮抑酶肽1毫米PMSF, 10毫米,10毫米抑肽素))。免疫印迹分析,50μg细胞溶解产物或条件培养基与Laemmli涨跌互现的蛋白质样品缓冲和降低或nonreduced样本煮10分钟。煮样本加载到4 - 20%三甘氨酸丙烯酰胺凝胶(生命技术)并使用SDS电泳进行运行缓冲(25毫米三、190毫米甘氨酸0.1% SDS, pH值8.3)。

2.8。质粒和细胞转染

鼠标cDNA PA28编码α和PA28β被克隆到pLVX-IRES-Hyg和pLVX-IRES-Neo质粒(Clontech),分别。慢病毒颗粒是由使转染293 t细胞Lenti-X (Clontech)和收集的媒体。pBABE-OPN /普罗质粒和其他地方描述的包装细胞(34]。使用FuGENE6培养细胞转染试剂(Promega)根据推荐协议。48小时后,潮霉素B (500μg / mL;Sigma-Aldrich)、新霉素(750μg / mL;生命技术),嘌呤霉素(5μg / mL;Sigma-Aldrich)添加到细胞培养。

2.9。统计分析

数据被表示为均值±SEM。寿命分析使用kaplan meier生存分析。统计学意义是由方差分析(方差分析)和Tukey-Kramer为多个比较使用事后分析值为0.05 GraphPad棱镜软件(美国圣地亚哥,CA)。值被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。PA28α和PA28β调节存活率和STZ-Induced糖尿病小鼠肾过滤效率

PA28水解酶监管者以前显示显著调节肾小球毛细血管的秋田犬慢性高血糖小鼠模型的8个月但不是同龄野生型(非糖尿病的老鼠1]。在这项研究中PA28的角色α/β在调节糖尿病微血管疾病研究通过链脲霉素(STZ)注入野生型和Pa28αβDKO老鼠。STZ已经对分泌胰腺细胞毒性的影响β肽和诱发I型糖尿病在实验动物35]。

所有的Pa28αβDKO / STZ和野生型/ STZ小鼠血糖水平高于450 mg / dL注射STZ后三天,那天牺牲(表1)。与Pa28相比αβDKO / STZ老鼠,野生型/ STZ老鼠表现出显著降低存活率和减肥的四个月STZ注入。的Pa28αβDKO / STZ老鼠保护,没有明显的体重减轻或减少生存6个月后注射STZ(数字1(一)和1 (b))。假设改善肾功能负责观察Pa28的健康状况的改善αβDKO / STZ老鼠。为了验证这一点,albumin-to-creatinine比率(ACR)测试使用。ACR是诊断肾过滤的试验基础疾病(36,37),反映了肾脏滤过功能的效率。测量蛋白尿明显高于野生型/ STZ (μg / mg)比non-STZ野生型(μg / mg)小鼠和28αβDKO / STZ老鼠(μg / mg)(图1 (c))。

下的组织学和超微结构的属性肾小球non-STZ和STZ-injected老鼠评估。在肾脏部分肾组织学评估使用合并后的琼斯乌洛托品银- (JMS)苏木精和伊红染色())和高碘酸希夫(PAS)染色。JMS和PAS染色是经常用于检测系膜基质增加和肾小球基底膜(GBM)的变化(38]。没有明显的改变在本研究的出现,相邻的小管,以及系膜或内皮细胞在不同动物组织(图2(一个))。

类似光显微分析、TEM分析没有任何明显差异的厚度在野生型/ STZ和Pa28“绿带运动”αβDKO / STZ老鼠。缺乏明显的糖尿病肾小球病理TEM测试尽管减少肾过滤效率(由ACR测试)在小鼠研究可能是因为C57BL / 6小鼠的抗GBM形态变化(数据行2 (b)和2 (c))。然而,有一个显著减少的相对数量intraglomerular内皮小窗在四个月STZ-injected Pa28的野生型小鼠相比αβDKO / STZ老鼠(与)(图2 (d))。同样,六个月STZ-injected Pa28αβDKO老鼠提供高内皮小窗与四个月STZ-injected野生型小鼠(与)(图2 (d))。由于炎症介质OPN和MCP-1已经证明是密切相关的开发和进展DN和博士,我们调查了他们的水平在肾小球中使用实时PCR mRNA隔绝STZ-injected和非糖尿病的野生型和Pa28αβDKO老鼠。qPCR分析没有提供任何差异il - 1的水平β和肿瘤坏死因子-α信使rna在野生型和Pa28αβDKO老鼠在正常和STZ -注入条件下(没有显示)。然而,OPN的mRNA和MCP-1显示,野生型/ STZ与非糖尿病患者显著增加野生型肾小球(数字3(一个)和3 (b))。有趣的是,与野生型/ STZ肾小球,Pa28αβDKO / STZ肾小球OPN的表达MCP-1并没有显著改变。这些数据表明PA28α和PA28β调节糖尿病肾小球血管损伤最有可能通过调节促炎的药物的表达。

3.2。培养Pa28αβDKO系膜细胞表达减少大量的OPN和MCP-1高葡萄糖条件下

了解PA28α和PA28β基因促进肾小球损伤在糖尿病,为体外模型,从野生型和Pa28系膜细胞αβDKO老鼠孤立进一步特征(29日,31日,39]。自从mRNA水平OPN和Pa28 MCP-1αβDKO / STZ肾小球低于野生型/ STZ老鼠和这些蛋白的表达与DN和博士的发展,我们调查是否高葡萄糖浓度在体外可以诱导OPN的表达和MCP-1基因在孤立系膜细胞。免疫印迹和qPCR分析这些基因进行了三天的治疗后与正常的葡萄糖(5毫米),高葡萄糖(葡萄糖25毫米或40毫米),或渗透性控制(5毫米葡萄糖+ 20毫米L-glucose)。免疫印迹分析提供的条件培养基健壮诱导Pa28 OPN表达野生型,但不是αβDKO系膜细胞治疗后高葡萄糖(图4(一))。qPCR分析野生型和Pa28αβDKO细胞也证实了upregulation Pa28 OPN表达野生型,但不是αβDKO系膜细胞治疗高葡萄糖(图4 (b))。因为MCP-1蛋白质不能检测到免疫印迹(未显示),我们使用qPCR评估MCP-1转录水平的变化在正常和高葡萄糖条件下培养的系膜细胞。OPN的qPCR数据一致,MCP-1成绩单在野生型显著增加系膜细胞生长在高葡萄糖条件下,而Pa28αβDKO细胞显著降低MCP-1记录在同一条件(图4 (c))。

这是下一个测试是否lentiviral-mediated reexpression PA28α和PA28β单独或同时恢复Pa28 OPN的表达αβDKO系膜细胞。的reexpression PA28α单独或PA28α和PA28β从Pa28恢复OPN一起发布αβDKO细胞在正常和高葡萄糖条件下(图4 (d))。的超表达PA28α导致更少的有力OPN的表达相比,同时两PA28超表达α和PA28β。这种效应可以归因于PA28的能力α子单元形成一个活跃的homoheptameric蛋白酶体监管复杂PA28尚未报道β单体(28]。

3.3。Pa28αβDKO / STZ老鼠提供降低视网膜非细胞毛细血管的数量

博士是另一个糖尿病微血管并发症的减少归因于在视网膜微血管周和随后的内皮细胞的死亡。在视网膜上,这种过时的血管会出现薄实体被称为非细胞毛细血管(40]。因此,我们调查测试方面的保护在Pa28肾小球微血管损伤αβDKO / STZ老鼠这些老鼠是否同样对视网膜微血管损伤的保护。与四个月STZ-injected野生型小鼠相比,Pa28的视网膜微血管平安装准备αβDKO老鼠表现出非凡的非细胞毛细血管数量减少后四个月(与注射STZ)和6个月(与),分别为(数字5(一个)和5 (b))。

减少Pa28非细胞毛细血管的数量αβ视网膜感觉DKO / STZ证明PA28的损失α/β基因保护RPC对抗高血糖引发的细胞死亡。试验效果的高葡萄糖治疗培养RPC和调查他们是否应对高葡萄糖一样的系膜细胞,分离、培养RPC从野生型和Pa28αβDKO老鼠。高葡萄糖治疗野生型RPC强劲诱导OPN的表达和MCP-1 Pa28αβDKO RPC处理高葡萄糖没有明显增加OPN和MCP-1表达式(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。下一个测试增加OPN的表达是否应对高葡萄糖限制RPC是独一无二和系膜细胞或其他血管细胞类型也作出了类似的反应。为此,不同的鼠标内皮和血管周的细胞类型是孤立的从各种器官和暴露于高葡萄糖类似于RPC和系膜细胞。这些细胞包括视网膜内皮细胞(REC),肾脏肾小球内皮细胞(KGEC),肾肾性周总(KPC),大脑的周(BPC),大脑内皮细胞(BEC)、心(HPC)周围的周,肺周(LPC)。OPN的免疫印迹分析表明,这些血管细胞类型不包含高架OPN在高葡萄糖条件下(图生产5 (f))。因此,增加产量的OPN在高葡萄糖条件下是一个独特的RPC和系膜细胞的特征。

3.4。XAPC7和HBX肽抑制OPN在高葡萄糖条件下培养的系膜细胞释放

调查如果OPN释放系膜细胞暴露于高葡萄糖是由Pa28的绑定α/β20年代蛋白质水解酶,我们研究了肽能够扰乱Pa28协会α/β20 s蛋白酶体。PA28-inhibitory肽融合答域的HIV病毒被用于这个试验(41]。答序列添加到XAPC7和HBX肽促进培养细胞的转导。XAPC7-TAT和HBX-TAT肽以及紧急控制肽融合乙被用来使转染培养的系膜细胞三天高葡萄糖条件下促进OPN释放。免疫印迹分析条件媒体提供强大的抑制OPN在治疗后释放XAPC7-TAT, HBX-TAT 5μ米和10μ米的浓度,分别(数据6(一)和6 (b))。治疗肝X受体(LXR)受体激动剂,T0901317和GW3965显示抑制OPN释放和改善DN的严重性42]。因此,积极控制对我们的实验和抑制OPN释放肽治疗,我们在cotreatment LXR受体激动剂使用的系膜细胞高葡萄糖。结果,几乎T0901317和GW3965完全抑制OPN释放10点μ浓度(数据6(一)和6 (b))。有趣的是,TAT-fused炒肽也在应对高葡萄糖抑制OPN释放。答肽先前证明抑制PA28绑定20年代水解酶(43,44]。因此,TAT-scrambled肽的抑制作用可能是由于乙肽的域。然而,与TAT-only肽治疗系膜细胞即使在200年μM浓度不抑制OPN释放(图6 (c))。的失败TAT-only肽在抑制OPN在高葡萄糖条件下释放表明,乙需要融合肽抑制PA28的元素绑定到20 s蛋白酶体。为了排除答的抑制作用域,XAPC7和HBX肽不答域合成和交付使用战车的系膜细胞转染试剂。治疗与XAPC7及其炒控制导致的完整剂量依赖性抑制OPN释放(图6 (d))。这种效应的控制肽可能是由于这些肽的短的大小和正电荷而HBX肽。HBX显示显著减少OPN发布在不同的浓度,但这种抑制是不如XAPC7有力。炒HBX肽不显著影响OPN释放的系膜细胞(图6 (d))。总的来说,这些发现表明,高的Pa28 glucose-induced绑定α和Pa28β到20年代水解酶在RPC和系膜细胞调节OPN生产。

利用Pa28αβDKO老鼠、系膜细胞和RPC Pa28隔绝αβDKO老鼠在这项研究证明PA28α和PA28β基因是决定糖尿病微血管损伤的关键。证据是提供的参与PA28蛋白酶体加剧的DN发病机制的监管机构证明,与野生型/ STZ小鼠相比,PA28αβDKO / STZ老鼠不发展严重的蛋白尿。提供进一步的测试,与野生型相比,OPN和MCP-1炎症介质在Pa28明显抑制αβDKO / STZ肾小球系膜细胞,在高葡萄糖条件下和RPC。OPN分泌被Pa28监管α/β在不同血管细胞类型,只有在培养检测RPC和系膜细胞暴露于高葡萄糖。这是符合更高灵敏度的RPC和系膜细胞的细胞毒性效应高葡萄糖相比其他血管细胞类型包括矩形、KGEC, BPC和BEC。这些发现在解决为什么有很大影响引发糖尿病微血管并发症的发展在于RPC和系膜细胞。细胞损伤和死亡的视网膜血管周的支持细胞和肾引起的高血糖之前博士的发展和DN。据报道增加OPN表达与DN和博士的发展和相关药理试剂能够抑制OPN释放提供保护对DN和博士(21,42,45]。OPN巨噬细胞chemoattractive功能和发展,推动了DN和博士的巨噬细胞和单核细胞的招募到视网膜,肾脏。OPN释放血管周的细胞在糖尿病肾脏和视网膜可能调控局部炎症信号增加巨噬细胞招聘和激活。这部小说PA28的函数α和PA28β蛋白在调节OPN表达和糖尿病微血管损伤表明,除了抗原处理性能,在传感和应对这些蛋白质具有未知函数在特定子集的血管细胞代谢变化。重要的是,增加OPN的表达后暴露于高葡萄糖只在RPC和系膜细胞的主要目标糖尿病高血糖损伤了PA28特异性功能α和PA28β在感知和响应改变葡萄糖水平。

类似于LXR受体激动剂,T0901317 GW3965,抑制OPN表达和DN STZ糖尿病小鼠的严重性42),交付肽抑制PA28绑定到20年代水解酶,XAPC7, HBX, TAT-conjugated肽抑制OPN释放系膜细胞在高葡萄糖条件下。这表明OPN表达在高葡萄糖条件下从系膜细胞由PA28监管α和PA28β绑定到20 s蛋白酶体。同意PA28的角色α和PA28β在调节OPN表达,reexpression PA28α单独或PA28α和PA28β在Pa28αβDKO系膜细胞恢复OPN的表达。有趣的是PA28的表达α仅从Pa28还刺激OPN释放αβDKO系膜细胞。这个观察可以解释为PA28的特殊能力α单体形成一个活跃的管理复杂的绑定和激活20年代水解酶的能力。目前,尚不清楚OPN的表达或MCP-1单独负责Pa28改善糖尿病微血管损伤αβDKO老鼠或其他途径也参与其中。然而,因为其他组表明,蛋白酶体抑制小鼠变弱DN的发展(46- - - - - -48),在Pa28的相对抑制水解酶αβDKO RPC和系膜细胞也会为他们的保护提供一个合适的解释糖尿病肾脏和视网膜损伤。这可以由之前的研究中,PA28蛋白质被证明是调节在RPC也在糖尿病肾小球PA28蛋白质的表达水平与糖尿病肾损伤的严重程度(1,49]。因此看来,过度激活或解除管制的水解酶调节PA28蛋白质可能导致视网膜微血管损伤,肾小球血管。

其他调查人员表明,高葡萄糖治疗RPC和系膜细胞诱导氧化应激(50,51]。的PA28α和PA28β被证明在间隙中发挥关键作用的蛋白质错误折叠和氧化和氧化应激适应培养心肌细胞(26]。同样,在RPC和系膜细胞,PA28α和PA28β蛋白质可以帮助RPC和系膜细胞氧化应激的适应引起的高葡萄糖。例如,结果表明:RPC蛋白酶体degradational容量较低比其他血管细胞类型,如矩形(1]。因此,PA28 -α/ -β蛋白质可以帮助蛋白质的降解受到暴露RPC高葡萄糖,但公开的水解酶的激活RPC和系膜细胞引发悲剧性的后果。

4所示。结论

这项研究提供了重要的见解PA28的角色α和PA28β基因在促进糖尿病肾脏和视网膜微血管损伤。首先,删除PA28α和PA28β基因保护糖尿病动物对DN。其次,MCP-1和OPN的表达DN的重要介质或被证明是由PA28博士α和PA28β在RPC和系膜细胞生长在高葡萄糖。第三,Pa28αβ博士DKO老鼠显示减少的严重程度反映在视网膜感觉他们的非细胞毛细血管数量减少。最后,PA28-inhibitory肽的抑制效应由间质细胞OPN释放生长在高葡萄糖。因此,调制的degradational活动泛素蛋白酶体系统由PA28α和PA28β蛋白质的发展提供了一个合适的人选未来治疗糖尿病微血管并发症尤其是视网膜和肾脏。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢m·斯列萨列夫诉Rogness, n . Sheibani科学建议和技术援助以及h . Rao准备病毒转染材料。他们也感谢Drs。a . Sijts(乌特勒支大学)和k .田中(东京大学)提供PA28α和PA28βPa28 overexpressing质粒也αβDKO鼠标。这项工作是EY016995赠款支持,EY021357, P30-EY016665来自美国国立卫生研究院。

引用

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