肿瘤抑制基因的转录p53和RB在慢性肾脏疾病患者的淋巴细胞:衰老分子的证据?

文摘

患有肾功能衰竭表现出免疫系统功能受损。我们想调查肿瘤抑制基因的转录p53和RB记录,如果可以刺激这些细胞在体外为了分裂,后的抗原和炎症因素。这个表达式的实时PCR测定外周血单核细胞(PBMCs)从三个不同的组:十个健康个体,十慢性肾脏疾病(CKD),患者和10对晚期肾病透析患者(ESRD)。这些基因的转录率也是衡量PBMCs种植后的四种不同条件下:与培养基,与脂多糖(LPS)、c反应蛋白(CRP)和lipoxin₄(LXA₄有限合伙人。我们的结果表明,在大多数情况下与添加剂培养后,转录水平更高的透析患者相比其他两组。我们的研究结果作为细胞衰老的迹象在分子水平上,而这些细胞似乎不太容易刺激在体外为了复制。

1。介绍

ESRD CKD患者和患有一个受损的免疫反应。根据先前的研究,这人口与慢性炎症密切相关。这连续的炎症状态容易使患者心血管疾病和急性感染性并发症,两个人口死亡的主要原因。尽管适当的药物治疗和/或足够的血液透析,这些组患者的死亡率远高于普通人群和免疫系统的功能障碍似乎扮演了一个关键的角色在许多疾病的发病机制与肾功能衰竭有关(1- - - - - -3]。

肿瘤抑制基因p53和RB可能是最著名的两个和研究基因在这个特定的类别。这些基因控制G1S期细胞周期的过渡是绝对必要的差别及其对这些为了让细胞复制(4- - - - - -6]。每当例如有DNA损伤或基因组不稳定,复杂的分子网络由这两个基因阻止细胞周期为了DNA复制之前修复(4,6]。因此p53被称为“基因组”的《卫报》(4),这两个基因已经被全世界广泛调查的主题。除了控制细胞周期进展,p53也能够诱导细胞凋亡(4,6]。另一个重要功能是,绝大多数的癌症细胞表现出要么关闭,或突变p53和RB基因(7]。

在先前的研究中,我们发现,端粒酶活性,酶提供近乎无限的增殖能力活跃时,是减少外周血单核细胞(PBMCs)透析患者与健康人相比(8]。同时,这个活动与血清TNF -呈负相关人口的集中研究[9]。在目前的研究中,属于肾患者的免疫细胞从不同的角度进行了检查。由于端粒酶,酶处理细胞分裂,在肾功能衰竭不活跃,两个非常重要的基因的转录模式与细胞分裂被确定。三十个不同的个人选择,十从以下类别:健康对照组,CKD患者和ESRD(透析)患者。PBMCs纯化和培养在四个不同的条件:(i)而不添加任何其他因素比培养基用抗生素(平原文化),(ii)的脂多糖(LPS), (iii)的c反应蛋白(CRP)和(iv)有限合伙人和Lipoxin₄(LXA₄)。有限合伙人或内毒素是分子位于革兰氏阴性细菌的细胞壁和有能力促进强烈的炎症反应(10]。c反应蛋白是一种最well-investigated急性期蛋白质,它的主要作用是与胆碱磷酸结合表面表达死亡或垂死的细胞或细菌,为了激活补体系统和巨噬细胞的吞噬作用11]。LXA₄是一种抗炎剂来源于花生四烯酸(12]。

外周血单核细胞是一个多样化的人口主要由淋巴细胞(13]。这项研究的目的是探索任何可能的肿瘤抑制基因的转录差异之前和之后的各种培养条件下,在不同的学习小组。每个个体的炎症状态包括在这项研究是评估的决心白介素6 (il - 6)、il - 10, c反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子-在血清。

2。材料和方法

2.1。患者和健康对照组

人口研究包括三组:十个健康人(正常对照组),十慢性肾脏疾病(CKD) nondialysis患者和10对晚期肾病透析患者(ESRD),接受血液透析一周几次。年龄、性别、肾小球滤过率(GFR)及其他三组的相关数据如表所示1。采访时他/她之前每个人配进行了研究。通过这次采访是定义是否那个人是一个吸烟者,而血糖值> 110 mg / dL在三个不同的测量作为糖尿病的定义。高血压定义通过血压平均值> 140/80 mmHg或抗高血压治疗,为了决定一个人是否患有动脉粥样硬化他/她必须有心绞痛的历史,和/或血管干预,或历史的任何心血管事件(例如,过去的心肌梗死)。纽约心脏协会定义被用于评估心力衰竭的人口研究。CKD组由患者肾功能下降,肾小球滤过率(GFR)下降(从15到60毫升/分钟,肾小球滤过率(GFR)值与Cockcroft-Gault公式计算)不需要透析,透析组包含的患者肾功能完全减少根据透析每周几次。几个月时间的平均值,这些病人已经接受透析会话是63.88(圣Dev。50.47)。在四个病人透析过滤器是由纤维素,而在六名病人使用合成滤波器。在9个透析病人血管访问瘘,和一个病人移植。

2.2。血液样本集合

在所有组15毫升肝素化和5毫升nonheparinized从每个病人收集血液样本,分别PBMCs的准备和血清样本。在血液透析病人,采集标本前的周中透析会话。

2.3。制备PBMCs

PBMCs获得由Ficoll-Hypaque(西格玛奥德里奇Histopaque 1077年,圣路易斯,密苏里州,美国)梯度密度离心30分钟(400克)。单核细胞层被收集在PBS和洗3次,最后四整除包含细胞转移到埃普多夫管。这些细胞在preprepared立即培养瓶如下所述。

2.4。c反应蛋白和细胞因子分析

离心分离血清分离的5毫升non-heparinized血瓶3200 rpm 25分钟。CRP是化验的定量测定particle-enhanced immunonephelometry在贝林浊度计二世(戴德贝林,迪尔菲尔德,伊利诺斯州,美国)。il - 6、il - 10和TNF -血清水平量化与商业夹心酶免疫测定技术基于一对monoclonal-polyclonal抗体(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州。美国)。所有的反应都是根据制造商的说明进行。

2.5。PBMC文化

瓶包含媒介与文化的必要补充preprepared为了细胞放入培养后立即隔离。15毫升聚丙烯圆底管(猎鹰,正欲林肯公园,新泽西州,美国),每个文化调整浓度细胞/毫升RPMI 1640培养基(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)补充heat-inactivated 1%胎牛血清(西格玛奥德里奇),5.000 U /毫升青霉素和链霉素3.000克/毫升。四个文化集包含下列添加剂:(a)控制没有任何添加剂(纯文化),(b)有限合伙人5μ克/毫升(Sigma-Aldrich大肠杆菌0111:B4),人类50 c反应蛋白(c)μ克/毫升(美国马萨诸塞州USBiological, Swampscott), (d)有限合伙人5μ和10克/毫升nmol / L LXA₄(5、6 -Lipoxin (R)开曼化学,安阿伯市,密歇根州,美国)]。LXA₄增加了文化开始后30分钟。孵化持续了24小时在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂,“猎鹰”管放宽限制。在3000 g细胞收集的离心5分钟8°C和储存在−80°C,而上层的被丢弃。

2.6。实时聚合酶链反应

核糖核酸纯化从PBMCs NucleoSpin 96 RNA工具包(Macherey-Nagel GmbH & Co . KG, Duren,德国),根据制造商的指示。RNA逆转录PCR进行纯化和样品上标三世逆转录酶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)作为描述指令的手册。每个样本的细胞用于RNA净化。从孤立的RNA, 11.5μ每个样本被转录和由此产生的cDNA L为实时PCR过程中使用。实时PCR进行SDS系统7300(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。Assays-On-Demand 20 x分析引物和家人dye-labeled TaqMan MGB探针(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)是用来计算的相对表现p53和RB(测定ID: Hs00153349_m1和Hs00153108_m1 resp。)。Predeveloped GAPDH(甘油醛3 -磷酸dehydrogenase-a“管家”基因)TaqMan化验试剂也用于内源控制。循环参数和实验程序的制造商。每个实验在重复执行相同的情况下,为了能够纠正任何可能的错误。为了避免任何偏见,RNA隔离和实时PCR实验同时与多个样本和样本后分类对每个属于的组,每个反应后完成。获得的Ct(周期阈值)值的过程被转移到其他软件(相对表达软件工具,v2.0.7版权2008年,Corbett研究企业。有限公司)相对表达式计算。每个样本重复测试。自从相对量化方法用于基因转录水平的评估,只有一对明智的比较可以。这些比较如表所示2表达的差异,差异因素和统计学意义。术语“差异因素”停留两组之间的基因表达差异。Ct值计算的实时PCR实验分析了其他软件与第一组在每一对总是认为是“控制”组,第二个是组进行测试。这种比较的结果显示了两个条件之间的表达差异。“差异因素”在折叠状态表达式的增加或减少。如果例如结果两组之间的差别是对这些p530.1因子,然后第二组展品下降了十倍p53表达相比,第一组。

2.7。统计分析

从IBM SPSS(美国纽约阿蒙克)所使用的统计软件。血清炎症标记物由一维方差分析进行了分析测试,而实时PCR结果的统计学意义计算通过许多其他软件使用假设检验的随机化技术。

3所示。结果

3.1。炎症

的平均值和统计分析炎症标记以每组如表所示1。只有TNF -在病人被发现显著升高组与健康对照组相比。统计分析(单向方差分析工具)后,TNF -似乎成为提升随着疾病的进展。透析病人比CKD的浓度更高,而对照组观察值最低。

3.2。基因转录

正如之前提到的,评估的基因转录率,相对量化方法,因此,只有对明智的比较可以。这些比较如表所示2。两者的表达状态p53和RB被发现在同一水平在所有三组的细胞后立即净化(文化)之前。从控制样本PBMCs修养后,p53演示表达减少5倍或更高。的表达p53在CKD和透析组在对照组下降低于相应的查看。这是在透析组更为明显,细胞平原文化展示了相同的p53表达细胞之前文化。的表达时也获得了类似的调查结果RB测量完成后每个文化。随着疾病的进展,基因表现出非常高的转录率在相应的文化比p53更明显的方式。透析组的转录状态RB是相同的细胞培养以及在LPS后的纯培养和文化。数据1和2说明上述结果。这些数字是除以组每个样本属于他们的成对比较表中所示的结果2。部分的解释完全2由于使用的相对定量方法,计算一个特定基因的表达只有通过成对比较与特定计算机软件(REST)执行。这就是为什么没有数字数据1和2。酒吧显示之间的差异表达不同的条件和他们的身高并不对应于一个特定的数值。图表是一个可视化的表2。

4所示。讨论

RB和p53是非常重要的肿瘤抑制基因控制细胞周期,表达下调或灭活,以对细胞分裂(14,15]。在目前的研究中,没有转录状态的差异RB和p53在新鲜分离PMBCs(文化)患者和健康对照组。然而,差异完成后观察四组不同的细胞培养与或没有任何添加剂。这两个基因高表达下调健康文化的独立控制条件,而他们更积极转录CKD患者透析组甚至更在各自的文化条件下健康对照组。很可能淋巴细胞可以及时应对环境变化,通过调节基因转录的方式不抑制细胞周期的进展。这是非常重要的对于PMBCs当例如一个传染病必须消除。很大一部分肾患者遭受慢性炎症状态和熊一个免疫功能受损16- - - - - -18]。在这里,我们表明,肿瘤坏死因子-血清浓度增加随着疾病的进展,透析病人表现出最高的TNF -浓度。在同一时间,病人组,特别是透析组表现出调节能力有限p53和RB表达式在体外。两个基因,主要RB证明高转录水平在体外,即使有限合伙人或CRP。这些非常重要的肿瘤抑制基因的转录率是一个非常强烈的迹象表明淋巴细胞透析病人已经衰老,一个事实,如果这是真的,禁止这些细胞分裂,甚至在有毒的兴奋剂。

文化包含有限合伙人,30分钟后,抗炎剂,LXA₄是补充道。问题是一个分子,抑制炎症的发展可能会影响这两个基因的转录。在两者中,健康和CKD淋巴细胞,LXA₄文化产生的转录率更高p53和RB在同一组,而相反的是透析组中观察到。仅在有限合伙人的存在,PBMCs两组从第一个表达下调RB和p53,可能是因为他们认识到威胁环境,他们应该成为活化和增殖,以消除它。透析组,有限合伙人文化表现出两个基因的转录率更高,LXA相比₄文化,表明这些免疫细胞不能正常反应在存在有毒因子,免疫系统功能障碍的迹象,透析组中观察到。

p53在细胞水平不接受任何形式的压力保持低通过连续降解过程19]。在这里,我们表明,p53展品同样的转录水平在所有三组的人口研究。如果我们假设健康细胞是不重读的细胞,然后每一个细胞都在展览之前文化条件相同,“轻”转录水平。尽管转录”文化”是稳定的文化实验后的差异是巨大的。虽然这是更加明显RB的转录,也可以看到p53的年代的情况。一个不能轻易忽略的事实,虽然健康的纯培养细胞表现出减少的表达p53,透析纯培养细胞表现出完全相同的表达水平。换句话说,很有可能表达的p53成为管制随着疾病的进展。当然我们不知道到底是在蛋白质水平,但是我们现在的证据无法轻易忽略。这些结果不作为强有力的证据证明我们的假设,但他们显然成为困难的迹象。一个人不能轻易监督透析细胞表现出高的事实p53转录水平即使文化,这意味着更多的p53蛋白生产相比,在相同的条件下健康细胞。它还必须指出,免疫印迹实验没有进行,因为我们主要是想“一瞥”信使rna,而不是这些病人的蛋白质水平,因为我们有预算问题。不过,这很有可能,我们将把这些方法在未来的实验中。

正如之前提到的,有很多科学报告显示,透析病人的主要问题是慢性炎症。的这个组患者死亡的主要原因是例如心血管疾病,可引起慢性炎症和/或加速。慢性炎症状态明显通过促炎细胞因子(il - 1升高β、il - 6、TNF -等)或升高急性期蛋白(c反应蛋白,白蛋白,fetuin-A等)(20.- - - - - -23]。虽然没有任何统计血清il - 6的浓度差异,il - 10,和c反应蛋白,发现TNF -成为提升随着病情的发展是非常重要的,不容忽视。它还必须指出,没有明显的统计相关性的年龄,性别,吸烟,糖尿病,高血压,等等和/或任何血清标记物的浓度(数据未显示)。在这项研究中,我们展示了强有力的迹象表明,免疫系统细胞来自患者肾功能衰竭失去可塑性调节两个重要基因的表达中扮演关键的角色在细胞周期的进展。这种慢性炎症状态是归咎于这个障碍?这个问题无法回答在此但这场景是合理的。肿瘤坏死因子-刺激淋巴细胞增殖和分化的威胁时出现在他们的环境24,25]。很可能这个常数刺激导致这些细胞变得疲惫和衰老。如果其他鼓励世界各地的实验室研究调查更彻底地CKD分子机制的免疫系统障碍我们很快就会发现这些复杂的分子途径。

慢性炎症和免疫系统功能障碍被评估为主要因素在慢性肾病的发病机制和结束阶段肾脏疾病(透析病人),导致在这些人群中观察到的高死亡率。有一些研究表明,细胞衰老的出现在PBMCs孤立从透析病人17,26]。这背后的主要思想研究调查两个“经典”肿瘤抑制基因为了看肾病和/或炎症会影响他们的表情。既然不是很多研究已经发表在这个问题上,我们认为这是第一个步骤中发现如何以及在什么程度上肾功能衰竭与炎症和细胞周期有关。当然更要实现这一目标所需的研究,但我们的研究结果是固体,提供强有力的迹象表明,一些适当的进展是错误的淋巴细胞的细胞周期患者的肾功能衰竭。我们唯一的希望是,我们的研究将为其他科学家提供实质性的动机是为了引发调查这些分子途径。在本文,它已经表明,PMBCs CKD和透析病人无法调节p53和RB基因转录作为应对环境变化。这个证据在肾患者的淋巴细胞衰老的分子是一种进一步的调查,以澄清原因相应的免疫系统障碍。如果最后常数炎症是根本原因在防御系统的障碍,那么必须纳入适当的和有针对性的抗炎治疗肾患者的治疗。

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