文摘

链霉菌属细菌是众所周知的生产生物活性次生代谢产物(普遍存在于不同的栖息地。代谢产物的生物合成链霉菌属受各种因素的影响如生长介质、环境条件、基因调控。本研究旨在探讨不同生长的影响媒体生物质产量和粗提物的抗氧化和酶抑制潜在的获得链霉菌属sp。G-18孤立的尼泊尔从高高度的土壤。最高的干重增长观察R2YE中等(184 mg / L),其次是R5 (144 mg / L), YEME(38毫克/升),和R5M媒体(30毫克/升)。粗提物显示显著的抗氧化剂对自由基的活动。最高的阿尔法淀粉酶抑制观察R2YE介质,和有价值的脂肪酶和观察酪氨酸酶抑制YEME媒介。然而,只有R2YE介质表现出抑制潜在的对弹性蛋白酶和乙酰胆碱酯酶,而粗提取物R5, YEME, R5修改并没有显示任何此类活动。总的来说,我们的研究表明,生物活性次生代谢产物的生产链霉菌属sp。G-18明显受到生长介质的影响。这一毒株可能是一个有前途的来源的酶抑制剂与潜在的应用在制药和化妆品工业。

1。介绍

链霉菌属家庭中,革兰氏阳性细菌属链霉菌科和秩序放线菌目,有显示广泛的生化性质(1]。链霉菌属区别于其他细菌,它不会成为一个典型的细菌杆状的球菌样的形式,而是在丝状或菌丝体的形式。放线菌是独一无二的,它们可以在多种基质生长在土壤、植物包括聚合物如甲壳素、纤维素和半纤维素,以及动物产品,如difficult-to-degrade昆虫(2]。他们不寻常的细菌社区由于在极端环境条件下的生存能力高pH值、高温、水压力(3]。他们可以在几乎任何环境,从深海高山(4]。链霉菌属最吸引人的特点是合成生物活性次生代谢产物的能力,广泛的生化性能如抗真菌、抗病毒药物,antitumoral,降压药,免疫抑制剂,和抗生素(5]。链霉菌属被认为是负责大约三分之一的成千上万的天然抗生素6]。许多次生代谢产物,包括抗生素、生产与形态的区别(7]。链霉菌属的次生代谢物阻碍各种生物过程;链霉菌属压力比其他放线菌菌株的能力来生成一个高生物活性次生代谢产物的数量和种类。这些次生代谢物可能允许的链霉菌属与其他微生物物种竞争,甚至那些相同的属(8]。

链霉菌属在历史上扮演了重要角色的识别重要的生物活性次生代谢产物,比如抗生素,免疫抑制药物,抗癌药物,和其他生理活性的化学物质(9]。不幸的是,在过去的几十年里,可比从陆地和知名的化学品链霉菌属不断被发现。为了找到新颖的具有生物活性的化合物,它有利于寻找有前途的微生物在未知或与不同的隔离过程[underexploited自然栖息地10]。鉴于此,近年来很多努力已经支付的隔离链霉菌属物种的栖息地与更严重的设置,如深海,沙漠,北极,和火山环境。几个代谢物链霉菌属发现有效的抗生素和其他药物的配方。在其他用途,这些代谢物发现有效的生化活动。几个链霉菌属表明酶生产活动(蛋白酶,淀粉酶、脂肪酶、过氧化氢酶、纤维素和天冬酰胺酶)工业的重要性(11]。这些酶被用于制药、衣服、化妆品、纸张、纺织、发酵过程、和污水处理行业(12,13]。此外,一些代谢物链霉菌属追究他们潜在的抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、潜力和几个酶抑制(14]。

重要酶的抑制是一种有效的治疗和管理策略的各种疾病,包括阿尔茨海默病(AD) [15)、糖尿病(DM) [16),和皮肤疾病(17在人类。胆碱酯酶抑制剂,例如,提高大脑中乙酰胆碱含量,增强认知功能在老年痴呆症患者18]。carbohydrate-digesting酶抑制剂(α淀粉酶和α葡糖苷酶)帮助管理糖尿病患者的血糖水平19]。同样,抑制弹性蛋白酶和酪氨酸酶,参与皮肤衰老和色素,是矫正的关键(20.,21]。结果,利用大量合成抑制剂在临床试验中,但是他们的效果是有限的和他们有一些负面影响22,23]。屏幕继续正在努力和创造新型抑制剂从自然资源都是有效和有更少的负面影响。在这项研究中,我们评估了提取物的抗氧化和酶抑制潜力链霉菌属sp。(G-18)种植和提取四个不同增长媒体。

2。材料和方法

2.1。土壤收集和物种隔离

隔离链霉菌属物种、土壤样本来自Gosaikunda Langtang国家公园,Rasuwa、尼泊尔(28.0820°N, 85.4150°E)。链霉菌属物种隔离使用串行稀释技术在一个ISP2媒介使用无菌机(13]。

2.2。化学试剂

这项工作中所使用的化学药品和试剂都是实验室和分析品位。Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2, 2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)联胺盐(abt), 3, 5-dinitrosalicylic酸(DNSA),α-淀粉酶、阿卡波糖4-nitrophenyl丁酸(p-NPB),脂肪酶,奥利司他,l - 3, 4-dihydroxyphenylalanine(左旋多巴),蘑菇酪氨酸酶,曲酸,N-succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN)、猪胰弹性蛋白酶,槲皮素,乙酰胆碱酯酶(疼痛),butyrylcholinesterase (BChE) acetylthiocholine碘,碘化butyrylcholine, 5、5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)(DNTB),美国和加兰他敏从Sigma-Aldrich购买。

2.3。媒体准备和细菌生长的优化

隔离的链霉菌属sp。(G-18)生长在四个不同的媒体(24]。首先是R2YE介质,包括蔗糖(103克)、葡萄糖(10克),5毫升酵母提取物(10%)、MgCl₂(10.12克),K₂所以₄(0.25克),Difco Casamino酸(0.1 g)与蒸馏水800毫升容量。然后,80毫升的最终解决方案是放置在一个250毫升锥形烧瓶和KH 1毫升₂阿宝₄(0.5%),8毫升CaCl₂.2H₂O(3.68%), 1.5毫升L-proline(20%), 10毫升的te缓冲(5.73%;pH值7.2),0.5毫升氢氧化钠(1 N), 0.2毫升的微量元素(ZnCl₂(80毫克),400毫克FeCl₃.6H₂O), 40毫克CaCl₂.2H₂O, MnCl₂.4H₂O, NaB₄O₇.10H₂啊,和(NH₄)₆莫₇O₂₄.4H₂O被添加。酵母提取物麦精(YEME)中含有酵母提取物(3 g),蛋白胨(5克),麦芽提取物(3 g),葡萄糖(10克),蔗糖(340克),和2毫升MgCl₂.6H₂O(5毫米)。最后成交调整到1000毫升的蒸馏水。R5中包括蔗糖(103克)、葡萄糖(10克),MgCl₂.6H₂O(10.12克),K₂所以₄(0.25克),酵母提取物(5克),Casamino酸(0.1 g), te缓冲(5.73 g), 0.2毫升的微量元素(ZnCl₂(80毫克),400毫克FeCl₃.6H₂O)和40毫克CaCl₂.2H₂O, MnCl₂.4H₂O, NaB₄O₇.10H₂啊,和(NH₄)₆莫₇O₂₄.4H₂o .最后成交调整1000毫升蒸馏水。这个解决方案的100毫升Erelnmeyer瓶250毫升,1毫升KH₂阿宝₄(0.5%),0.4毫升CaCl₂.2H₂O(5米),1.5毫升L-proline(20%)和0.7毫升氢氧化钠(1 N)是补充道。R5修改(R5M)中含有葡萄糖(10克),MgCl₂.6H₂O(10.12克),K₂所以₄(0.25克),酵母提取物(5克),CaCO₃(2 g), Casamino酸(0.1 g), 2毫升的微量元素(ZnCl₂(80毫克),FeCl₃.6H₂O(400毫克)),CaCl₂.2H₂O(20毫克),MnCl₂.4H₂O(20毫克),逮捕₄O₇.10H₂O(20毫克),(NH)₄)₆莫₇O₂₄.4H₂O(20毫克)。最后成交调整to1000毫升蒸馏水。

2.4。提取制备及增长分析

的增长链霉菌属sp。(G-18)在不同媒体评估在24小时间隔168小时。总之,从每一个媒体,1毫升的提取物被确定干重和干细菌生长和重复的七天。生长曲线进行了分析通过绘制细菌生长曲线(25]。此外,经过168小时的增长,代谢物提取用乙酸乙酯作为溶剂,使用真空蒸发器干,并用于抗氧化和酶抑制试验。

2.5。抗氧化试验

中提取抗氧化活性的代谢物决心遵循标准2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)和2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)联胺盐(abt)自由基清除化验19]。测量DPPH自由基清除、细菌提取物在不同浓度(10、20、40、60、80和100μg / mL)与0.1毫米DPPH溶液混合在一个比1:3和孵化30分钟的黑暗。使用紫外可见分光光度计测量吸光度是517海里(日本岛津公司uv - 1800)。abt测定,样品1毫升细菌提取物不同浓度(10、20、40、60、80和100μg / mL)是结合3毫升的abt工作方案(abt和酒石酸钾钠的混合物),并允许在黑暗中孕育了10分钟。吸光度的波长720 nm的减少使用紫外可见分光光度计测量。抗坏血酸作为参考对DPPH和abt。此外,methanolic DPPH DPPH实验被用作控制,和methanolic abt是abt用作控制试验。

2.6。α淀粉酶测定

3、5-dinitrosalicylic酸(DNSA)方法被用来确定α-淀粉酶抑制活动(19在200μL每个提取物(20 - 360μg / mL)和3单位/毫升α-淀粉酶(美国Sigma-Aldrich)混合和孵化15分钟37°C。孵化的一个额外的5分钟37°C的200后进行μL 1%的淀粉溶液。这时,一个200μL DNSA的解决方案是添加到它,整个反应混合物加热10分钟在95°C。最后成交调整5毫升的蒸馏水。吸光度的测定λ紫外可见分光光度计= 540海里。结果与阿卡波糖的活动相比,1%二甲基亚砜(DMSO)作为一个积极的控制。

2.7。脂肪酶抑制试验

测量脂肪酶活性的标准方法是适应使用4-nitrophenyl丁酸(p-NPB)作为底物26]。总之,80年μL提取物(10 - 160μ40 g / mL)涨跌互现μL底物溶液乙醇)和80年(10毫米p-NPBμL的脂肪酶酶(2.5毫克/毫升0.1磷酸盐缓冲剂,pH值8.0)。孵化后(20分钟;37°C),吸光度是观察到使用96 - 405 nm标(BioTek时代)。结果与奥利司他和1% DMSO的活动作为一个积极的控制。

2.8。酪氨酸酶抑制试验

l - 3, 4-dihydroxyphenylalanine(左旋多巴)底物被用来确定酪氨酸酶抑制活性(27]。总之,40μL提取物(10 - 160μg / mL)磷酸钾缓冲(0.05 M, pH值6.5)和15μL蘑菇酪氨酸酶酶(500 U /毫升)和孵化27°C 10分钟。然后,通过增加20倍μL(左旋多巴(5毫米),反应的总成交量维持到200年μL通过添加磷酸钾缓冲和孵化一个额外的30分钟。吸光度测量在96 - 492纳米微型板块读者。结果与曲酸的活动。

2.9。弹性蛋白酶抑制试验

N-succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN)底物被用来评估弹性蛋白酶抑制活性,Ellman方法少量修改后(28]。总之,提取的(10 - 160μg / mL)和猪胰弹性蛋白酶(0.05 U /毫升)和50克/毫升AAAPVN和孵化为30分钟25°C。外加0.2 Tris-HCl缓冲区(pH值8.0),最后反应成交量维持在200人μl . 96 -标,吸光度测量在410海里。作为一个积极的控制,使用1% DMSO,结果与槲皮素的活动。

2.10。胆碱酯酶抑制试验

抑制乙酰胆碱酯酶的分析(疼痛)和butyrylcholinesterase (BChE)进行29日]。首先,0.05 U /毫升疼痛或0.5 U /毫升BChE结合提取(10 - 160μg / mL)和孵化25°C,持续15分钟。反应混合物就补充了1毫米acetylthiocholine butyrylcholine碘碘或1.5毫米和0.5毫米的5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)(DNTB)。通过添加0.1钠磷酸盐缓冲剂(pH值8.0),反应的总成交量维持在200人μl .吸光度是确定使用96 -标在412海里。1% DMSO作为积极控制和加兰他敏的活动结果进行了比较。

2.11。统计分析

实验进行了一式三份为每一个分析结果提出了均值±标准差(平均数±标准差)。自由基清除和酶抑制的百分比由计算的值之间的差异决定积极控制和检查提取如下公式所示(29日]。此外,吸光度的抑制浓度为50% (IC₅₀)值的计算是通过线性回归分析的百分比自由基清除和比例的酶抑制。均值的显著差异进行提取分析了单向方差分析(ANOVA),事后图基,在95%置信水平和多重比较检验( )通过使用SPSS版本26。

3所示。结果与讨论

3.1。增长模式

在成长阶段,链霉菌属产生的次生代谢产物,物质不是严格必需的生物生长或繁殖,但可以为其提供一个竞争优势9]。这些代谢产物促进营养细菌细胞通过保护金属如铁(含铁细胞),保护他们免受紫外线辐射(通过着色),挫败竞争对手(抗生素),并鼓励沟通与其他物种(30.]。遗传多样性是由异常大的基因组链霉菌属,这可能是某些其他细菌基因组大小的三(31日]。过去的努力进行了筛选和识别潜在的antibiotics-producing链霉菌属物种多样化的地理位置。我们之前已经确认链霉菌属物种与尼泊尔的高空的一个潜在来源抗菌化合物(13]。在这项研究中,使用了四种不同的媒体(R2YE、YEME R5和R5M)增长链霉菌属sp。(G-18)和评价抗氧化和酶抑制的潜力。我们观察到的莫诺增长模式(32]滞后阶段不同从48到72小时链霉菌属sp。(G-18)指数级的增长直到96小时。静止期从96年持续到120小时,和死亡阶段开始大约144小时(图1)。最大的干重增加了R2YE媒体(184 mg / L),其次是R5媒体(144 mg / L), YEME媒体(38毫克/升),R5M媒体(30毫克/升)。

3.2。抗氧化活动

自由基,特别是活性氧(ROS)导致细胞损伤。异常形成的自由基可能源于内生和外生的新陈代谢。来抵消这些自由基的影响,抗氧化剂产生在人类和其他生物体33]。需要补充抗氧化剂减少ROS水平高的生产和防止有害影响细胞,组织和器官,与各种疾病(34]。在分析提取,我们的结果显示链霉菌属sp。(G-18)生长在R2YE介质最高abt清除功能抑制(IC为82%₅₀= 61±1.5μg / mL),和YEME提取物显示最低的abt清除潜在的抑制(IC为21%₅₀= 370±10.0μg / mL)(表1和图2)。最DPPH自由基清除也观察到R2YE中提取35%的抑制(IC₅₀= 240±7.0μg / mL)。相比之下,R5M中提取并没有显示出抑制对DPPH(表1和图3)。我们的结果符合Kemung等人的研究结果报道链霉菌属sp。音乐在马来西亚14从红树林土壤分离显示显著的抗氧化活动当分析使用abt和DPPH (35]。同样的,链霉菌属sp。MUM212生长在ISP2媒体通过DPPH提取证明显著的抗氧化活性,abt、超氧化物自由基清除,同时金属络合活动的22%,62%,37%和42%分别为4毫克/毫升,(36]。根据我们的研究结果与之前的结果,我们推测,媒介组合中扮演一个重要的角色在一些酶和生物分子的表达管理的活动链霉菌属提取物。

3.3。α淀粉酶和脂肪酶的抑制

分析了酶,α淀粉酶分解糖苷键,释放出葡萄糖。因此,抑制剂α通过碳水化合物代谢淀粉酶有助于降低血糖浓度。此外,肥胖是与异常分解体内脂肪沉积,这是与一些健康问题,如心脏病,癌症,关节炎,高血压,糖尿病37]。因此,制药和食品行业正在寻找天然抑制剂。我们的研究结果的提取链霉菌属sp。G-18生长在四个不同的媒体显示潜在的酶抑制剂,如脂肪酶和α淀粉酶,除了R5M媒介。在四个媒体,链霉菌属sp。G-18生长在R2YE介质显示最高的α淀粉酶抑制抑制(IC为66%₅₀= 130±0.5μg / mL)。然而,R5M介质提取显示最少的抑制α-淀粉酶抑制(IC为51%₅₀= 280±1.0μg / mL)(表2和图4)。YEME表现出最高的脂肪酶抑制抑制(IC 45%₅₀= 157±6.0μ其次是R5和R2YE g / mL)。R5M媒体提取并没有发现抑制脂肪酶(表2和图5)。类似的工作由哈斯和Vittal提供的证据链霉菌属sp。S2A抑制α淀粉酶和α葡糖苷酶与集成电路₅₀21的值μ克/毫升,20μg / mL,分别38]。统计分析(ANOVA)显示显著差异在每个提取物的抑制测量的结果α淀粉酶和脂肪酶酶( )(表2)。在以前的研究中,Cyclipostins所产生的链霉菌属13381年和lipstatin由sp。DSM链霉菌属toxytricini显示抑制对脂肪酶酶(39,40]。我们的工作是第一个对脂肪酶的抑制活性链霉菌属G-18提取生长在不同的媒体。酶提取介质和浓度依赖的抑制模式表明生长介质的重要性选择优化的生化活动。

3.4。酪氨酸酶、弹性蛋白酶抑制

弹性蛋白酶是一种蛋白酶,属于胰凝乳蛋白酶家族,负责弹性蛋白的降解41),一种蛋白质,这种蛋白质存在于细胞外基质(ECM)。预防皮肤老化是至关重要的(自然以及过早)引起的内在和外在因素(42]。寻找有效的弹性蛋白酶抑制剂从自然资源是一个替代商用从化皮肤老化的抑制。在分析四种提取中,只有R2YE介质显示54%弹性蛋白酶抑制(IC₅₀= 140±7.0μg / mL)(表2)。一项研究提取物链霉菌属公里- 2753显示值得注意的弹性蛋白酶抑制(43]。

酪氨酸酶是一种multicopper酶参与杀菌作用和酶促褐变(44]。因此,酪氨酸酶抑制剂可以吸引为脱色剂在化妆品和制药行业,以及在食品和农业行业antibrowning代理。到目前为止,许多自然、半合成和合成抑制剂产生为此使用各种筛选方法(44]。我们的研究显示,所有的分析原油提取酪氨酸酶抑制活性。R5M介质提取酪氨酸酶抑制活性最高,与集成电路₅₀78±2.0的值μ克/毫升(抑制60%)其次是YEME、R5, R2YE中提取(表2和图6)。抑制活动的显著差异的分析提取这些报道之前观察弹性蛋白酶和酪氨酸酶抑制( )。以前的工作报告数链霉菌属提取物对酪氨酸酶的抑制能力。例如,链霉菌属hiroshimensis从土壤中分离TI-C3和显示antityrosinase活动(498 U /毫升)与改进的活动(905 U /毫升)当葡萄糖和麦芽提取物被用作唯一的碳和氮源,分别为(45]。链霉菌属roseolilacinusNBRC 12815开发两个antityrosinase化合物,12815 (IC₅₀= 9米)和B (IC₅₀= 1086),测试对蘑菇和哺乳动物的酪氨酸酶(46]。这些结果支持的潜在应用链霉菌属提取物在化妆品行业与我们强调萃取介质和过程应该考虑。

3.5。胆碱酯酶抑制活动

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统综合征,其特征是异常行为和智力下降(47]。乙酰胆碱的缺乏和butyrylcholine在人类大脑的正常运行是非常重要的neuromediators [48]。抑制疼痛和BChE酶,负责疼痛的水解和BChE神经递质,因此成为广告(的治疗选择49]。生物碱是疼痛的最伟大的来源和BChE抑制剂治疗对广告代理(50]。在我们分析了原油提取,YEME R5M中提取并没有透露任何向胆碱酯酶抑制活性(表2)。此外,只有R2YE介质提取显示疼痛抑制(37±0.3%;集成电路₅₀= 137±1.0μg / mL),只有R5中提取了33±0.9%抑制BChE酶(IC₅₀= 200±4.0μg / mL)。最近的一项研究表明,Geranylphenazinediol所产生的链霉菌属sp。LB173抑制疼痛的低微摩尔的范围(51]。此外,marine-derived链霉菌属sp。UTMC强1334显示的疼痛抑制(52]。另外,从marine-derived chromenone衍生品链霉菌属sp。cnq - 031显示有效的胆碱酯酶抑制53]。疼痛在我们的研究中,一个重要的区别和BChE抑制我们的提取物和参考使用观察( )(表中2)。的选择性链霉菌属应变生产次生代谢产物,对这些酶可能抑制介质的潜在的原因。

4所示。结论

总之,链霉菌属sp。G-18是酶抑制剂的潜在来源的代谢物生产和监管在很大程度上依赖于生长培养基和培养条件。我们观察到R2YE R5的媒介的最合适的介质中,对最优增长和相关的生物活性最高。我们的结果打开可能找到其他主要产生的次生代谢物链霉菌属sp。G-18制药和化妆品工业。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

土壤收集从Langtang许可证国家公园,Rasuwa,尼泊尔,来自美国国家公园和野生动物保护,加德满都,尼泊尔,推荐信号码077/078 eco - 102。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

AGC开展实验室工作,生成的数据,分析数据,准备这份手稿草案,并修正研究。SPP开展实验室工作,生成的数据,分析数据,准备这份手稿草案,并修正研究。三k党开展实验室工作。正义与发展党进行初步的工作。AB进行初步的工作。BPP概念化的研究,验证了数据,修订后的手稿,监督学习。AGC和SPP贡献了同样的工作。

确认

作者感谢大学拨款委员会,加德满都,尼泊尔,对金融支持。我们也感谢美国制药、加德满都大学提供一些实验室设施。这项工作是由大学拨款委员会,加德满都,尼泊尔,FRG-73/74-S&T-10参考号码。