文摘
目的。本研究的目的是描述协调的分子结构和组成的变化的墙壁的动静脉瘘管(AV)诱发静脉段溢出。方法。静脉组织样本收集从6血液透析患者AV瘘管溢出和其他正常的4头静脉血液透析病人。从静脉组织样本中提取总RNA,和基因表达两组之间的比较使用整个人类基因组DNA微阵列44 K。微阵列数据分析GeneSpring GX软件和聪明才智途径分析。结果。互补脱氧核糖核酸微阵列分析确定了397个调节基因和456个基因表达下调。基因本体论分析GeneSpring GX软件显示,生物发育过程和粘多糖绑定是最调节。另外,大多数upregulation发生细胞外地。通路分析,转化生长因子β信号通路、细胞因子和炎症反应通路,肥大模型和子宫肌层的放松和收缩通路显著调节与控制头静脉。结论。结合微阵列结果和途径提供生物信息通过互联网了解静脉壁的结构和成分溢出AV瘘管。
1。介绍
动静脉瘘管(AV)是非常有用的,以确定最优为透析血液流动,但AV瘘管暴露溢出被认为增加心输出量和引起高输出心力衰竭(1,2]。
测量血流通过内部分流最初是由Krivitski et al .,通过分流器和血流量的监控已经成为普遍3]。我们使用这种技术来监控AV瘘管的血液流动在我们医院和正确的溢出AV瘘管手术。
人们认为溢出AV的流出静脉瘘管熊沉重:静脉暴露在动脉流量增加,扩张,引发血管重建过程。然而,流出静脉的分子机制改造成一个成熟的瘘仍不明朗。通过调查静脉重建在溢出AV瘘管,候选基因重要重构过程可以发现调查及其功能意义。因此,识别相关的基因在这一过程中应该提供洞察AV瘘成熟。
在这项研究中,我们进行了互补脱氧核糖核酸微阵列分析和比较段的静脉壁溢出AV瘘管从6血液透析患者和其他正常的4头静脉血液透析患者是否有任何差异基因表达模式。
2。研究人群
从2009年6月到2010年9月,548名患者接受血液透析在不管Oyokyo肾脏研究所,日本。在那段时期,10位病人接受结扎手术来纠正一个溢出AV瘘。当操作被执行时,我们保留的样品溢出的AV瘘(图1)。AV瘘管切除标本从墙上的静脉接近AV瘘吻合。这项研究是生物伦理学委员会批准Oyokyo肾脏研究所,和所有病人提供他们的知情同意过程之前执行。
(一)
(b)
3所示。入选标准
入选标准如下:(1)血访问流量大于2.0 L / min的彩色多普勒超声(2)下臂的AV瘘远端radio-cephalic吻合。总共6例有溢出AV瘘管,满足这些标准。这些患者的背景详细的表1。我们也获得了较低的组织样本的手臂远头静脉4新的血液透析患者和使用这些控制。
4所示。方法
如上所述,静脉切除组织从静脉段溢出的AV瘘6例,从一个正常的头静脉4其他病人。立即手术标本放置在试管包含RNAlater(详情见下文)。
从静脉组织样本中提取总RNA,和基因表达两组之间的比较使用整个人类基因组DNA微阵列44 K(安捷伦科技,圣克拉拉,加州)。GeneSpring GX的微阵列数据分析软件和创新路径分析。
5。RNA隔离
手术标本0.5厘米或更小的尺寸和最初存储在RNA后(Ambion、奥斯汀、TX)一夜之间°C在-80°C到RNA提取。总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。总RNA进一步纯化使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA),然后提取出来。RNA的数量和质量是决定使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,MA)和一个安捷伦生物分析仪(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。
6。cRNA放大和标签
总RNA放大并贴上青蓝3 (Cy3)所指示的安捷伦的生产商低投入快速Amp标签设备,一种颜色(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。短暂,100 ng的总RNA反向转录双链cDNA使用保利dT-T7发起人底漆。底漆,模板RNA和质量控制记录已知的浓度和质量在65°C 10分钟然后变性和孵化2小时40°C和5 x第一链缓冲区,0.1德勤,10毫米核苷酸混合,混合和核糖核酸酶亲和力脚本块。亲和力脚本酶灭活在70°C,持续15分钟。由此产生的cDNA产品被用作体外转录模板来生成荧光cRNA。他们混合了转录大师的T7 RNA聚合酶和Cy3-labeled CTP和孵化40°C 2小时。标签cRNAs使用试剂盒纯化的RNeasy迷你旋转30列和筛选了μL nuclease-free水。放大和标签后,cRNA数量和青蓝合并使用Nanodrop nd - 1000分光光度计测定和安捷伦生物分析仪。
7所示。样品杂交
对于每个杂交,1.65μ克Cy3-labeled cRNA支离破碎,杂化到一个安捷伦的人类通用电气4 x44k v2微阵列(设计ID: 026652) 17小时65°C。洗后,微阵列使用安捷伦DNA微阵列扫描仪进行扫描。
8。微阵列数据分析
每个扫描特性的强度值量化使用安捷伦特征提取软件(版本10.7.3.1),执行背景减法。我们只使用特性标记为没有错误(旗帜)和排除功能,不积极,不重要,不统一,不高于背景水平,人口饱和,或离群值(边际和缺席旗帜)。使用安捷伦GeneSpring GX版本11.0.2正常化了。(每个芯片:规范化的75百分位的转变;每个基因:标准化值在所有样本)。总共有34127个探针的安捷伦人类通用电气4 x44k v2微阵列(设计ID: 026652),不包括控制探针。微阵列数据提交给NCBI地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),样本数量(GSE39488)。
改变的成绩单是量化使用比较方法。我们应用值< 0.05加上> 2倍归一化强度的变化来识别基因表达模式明显不同。
9。基因本体论分析和路径分析
基因本体论分析使用安捷伦科技GeneSpring GX软件(11.0.2)。路径分析与GenMAPP 2.1 (http://www.genmapp.org/)。
10。结果
互补脱氧核糖核酸微阵列分析显示397个基因调节和456个表达下调(表2和3)。
基因本体论分析显示,生物发育过程和粘多糖绑定是最调节。此外,大多数upregulation发生细胞外地(表4,5,6)。
路径分析表明TGFβ信号通路,细胞因子和炎症反应通路,肥大模型和子宫肌层的放松和收缩通路调节(表7)。
11。讨论
AV瘘管是非常有用的,以确定最佳的血液流动的血液透析因为满意的血液访问流所需的足够的血液透析。在狭窄的病变发生在血管系统和血流不足,经皮腔间血管成形术或其他执行干预。然而,溢出AV瘘管增加心输出量和引起高输出心力衰竭(1]。
在2005年的日本社会透析治疗指南为慢性血液透析血管通路建设和修复,血管访问流是导致心脏衰竭当血液访问流量大于1.0 - -1.5 L / min或当血管访问流/心输出量比> 20%1]。如果血管访问流显然是负责心脏功能的下降,那么有必要故意收缩或堵塞血管的访问(1]。监测血流多普勒超声心动图在内部分流术已成为普遍,溢出AV瘘管正积极治疗。最近的一些研究指出组织学变化的重要性在AV瘘管(4,5]。
微阵列的血管访问已报告在实验动物模型,但没有这样的分析在人类6]。在目前的研究中,从溢流AV瘘管切除静脉组织样本6血液透析患者和其他正常的4头静脉血液透析患者和他们的基因表达模式进行了比较。
有趣的是,锌finger-containing转录因子,如egr1 egr2,和egr3立即早期基因如安全系数和小君,在本研究发现显著的调节;egr1、egr 2, egr 3都牵连到许多类型的细胞的增殖和分化(7,8),安全系数和小君与血管生成的规定(9]。此外,egr-1 c-jun, c-fos与自由基清除酶的调节10- - - - - -13]。我们还观察到的自由基清除酶活性upregulation溢出AV瘘管的墙壁,这可能反映了慢性活性氧在溢出AV瘘管形成。
路径分析表明,转化生长因子β信号通路和细胞因子和炎症反应通路调节。这表明,溢出AV瘘管可能与血液透析患者的慢性炎症。
营养不良、炎症和动脉粥样硬化(MIA综合征)是常见的在终末期肾病(ESRD)患者中,和炎症被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病中发挥关键作用。促炎细胞因子是重要的炎症,伴有营养不良和动脉粥样硬化在ESRD [14]。我们的研究表明,溢出AV瘘管可能涉及MIA综合症。
12。结论
结合微阵列结果和路径信息通过互联网提供生物洞察分子溢出AV瘘管的静脉壁的变化。尽管小样本大小,我们的研究结果表明,溢出AV瘘管可能与血液透析患者的慢性炎症。