文摘
本研究采取的模式和抗菌素耐药性质粒指纹共生体大肠杆菌与黎巴嫩的肉鸡。为此,总共30大肠杆菌分离收集来自15个半开的肉用鸡农场从黎巴嫩北部和贝卡谷地。结果表明,所有的隔离都耐至少九18评估抗菌药物。表现最好的家庭碳青霉烯抗生素(Imipenem)和喹诺酮类(环丙沙星、诺氟沙星)只有8.3%和0.0的分离株耐药,分别。15个不同的质粒资料描述,所有的隔离被发现拥有一个或多个质粒。质粒大小从1.2到21.0 kbp,和最常检测质粒大小是5.7 kbp隔离的(23.3%)。之间没有明显联系每个孤立的质粒数和抵抗某种特定的药物的影响。然而,特定的质粒的存在,即2.2或7.7 kbp大小的,分别为喹诺酮类或甲氧苄氨嘧啶耐药性密切相关。7.7和6.8 kbp阿米卡星耐药性质粒显示轻微的相关性,和5.7 kbp Piperacillin-Tazobactam耐药性质粒是温和的联系。我们的发现强调了需要修改的列表当前使用的抗菌素在黎巴嫩家禽和关联特定的质粒抗菌素耐药性的存在模式大肠杆菌隔离。质粒也透露任何未来家禽疾病暴发的流行病学调查。
1。介绍
越来越多的耐多药率(MDR)细菌构成严重的经济威胁的动物生产部门和对公共卫生产生重大的影响。常用抗生素耐药性增加主要是由于抗菌药物治疗疾病的混乱的利用率和促进农场动物的生长1,2]。暴露于抗生素的各种团体会导致抗力移转,和抗生素抗性基因可能传播细菌通过水平基因转移(HGT)。共生的细菌对抗菌药物的耐药情况,等大肠杆菌,同样重要的是他们构成一个水库和向量的阻力3,4]。当大肠杆菌细菌在抗生素的存在压力,他们被迫开发替代的方式生存和生长在有害的环境中。这就是为什么阻力大肠杆菌一直在增加速度在牲畜隔离比在人类临床分离株(5]。
事实上,大肠杆菌通过高度,获得基因赋予抗广谱头孢菌素、碳青霉烯,氨基糖甙类、氟喹诺酮类原料药、大环内酯类等抗生素类。最近几项研究已经表明,收购阻力可能是由染色体编码或plasmid-mediated基因的细菌。更具体地说,质粒是多药耐药性的传播的主要矢量通过高度6,7]。质粒携带抗性基因可以在细菌之间互换转移在相同或不同的物种,属接合和自然转换(7]。因此,治疗大肠杆菌感染已经复杂化的出现和传播plasmid-mediated耐氟喹诺酮类原料药、氨基糖甙类、广谱头孢菌素、多粘菌素、磺酰胺类,四环素等。6,8]。
几项研究已经确定了耐多药大肠杆菌在黎巴嫩与家禽。他们还报告说大肠杆菌来自畜牧业是一个主要的生物污染物的黎巴嫩海洋环境和水资源用于灌溉和饮用。在大多数的研究中,基因分析的主要工具是(1)终点PCR,即选择目标基因,和(2)测序9- - - - - -19]。虽然说技术是非常具体的,质粒指纹图谱(分析)提供了一个相对简单的分子类型设置成本较低的方法,提供了一个更实用的工具作用的洞察力的质粒抗生素耐药性的传播大肠杆菌,其他细菌(7,20.,21]。然而,质粒的效用分析取决于多个因素,如质粒模式的变化在一个物种,plasmid-free隔离的频率,质粒的稳定性和重现性的质粒模式(22]。
本研究描述了抗菌素耐药性的三十共生的模式大肠杆菌选择孤立隔绝黎巴嫩肉用鸡农场和特征,第一次,他们的质粒指纹。这也决定了抗菌素耐药性质粒的概要文件之间的关系和具体的模式大肠杆菌隔离。此外,本文中的数据提供基线数据,将提供任何在未来进行流行病学研究。
2。材料和方法
2.1。的集合大肠杆菌隔离
总共30大肠杆菌分离收集来自15个半开的肉用鸡农场两名黎巴嫩地区之间的分配,即北黎巴嫩和贝卡。肠道病态样本或死禽获得无菌,切开,用无菌生理盐水冲洗(氯化钠0.9%)。铂环量的肠道粘膜刮的示例是隔离MacConkey琼脂(Scharlau 02 - 418;Scharlau化学有限公司,Barcelona, Spain) and incubated at 37°C for 24 h. Suspected大肠杆菌在另一个MacConkey板隔离进一步亚文化。乳糖发酵隔离被确定为大肠杆菌生化鉴定过程使用分析概要文件索引后20 e (API 20 e)工具包肠杆菌科。确认大肠杆菌隔离是保存在三糖铁琼脂(TSI;Oxoid有限公司贝辛斯托克,英国汉普郡)偏−80°C,直到进一步的分析。
2.2。抗菌药物敏感性试验(AST)
大肠杆菌隔离被接种到5毫升的胰蛋白示磷酸肉汤(图则;Oxoid有限公司贝辛斯托克,英国汉普郡)和孵化37°C到日志阶段了。日志阶段被发现每当细菌悬液的浊度在“匹配的麦克法兰标准# 2氯化钡悬挂。100毫升水中的细菌悬液的数量然后传播到Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯,Oxoid有限公司、贝辛斯托克汉普郡,英格兰)(23]。抗菌磁盘(Oxoid有限公司贝辛斯托克,英国汉普郡)用于研究氨苄青霉素(AMP-10μg),阿莫西林(AMC-20μPiperacillin-Tazobactam (tzp - 100 g)μg)、青霉素g (PG-10U)、头孢西丁(CTX-30μg),头孢菌素(KF-30μg)、梭链孢酸(FC-10μg), Aztreonam (ATM-30μg), Imipenem (IPM-10μg)、环丙沙星(CIP-5μg),诺氟沙星(NOR-10μg)、甲氧苄氨嘧啶(TM-5μg)、磺胺甲恶唑(stx - 23.75μg),四环素(T-30μg)、红霉素(e15汽油μg)、阿米卡星(AK-30μg)、庆大霉素(GM-30μg)、克林霉素(CD-2μ克)。一夜之间,盘子被孵化的37°C,和抑制带随后被观察和记录。解释图表是用来确定的易感性大肠杆菌孤立的每个测试基于记录的抑菌圈直径的抗菌素。
2.3。质粒分析
的质粒分析大肠杆菌隔离执行按Lonkar描述的方法等。24]。简单地说,大肠杆菌隔离在日志收获阶段从5毫升图则文化在2000转离心10分钟。颗粒resuspended于300年μl冷溶液(10更易·l−1EDTA, 50更易·L−1三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,100μg·L−1核糖核酸酶A)和转移2毫升容量微型离心机管和涡为1分钟,最大速度。300年μl的解决方案二(0.2摩尔·l−1氢氧化钠,1% SDS)补充道。5分钟后,300年μ三世(2.55摩尔·l l的解决方案−1醋酸钾,pH值4.8)补充道。管离心机在1000015分钟。上层清液被转移到第二个微型离心机管,与600年和蛋白质提取μ的混合物25 l: 24: 1 (v / v) phenol-chloroform -异戊醇。温柔的震动后,混合物在室温下离心5分钟在10000年 。白色蛋白质界面上方的水相收集到一个微型离心机管,和质粒DNA和一个体积的异丙醇沉淀,颗粒状,在4°C离心10分钟15000 g。异丙醇是小心地删除和DNA丸是干的。质粒DNA溶解在TE缓冲由20μ10 l更易·l−1三、1更易·L−1EDTA pH值7.5。DNA检测1%琼脂糖凝胶电泳在80 V 2小时。每个质粒的kbp长度决定使用一个软件的数量(BioRad)。
2.4。统计分析
皮尔逊相关性是用来测试的线性关联的重要趋势大肠杆菌抗菌素耐药性质粒数和在95%置信区间,利用SPSS诉25系统软件(SPSS Inc .)。相同的测试是用来评估质粒之间线性关系的强度和方向的具体kbp长度和抵抗抗菌素的评估。有很强的正相关关系是基于决定的价值和皮尔森系数(R),应小于0.001和R应大于0.7。
3所示。结果
3.1。抗菌药物敏感性试验(AST)
在这项研究中,共计30个不同大肠杆菌隔离从肠道收集的样本检索15肉用鸡农场。这些分离株的耐药性测试对18属于10种不同的抗生素主要抗菌类。每个隔离对至少11个不同的抗菌药物的18岁。如图1电阻率最高的记录三个抗菌类,即磺酰胺类,四环素,和大环内酯类(100.0%),其次是头孢菌素(96.7%)、Monobactams(90.0%)、青霉素(83.3%)和氨基甙类抗生素(81.7%)。阻力最小的速度观察对氟喹诺酮类原料药(5.0%)和碳青霉烯(0.0%)。当单独来看,最好的活性抗生素Imipenem,诺氟沙星、环丙沙星的大肠杆菌电阻隔离展出0.0、3.3和6.7%,分别在最活跃的青霉素G,头孢菌素,梭链孢酸,磺胺甲恶唑、红霉素、四环素艮他霉素和克林霉素100.0%大肠杆菌电阻(表1)。
3.2。与抗菌素耐药性质粒分析及其相关
至少有一个质粒被发现在所有大肠杆菌孤立在这个研究。百分之三十六的分离有一个质粒,33.3%拥有两个。其余展出3(10%)、4(13.3%)、或5(3.3%)质粒。质粒描述显示的长度在1.2和21.0之间变化kbp(表2),最常检测质粒分离株(23.3%)有一个5.7 kbp的大小。总的来说,15个不同质粒检测如表所示2和图2标签1到15。
值得注意的是,即使是相同的隔离抗菌素耐药性质粒概要文件并不总是展示相同的模式,因为它是孤立的情况下1和隔离2,3,4。同样适用于隔离15到19,有相同的质粒指纹档案,然而只有隔离18和19个类似的抗菌素耐药性模式相比其他人(隔离15、16和17)。此外,尽管质粒的多样性配置文件记录,所有的大肠杆菌9个不同的抗生素有耐药性隔离,即氨苄青霉素(AMP),头孢菌素(KF)、磺胺甲恶唑(SMX),四环素(T)红霉素(E)、梭链孢酸(FC)、庆大霉素(GM)、青霉素G (PG)和克林霉素(CD)。
抗菌素耐药性概要文件没有相关质粒的数量检测的共生体大肠杆菌这一研究获得的隔离(R=−0.231, )。此外,大多数检测质粒不显著相关抗抗生素在任何特定的评估的。最重要的是,几个质粒表现出强烈的或轻微的关联到特定的抗菌素耐药性(表3)。例如,耐氟喹诺酮类原料药(CIP也)是2.2 kbp质粒的存在密切相关(R= 1, )虽然抵抗TM是7.7 kbp质粒的存在密切相关(R= 0.882, )。另一方面,反对AK温和相关的6.8或者7.7 kbp质粒(R= 0.363, )。一个质粒也温和TZP阻力有关,即5.7 kbp的R值为0.471 ( )。
4所示。讨论
迅速激增细菌抵抗抗生素的发展是一个重大关切和公共健康利益的问题。事实上,过度使用抗菌药物在畜牧业的主要贡献者之一全球耐药菌株的出现,使用抗生素作为生长促进剂治疗治疗和饲料添加剂。惊人的这一研究获得的结果没有异常。事实上,所有的共生体大肠杆菌隔绝肉鸡在这个工作是耐多药(MDR)细菌对抗生素产生抗药性,这意味着他们是属于至少三个不同的抗菌类(25]。这反映了连续过度使用抗生素的有害影响家禽部门在黎巴嫩包括氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、红霉素、强力霉素。我们同意丰富研究成果可耐多药细菌隔绝黎巴嫩家禽。例如,许多作者(10,12- - - - - -14,16]报道共生体的阻力大肠杆菌隔绝肉鸡对青霉素、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、左氧氟沙星,Doripenem,头孢克肟,庆大霉素,卡那霉素、链霉素、四环素、磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶等抗生素。值得注意的是,同一作者还记录了一个频繁细菌耐氟喹诺酮类原料药(CIP也),反对这项研究的发现。波动的结果可能与对氟喹诺酮类原料药电阻采集过程的复杂性。众所周知,细菌对喹诺酮类的发展是一个多因素过程涉及的染色体和质粒的起源都是基因(26]。事实上,抵抗的肠杆菌科喹诺酮类需要一个序列的几个突变:(1)单一突变gyrA基因赋予低量水平耐喹诺酮;(2)收购另一个突变氨基酸密码子Ser还是80或84年氨基酸密码子Glu检测帕洛阿尔托研究中心的基因赋予适度耐环丙沙星;(3)第三个突变,第二在gyrA,导致高水平的耐环丙沙星;(4)第四个突变,第二在帕洛阿尔托研究中心,赋予最高水平的阻力(27]。值得注意的是,喹诺酮类,即环丙沙星,发生比例最高(32.5%),死鸡从黎巴嫩市场收集四种抗生素的家庭中,显示在Jammoul和El结束之后的工作28]。这是一个迹象表明,喹诺酮类是最常用的抗生素在黎巴嫩家禽饲养。
所有的隔离都容易Imipenem。类似的结果Mikhayel et al。14)的细菌肠杆菌科家庭隔绝直肠拭子家禽没有表现出抗Imipenem。卡塞姆et al。10报道不一致的易感性大肠杆菌从禽类到碳青霉烯隔离,隔离,抵抗Doripenem携带plasmid-mediated基因(blaCMY-2)在porin-deficient菌株,对碳青霉烯产生了耐药性。缺乏抵抗Imipenem在这项研究和Mikhayel等人的作品。14)可能是暂时安抚被认为,随着粘菌素,最后的一个人感染的抗生素治疗MDR革兰氏阴性细菌(29日]。然而,大肠杆菌抗Doripenem,报道工作的卡塞姆et al。10),可能会提高红旗相比使用碳青霉烯在控制未来的革兰氏阴性细菌感染。
关于质粒,质粒的数量/隔离不同一至五,kbp长度1.2和21.0之间的不同。总共15个质粒轮廓模式记录30共生体大肠杆菌隔离。完美的情况下会显示所有的隔离,有一个特定的抗菌谱剖面将有相同的质粒数量和指纹。然而,质粒的数量/隔离被发现没有显著相关性抗菌素耐药性。有丰富的文献报道相同的研究结果,对抗生素的耐药性有关更多特定的质粒的存在而不是他们的数量30.- - - - - -33]。原因可能是质粒有大量的功能除了生育等抗菌素耐药性质粒(F)、毒力质粒,降解质粒,质粒上校负责生产的细菌素(大肠杆菌素)。也就是说,更多的质粒不会自动带来更高的抵抗抗生素,特别是革兰氏阴性细菌的质粒说已报告(34]。多个电阻的存在在一个质粒或多个质粒在同一个有机体之间的显著相关性也可以解释缺乏质粒和数量大肠杆菌耐药模式(35]。此外,整合子的角色在细菌之间的基因交换其染色体和质粒的采集和传播是至关重要的抗性基因。因此,这些整合子的动力学可能进一步解释缺乏重要的多药耐药性之间的联系大肠杆菌孤立在这个研究和质粒的数量/隔离(36]。值得注意的是,所有的隔离禁止携带至少一个质粒,质粒和plasmid-free之间的耐药模式的比较大肠杆菌隔离。
本研究揭示了一个坚实的存在特定的质粒和阻力之间的关系抗菌剂(年代)。2.2的存在之间的关联度kbp质粒和耐喹诺酮类评估研究(CIP也)表示,就连小质粒可以携带特定阻力模式(37- - - - - -39]。虽然这些小质粒最有可能不是self-transmissible由于缺少共轭基因,其他大质粒的存在可以填补这一缺口,帮助小质粒转移和其他短传播元素(集)水平细菌从一个到另一个40]。本研究也报道了很强的相关性之间的7.7 kbp质粒的存在大肠杆菌和抗甲氧苄氨嘧啶(TM)。几项研究已经TM耐药性有关大肠杆菌隔离大质粒,可能有180 kbp的大小。一个大质粒可以携带抗性基因同时对其他抗生素如氯霉素、四环素、氨基糖甙类,喹诺酮类、磺胺类药8,37]。显然,小质粒将阻力特征对抗生素很少7.7的kbp显示在这项研究中,也是温和的相关AK阻力随着6.8 kbp。实际上,有丰富的文学关联AK阻力大肠杆菌中特定基因的存在小的质粒携带基因编码(少于13 kbp)为阿米卡星磷酸转移酶和adenylyltransferases。此外,尽管小质粒携带很少的基因,它们的存在发挥重要作用在质粒进化过程由移动元素和与其他质粒重组机制导致增加抵抗多种抗生素包括阿米卡星(41- - - - - -43]。哌拉西林/ Tazobactam (TZP)电阻进行了研究大肠杆菌隔离是温和与另一个小质粒有5.7 kbp的长度。一般来说,阻力的主要原因β内酰胺抗生素,包括TZP在内的革兰氏阴性细菌主要是相关的hyperproduction plasmid-mediated TEM-1β-lactamases,生产extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs),生产AmpC酶质粒编码的基因,和Carbapenem-hydrolyzingβ-lactamases [44- - - - - -46]。的plasmid-mediated TZP阻力并不一定决定大质粒的存在,显示在这项研究。这些结果是在协议与哈伯德et al。47)报道,一个小环状DNA约10.9 kbp在TZP-resistant被发现大肠杆菌隔离。说作者透露,大质粒出现在TZP-resistant菌株没有包含任何抗菌素或重金属抗性基因。然而,小环状DNA分子的特征表明,它包含了失踪TZP抗性基因还有几转位因子假定的。
这一研究报告的结果表明存在着强烈的关联特定质粒在共生体之间的联系大肠杆菌家禽和抵抗特定抗生素的分离。然而,这可以进行流行病学监测时也很有用,因此发展战略遏制plasmid-borne细菌耐药性的传播。研究结果可以通过结合的研究已经证实,更好的理解阻力是通过预测抗菌的转移resistance-mediated接合质粒。此外,质粒测序可以公布等关键plasmid-specific函数共轭能力,复制和流动性。这将使本研究报告的质粒的分类成不同的类别根据其系统发育关系和提供洞察plasmid-mediated抗菌素耐药性的流行病学的共生体大肠杆菌孤立的从家禽。
数据可用性
分析所使用的数据集和/或在此研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
商品设计研究,收集和组织数据,进行统计分析,起草了手稿。PA, AG)、HL和你进行实验,收集数据。PA的贡献在数据组织和手稿格式。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
作者感谢农业部的农业与食品学院Sciences-American贝鲁特大学支持这项研究。