的影响直接肾素抑制剂Aliskiren在自发的2型糖尿病患者尿白蛋白排泄KK -鼠标

文摘

客观的。虽然血管紧张素II-mediated炎症和细胞外基质积累被认为是糖尿病肾病的进展,这些过程尚未充分阐明。本研究的目的是确定是否异常的纠正肾表达基质金属蛋白酶及其抑制剂(基质金属蛋白酶/ TIMPs)和细胞因子aliskiren KK -管理老鼠renoprotective效应。方法。KK -老鼠被分为两组,即治疗(生理盐水)和治疗(aliskiren)组。收缩压,糖化血红蛋白水平,albumin-creatinine比率(ACR)测量。纤连蛋白,肾脏的表达基质金属蛋白酶/ TIMPs IV型胶原,MCP-1, (pro)肾素受体((P) RR)是使用实时PCR和免疫组织化学染色检查。肾MAPK和NF -κB活动也通过免疫印迹分析和ELISA的调查,分别。结果。显著降低收缩压和ACR水平观察治疗KK -鼠与未经处理的研究结果相比KK -老鼠。此外,增加基质金属蛋白酶/ TIMPs、纤连蛋白、IV型胶原,MCP-1,和(P) RR表达,除了MAPK和NF -κ活动,被aliskiren政府明显减弱。结论。看来aliskiren改善蛋白尿和肾纤维化通过调节炎症和胶原合成与降解的变更。

1。介绍

最近的研究表明,慢性炎症和细胞外基质(ECM)积累促进糖尿病肾病(DN)的进展(1,2]。我们也报道了肾脏的表达增加单核细胞趋化蛋白1 (MCP),纤连蛋白和IV型胶原在KK -老鼠(3- - - - - -5),2型糖尿病的常用动物模型(T2D) [6]。此外,血管紧张素II (Ang)诱导增殖的磷酸化蛋白激酶(MAPK)和增加核转录因子(NF)κB绑定活动小鼠模型(5]。一些研究表明,肾素-血管紧张素系统(RAS)的肾小球高血压的进展的主要介质,炎症,阻力指标纤维化,也许可以和导致DN的发展(7- - - - - -9]。

Aliskiren是第一个代理在一个新类口服有效的直接肾素抑制剂批准用于高血压治疗(10,11]。相比传统的RAS阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和Angⅱ1型受体阻滞剂(arb) aliskiren块RAS通过直接抑制血浆肾素活性和预防和我和Angⅱ的形成,所展示的基础和临床研究结果(10,12]。避免试验的数据表明,添加aliskiren ARB提供了一种添加剂antiproteinuric效果比单独ARB [13]。从高度研究14],aliskiren潜在cardiorenal效益和安全的广泛的高危患者T2D仍有争议。进一步的基础研究需要理解的作用机制aliskiren预防肾脏疾病进展。

间隙扩张之间存在很强的相关性,通过改变肾小球硬化症肾血流量、血流动力学改变,和葡萄糖的直接影响;所有这些促进ECM的积累和profibrogenic和炎性细胞因子的激活15]。之间的失衡肾小球细胞外基质蛋白质的合成和降解基质金属蛋白酶及其抑制剂(基质金属蛋白酶/ TIMPs)被认为扮演重要角色在DN的肾小球硬化的发展因为高葡萄糖或盎II可能诱导改变基质金属蛋白酶/ TIMPs平衡(16]。之间有一个积极的相声炎症和ECM的合成,最终导致慢性肾功能衰竭(17]。然而,基质金属蛋白酶的作用/的上下文中TIMPs糖尿病仍然是有争议的。

在目前的研究中,我们假设直接肾素抑制剂aliskiren可能改善早期DN通过炎性细胞因子表达的衰减和/或调制改变基质金属蛋白酶/ TIMPs KK -肾脏的表达老鼠。

2。方法

2.1。实验动物和协议

六个男KK / Ta Jcl和糖尿病KK -/ Ta Jcl老鼠从克丽购买日本(日本东京)。老鼠被单独安置在塑料笼子免费食物(啮齿动物颗粒饮食NMF;348千卡/ 100 g,包含粗脂肪5.5%)和水在整个实验。所有老鼠都保持在一个房间里在常规条件下与常规和温度控制在12 h光/暗周期°C。所有实验根据顺天堂大学动物保健委员会的指导方针。Aliskiren好心的给了诺华制药公司(瑞士巴塞尔)。KK -老鼠被分为两组:(1)汽车集团(:)和(2)aliskiren(25毫克/公斤/天)组(每组)或11。Aliskiren是皮下注入通过ALZET micro-osmotic泵(库比蒂诺Durect有限公司、钙、美国)。药物治疗是进行4周(从8到12周的年龄)。先前的研究的药物剂量测定(18]。ALZET micro-osmotic泵装有生理盐水中使用了:KK -和KK小鼠组。与未经处理的KK小鼠近正常糖耐量水平作为控制KK -老鼠。实验程序终止时,老鼠达到12周的年龄。小鼠组织如下:8周治疗KK小鼠组(Group1), 12周治疗KK小鼠组(Group2), 8周治疗KK -老鼠集团(Group3), 12周治疗KK -老鼠集团(Group4), 12周治疗KK -小鼠组(Group5)。

2.2。生化测量

体重(BW)、收缩压(SBP)、空腹血糖(FBG)水平,糖化血红蛋白(HbA1c)水平,以及尿albumin-creatinine比率(ACR)在8到12周的年龄测定。尿为24小时用代谢笼收集的样本(鼠标代谢笼,克丽日本)。尿白蛋白肌酐水平和免疫测定(DCA 2000系统;拜耳诊断,埃尔克哈特)。血糖水平的血液从retro-orbital窦获得测量使用Glucocard计(京都第一核电站Kagaku,京都,日本)。糖化血红蛋白水平也是衡量一个免疫测定(DCA 2000系统)。血压测量的脉冲传感器系统(Softron bp - 98 a,东京,日本)。标准偏差小于5.0 (SDs)被用来定义的血压水平,如前所述[4,19]。

2.3。实时PCR MMP-2, MMP-9、TIMP-1 TIMP-2,纤连蛋白、IV型胶原,MCP-1, (Pro)肾素受体的表达

RNA提取从snap-frozen肾皮质使用RNeasy迷你包(试剂盒KK,东京,日本)。RNA是使用随机reverse-transcribed decamer引物(美国Ambion、奥斯汀、TX)和MMLV逆转录酶(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。TaqMan执行实时PCR和分析根据制造商的指示(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。测量基因表达在每个组织部分,使用执行实时PCR引物提供的商用化验所得应用生物系统公司(MMP-2: Mm01253624 _m1, MMP-9: Mm00600163 _m1, TIMP-1: Mm01341361 _m1, TIMP-2: Mm00441825 _m1,纤连蛋白:Mm01256744 _m1, IV型胶原蛋白:Mm01210125 _m1, MCP-1: Mm00441242 _m1, (Pro)肾素受体((P) RR): Mm00510396 _m1,和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH): Mm99999915 _g1)。每个测量重复了四次。相对mRNA水平GAPDH样本归一化的内容。

2.4。MMP-2免疫组织化学染色,MMP-9、TIMP-1 TIMP-2, F4/80

老鼠在8到12周的年龄被杀。免疫组织化学和低温恒温器进行肾脏部分(3m)如前所述4]。低温恒温器肾脏部分(3米)被风干了10分钟,然后固定在冷丙酮10分钟。非特异性染色被孵化与生物素亲和素20分钟,然后20分钟使用avidin-biotin阻塞工具包(向量实验室,Inc .,伯林盖姆、钙、美国)。内源性过氧化物酶活动被孵化抑制甲醇含3% H₂O₂10分钟。部分被孵化主要抗体(Abs) 20%正常山羊或兔血清,2%牛血清白蛋白在一夜之间在4°C。主要的抗体(Abs)如下:山羊多克隆anti-MMP-2 Ab(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国),山羊多克隆anti-MMP-9 Ab(研发系统,Inc .),兔多克隆anti-TIMP-1 Ab (Abbiotec LLC,圣地亚哥,美国),兔多克隆anti-TIMP-2 Ab (Abbiotec, LLC)和鼠单克隆anti-F4/80 Ab (MAC497GA;Serotec,英国牛津大学)。与二次孵化的部分抗体。二级Abs如下:一个抗体免疫球蛋白(美国Dako Carpinteria, CA), anti-rabbit免疫球蛋白(向量实验室,Inc .),或anti-rat免疫球蛋白(Cosmo生物有限公司、东京、日本)。的部分与peroxidase-conjugated孵化链霉亲和素抗体(Dako),和3,3-diaminobenzidine接着说了5分钟之后,幻灯片和苏木精复染色。至少10肾小球的染色每个鼠标量化使用ks - 400版本4.0图像分析系统(ks - 400;卡尔蔡司的愿景,德国慕尼黑)。阈值计算如下:中值之和的光密度在每组/组的数量。 The number of F4/80-positive cells was counted in 10 randomly selected fields。分析由两个调查员蒙蔽的方式(4,20.]。

2.5。免疫印迹分析p-p38、p-ERK1/2 p-SAPK /物的表情

肾皮质的部分样本的均质裂解缓冲包含一个完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏诊断,曼海姆,德国),1毫米的氟化钠,1毫米原钒酸钠(Sigma-Aldrich,路易斯,密苏里州,美国)和离心机。适当的上层清液(20卷g / lane)与同等体积的混合样品缓冲(312.5 L Tris-HCl更易,pH值6.8,10% SDS、50%甘油、10% 2-mercaptoethanol,和0.025%溴酚蓝)。进行了sds - page凝胶电泳和免疫印迹分析根据标准协议和可视化使用增强化学发光免疫印迹检测试剂盒(ECL ' Amersham生物科学,白金汉郡,英国)。主要的抗体使用如下:总p38磷酸化p38,总Erk1/2磷酸化Erk1/2,总SAPK-JNK,磷酸化SAPK-JNK(1: 1000年,细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,妈,美国)。杰克逊HRP-conjugated第二抗体(免疫研究实验室、西树林,PA,美国)被用于这项研究。浓度测量了las - 3000图像系统(富士胶片、东京、日本)。

2.6。测量NF -κB激活

核从肾皮质中提取得到使用核提取工具包(活动主题、东京、日本)如前所述[5]。NF -κ使用NF - B激活测量κB转录因子分析工具包(活动主题)根据制造商的建议。NF -κB激活使用分光光度计测量一式三份(分子器件光谱Max 340 pc,桑尼维尔,美国)OD450。

2.7。统计分析

数据被表示为。统计差异意味着使用Bonferroni测定t以及。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。生化参数

没有明显差异在BW的基线值,SBP光纤光栅,糖化血红蛋白,ACR之间的汽车和aliskiren-treated KK老鼠在8周的年龄。然而,这些参数除了vehicle-treated KK - SBP老鼠远远高于那些vehicle-treated KK小鼠(表1)。

小鼠的生化参数的结果结束时四周实验协议如表所示1。BW,糖化血红蛋白水平,acr vehicle-treated KK -老鼠比vehicle-treated KK小鼠更高。然而,光纤光栅水平和SBP vehicle-treated KK小鼠和vehicle-treated KK之间没有差别老鼠。在aliskiren-treated KK - SBP老鼠明显低于那些vehicle-treated KK -老鼠,在整个治疗。acr的aliskiren-treated KK -老鼠明显低于那些vehicle-treated KK -老鼠;但是没有统计上显著的变化在BW,光纤光栅的水平,和糖化血红蛋白水平之间的汽车和aliskiren-treated KK老鼠。

3.2。实时PCR分析MMP-2 MMP-9、TIMP-1 TIMP-2,纤连蛋白、IV型胶原,MCP-1, (P) RR表达在肾脏

MMP-2、MMP-9 TIMP-1、TIMP-2 MCP-1,纤连蛋白、IV型胶原,MCP-1,和(P) RR mRNA表达在肾皮质组织显著增加在4的价格相比组1组,2和3 (;数据1(一)- - - - - -1 (h))。Aliskiren治疗(5组)减毒这些信使rna表达的增加,导致一个表达式类似于控制KK小鼠(组2)(;数据1(一)- - - - - -1 (h))。

3.3。免疫组织化学分析MMP-2, MMP-9、TIMP-1 TIMP-2, F4/80表达在肾脏

MMP-2(图2(一个))和TIMP-2(图2 (d)在肾小球)观察表达,特别是在系膜区。MMP-9(图2 (b))和TIMP-1(图2 (c)在近端小管局部)表达式。MMP-2、MMP-9 TIMP-1, TIMP-2蛋白质积累显著增加在集团4相比,在组1,2,3 (;数据2(一个)- - - - - -2 (d))。他们的表达显著抑制aliskiren治疗组(;数据2(一个)- - - - - -2 (d))。F4/80-positive在近端小管细胞被本地化。每1000年F4/80-positive细胞的数量米²在4组显著高于组1、2和3 (;图3)。这些数字在aliskiren显著降低治疗组(;图3)。

3.4。免疫印迹分析p-p38、p-ERK1/2 p-SAPK /物肾脏

检查的影响aliskiren在肾脏KK - MAPK活性小鼠、免疫印迹分析(数据4(一)- - - - - -4 (c))。p-p38的蛋白表达,p-ERK1/2 p-SAPK /物在4组显著高于组1、2和3 (;数据4(一)- - - - - -4 (c))。他们的表情明显抑制aliskiren治疗组(;数据4(一)- - - - - -4 (c))。

3.5。分析NF -κ在肾脏B激活

NF -κB活动在4组显著高于组1,2,3,如图5(;图5),aliskiren抑制NF -激活κB (;图5)。

4所示。讨论

本研究首次表明,aliskiren显著改善尿ACR的水平和肾纤维化通过改善炎症和基质金属蛋白酶的变更和/或T2D KK - TIMPs表达式老鼠。

众所周知,糖尿病肾脏RAS途径被激活。MCP-1 Angⅱ增加,移民和分化诱导单核细胞巨噬细胞,然后增加ECM阻力指标纤维化(也许可以生产和3,21]。我们已经演示了巨噬细胞浸润和增加在KK - MCP-1表达式老鼠(3,4]。最近,由于[22)报道,MCP-1可能具有重要的诊断价值在评估肾脏炎症反应的DN。此外,Angⅱ诱导IV型胶原、纤粘连蛋白的积累通过基质金属蛋白酶/ TIMPs系统内的不平衡,从而降低基质蛋白质的降解(16,23]。然而,炎症之间的串扰和基质金属蛋白酶/ TIMPs系统仍然是有争议的。在这项研究中,我们关注MMP-2 MMP-9, TIMP-1, TIMP-2因为这些IV型胶原代谢的主要监管机构,最重要的ECM蛋白质在DN,尽管MMP-2也降解纤连蛋白(24]。

数据表明基质金属蛋白酶/ TIMPs失调和DN之间的联系也存在,但矛盾的。糖尿病啮齿动物模型显示的下降表现MMP-2 [25- - - - - -27]和MMP-9 [28,29日在肾组织。相比之下,表达的MMP抑制剂TIMP-130.,31日]和TIMP-2 [16)增加。在体外,减少和增加MMP-2 [32,33]和MMP-9 [32,34)已经证明当啮齿动物系膜和足突细胞分泌细胞在高葡萄糖条件下培养。相比之下,TIMP-1 [35活动是在系膜细胞在高葡萄糖条件下增加。在DN患者,血清和尿液MMP-2 MMP-9, TIMP-1浓度增加而恶化的肾小球病变(36- - - - - -39]。几个可能的解释可以提出了调和这些差异:(1)动物模型的差异,(2)环境因素的差异(即。体外和体内),(3)不同阶段的DN(肾病的早期或晚期阶段)。本研究首次证明的mRNA表达MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,这些蛋白质的表达明显增加T2D小鼠的肾脏。有趣的是,MMP-2和TIMP-2表达观察肾小球,和他们的表达更加突出比近端小管间质区域。MMP-2和TIMP-2可能主要与肾小球基底膜增厚,系膜基质在这个实验的扩张。有可能至少部分的影响MMP-9 TIMP-1可能由MCP-1系统调制,巨噬细胞浸润主要是观察到的近端小管。相比之下,MMP-2的影响和TIMP-2可能与Ang二世和依赖于肾素不依赖MCP-1和巨噬细胞等炎症介质。虽然我们也试图测量信使核糖核酸或蛋白质水平的il - 6在肾小球和尿液,分别其水平过于微妙的准确检测。然而,MCP-1尿液中检测,尿MCP-1倾向于更低的水平aliskiren治疗后,虽然没有发现显著差异(数据没有显示)。因此,我们认为MCP-1可能最重要的标记DN在此阶段的发展。

Angⅱupregulation被修改酪氨酸激酶和磷酸酶的活性,激活MAPK和刺激转录因子(40,41]。此外,肾素诱发直接(P) RR信号,导致激活MAPK无关的Angⅱ(42- - - - - -44]。Feldt et al。45)报道,血浆肾素活性可被aliskiren管理;然而,直接(P) RR导致MAPK信号激活和(P) RR aliskiren不能抑制基因表达。相比之下,费尔德曼et al。46]表明aliskiren抑制(P) RR体内基因表达。因此,我们试图确定aliskiren可以改变(P) RR基因表达小鼠模型。这些有益的影响aliskiren可能与肾MAPK活性的抑制,这可能是和二世——和/或RR-dependent (P)。我们推测,除了降低系统性BP和阻塞循环和组织RAS系统aliskiren可能有一个antifibrotic行动,可能是由(P) RR如下:抑制(P) RR基因表达可能会降低受体的数量,抑制细胞内引起的纤维通路(pro)肾素和否定receptor-bound肾素活性的增加。因为我们的数据无法显示是否aliskiren抑制Angⅱ(P) RR通路,将需要更多的工作来阐明这个问题。

几个可能的解释这些差异可以调和的结果之间的高度研究和目前的研究。(1)肯定很难比较简单的人体模型的结果与小鼠模型。在我们的小鼠模型中,血清肌酐水平没有增加,虽然尿ACR的水平相对较高(4]。(2)不良事件的血钾过高和低血压等aliskiren单药治疗的观察我们的研究可能是远低于那些aliskiren添加到标准治疗的联合治疗肾素-血管紧张素封锁等高度的研究。因此,我们认为有可能的好处aliskiren单一疗法在糖尿病患者的早期阶段。然而,我们需要进一步研究各种条件下确定aliskiren的可能的好处,因为不像ALITITUDE研究中,我们研究的终点不是终末期肾脏疾病或心血管死亡。

我们研究的主要局限性如下。在这项研究中使用的治疗协议影响血压。因此,aliskiren所带来的益处可能部分源于降压效果。此外,我们没有证明肾的自然基质金属蛋白酶/ TIMPs IV型胶原蛋白、纤连蛋白和晚期才DN MCP-1表达式。然而,本研究的目的是确定细胞因子和基质金属蛋白酶/ TIMPs水平变化在应对高葡萄糖或盎二世和观察aliskiren-induced水平变化在DN的早期阶段。

总之,看来aliskiren减少蛋白尿,抑制糖尿病肾病的肾纤维化。这些效应可能与胶原合成与降解之间的变更的规定,通过激活MAPK和NF -炎症κ通过Angⅱ- B和/或(P) RR-mediated行动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者的构思和设计,分析和解释数据,起草修订纸或批判,批准出版论文的最终版本。雅子古河道和Tomohito Gohda促成了实验工作。雅子Furukawa先生Tomohito Gohda和Yasuhiko Tomino起草了纸和修正后的最严重。

确认

作者感谢诺华制药公司提供aliskiren。他们也感谢r . Mineki博士y小岛,博士,n . Sueyoshi t . Ikegami博士,t . Ikeda和t . Shibata熟练的技术支持。

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