文摘

菠萝种植园离开很多植物在种植季节结束后。丰富的植物菠萝渣原因由于木质纤维素含量高的问题,这是难以自然分解。本研究旨在分离和描述lignocellulolytic microfungi隔离从菠萝种植园。本研究的信息被用作数据准备的培养液诱导菠萝垃圾堆肥的耐压力菠萝种植园的栖息地。结果表明,有11个主要lignocellulolytic microfungi隔离发现从土壤菠萝垃圾和种植园。使用选择性的媒体,选择显示五个纤维素(Bioggp 3、6、9、11和12);五木聚糖(Bioggp 3、6、8、9、12);和两个木质素分解microfungi隔离(Bioggp 2和5)。Bioggp 3、6、9和12是纤维素和木聚糖降解纤维素Bioggp 3显示最高指数(4.0)和木聚糖指数(4.20)。测试表明木质素分解microfungi Bioggp 5隔离有更强的木质素指示器(颜色强度= 4.0和区比1.47)比Bioggp 2隔离。Bioggp 9纤维素分离孢子最高生产率为4.5×10⁸孢子可行性孢子/毫升93.3%,Bioggp 3木聚糖分离孢子生产力最高,达到了2.5×10⁹孢子/毫升89.3%孢子的生存能力。Bioggp 2木质素分解分离孢子最高生产率为1.8×10⁹孢子/毫升,但Bioggp 5显示孢子可行性最高的98.0%。

1。介绍

收获菠萝植物会产生巨大的菠萝叶浪费。丰富的菠萝浪费问题由于有机废物的积累,从而破坏土地肥力的平衡如果不迅速分解。菠萝皮含有23.39%的纤维素、半纤维素42.72%,木质素(4.03%1]。此外,菠萝的线条有28.53%的纤维素、半纤维素24.53%,木质素(5.75%2]。

纤维素组件在菠萝浪费不容易降解,化学和机械,因为纤维素结晶和不溶解的性能源于其线性结构(3]。实质上,木质纤维素是地球上最丰富的天然材料,大约50%的生物质,据估计每年产生1815亿吨。目前使用的82亿吨,从专门的农业生产约70亿吨,草地和林地,另一个12亿吨来自农业残留物(4]。这是一个巨大的游泳池的有机碳5]。这些废料可以从负债在资产(6,7]。生物体利用木质纤维原料的碳和能源可以利用这些废物转化为产品对人有益。因此,本研究旨在获得lignocellulolytic microfungi作为诱导物剂能够分解菠萝浪费。

Lignocellulolytic microfungi产生Lignocellulolytic酶,主要构成一大群细胞外蛋白质,包括木质素分解酶(氧化物酶和氧化酶类)和水解酶(多种纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶、甘露聚糖酶)(8]。本研究孤立和特征lignocellulolytic microfungi隔离从菠萝种植园。表征进行了隔离,有能力生产纤维素,木聚糖、木质素分解酶定性。此外,每个隔离观察孢子生产力,生存能力,增长能力在酸性条件下,温度高于室温,除草剂1%。

这个特征数据是重要的其他研究的基础准备额外的培养液诱导菠萝垃圾的堆肥。字符为接种体的选择是基于生境堆肥将被应用。楠榜的菠萝种植园,印尼有酸老成土土壤类型、温度超过30^ᴏC,除草剂残留。这些因素可能会干扰土壤真菌的生长。除草剂干涉真菌生长包括孢子萌发的抑制,抑制菌丝的线性扩展的速度,和异常的孢子产量的增长的习惯和模式。此外,一些除草剂更fungitoxic [9]。

因此,可以认为堆肥的潜在真菌培养液时,他们可以选择在这些不同的压力条件下能够生长。的分解活动时土壤中的真菌可能会继续选择fungi-induced堆肥应用biofertlizers菠萝种植园。

2。材料和方法

2.1。材料

隔离进行了使用菠萝垃圾材料取自菠萝种植园的PT(伟大的大菠萝,Terbanggi大的,楠榜,印度尼西亚)。隔离是由直接隔离技术结合湿室(图方法1)。湿室隔离技术首先要求垃圾混合物被削减±2厘米大小,然后放入培养皿中包含无菌组织和蒸馏水浸泡一个晚上,然后蒸馏水被丢弃,但必须维护湿室的湿度。然后,观察了每天看到出现的真菌。每个真菌的孢子出现了由直接转移法通过触摸被管的顶端,所以出现的真菌孢子被转移到PDA媒体直到获得纯培养。被编码获得的真菌隔离,确保没有类似的隔离,隔离首次在显微镜下观察其形态(10]。

识别过程是由微观和宏观观察。宏观观察是由观察菌落的颜色和表面的殖民地。显微镜的观察进行了滑文化标本使用方法在文献[10]。识别是由观察真菌分离株的形态的基础上,识别关键引用和比较他们的书。

2.2。隔离和选择Cellulose-Producing和有辱人格的Microfungi

隔离cellulase-producing microfungi被稀释而直接进行电镀的方法(10]。降解纤维素的选择microfungi隔离是由他人修改刚果红法记者(11]。分离获得在纤维素琼脂培养(5.0 g,纤维素纳米₃1.0 g、K₂HPO₄1.8 g, MgSO₄.7H₂O 0.09 g、氯化钾0.5克、酵母提取物0.5 g,酪蛋白水解物0.5 g,琼脂20 g, 1 L蒸馏水)。确认cellulose-degrading能力的真菌分离株是由纤维素琼脂上裸奔。双分子层媒体利用,PDA(1/5配方、琼脂1.5 g和100毫升蒸馏水),底层1所示。

2.3。分离和筛选Xylan-Degrading Microfungi

分离获得microfungi木聚糖的培养基培养(1 g从山毛榉材木聚糖,5 g蛋白胨,5克酵母提取物,0.2 g K₂HPO₄,20 g琼脂,1000毫升蒸馏水)[11- - - - - -14]。确认xylan-degrading能力的真菌分离株是由xylan-enriched媒体上裸奔。双层媒体使用,以PDA为底层(1/5食谱,琼脂1.5,100毫升蒸馏水)。顶层由木聚糖从山毛榉材的1%琼脂1.5,100毫升蒸馏水。一旦接种microfungi中间测试的媒体,文化是培养4天。媒体被添加0.1%刚果红和允许在室温下站了20分钟。媒体被洗1 M氯化钠(左一夜之间,如果有必要的话)。隔离生产木聚糖酶周围形成了一个光环(清除区)殖民地。刚果红的使用作为一个指示器的木聚糖降解琼脂培养基为基础提供了一个快速、敏感的木聚糖microfungi的筛检试验。xylan-degrading潜在的积极隔离也是定性估计计算水解能力,这是清理区域的直径的比值和殖民地15]。

2.4。分离和筛选Lignin-Degrading Microfungi

真菌隔离孤立在B和K(博伊德& Kohlmeyer)介质(10 g葡萄糖,2 g蛋白胨,1 g酵母提取物,18 g琼脂和1 L aquadest) (11- - - - - -13,16]。seven-day-old隔离被切成10毫米直径从文化和中间部分转移到定性筛选媒体(guaiacol-supplemented包含10 g葡萄糖琼脂,2 g蛋白胨,1 g酵母提取物,18 g琼脂和4毫米的愈创木酚1 L水)(17]。接种板块在25°C在黑暗中孵化七天。产生强烈的棕色,真菌菌落周围视为阳性反应产生的愈创木酚氧化(18]。

2.5。表征Lignocellulolytic Microfungi

特征包括真菌产生孢子的能力和他们的生存能力在不同的pH值、温度、和除草剂的压力条件。孢子生产率计算从14-day-old隔离种植用连续稀释方法选择性的媒体。孢子可行性计算的CFU值通过使用PDA上倾注平皿法。然后,隔离的特征是由日益增长的低pH值3、4和5以及温度高于室温(30°C, 35°C, 37°C)。另外,真菌生长也观察到媒体的1%除草剂(ametryne和敌草隆)。methylthio-s-triazine Ametryne,除草剂和较慢的降解路径并提供更长时间的除草活性。敌草隆的贸易名称3 - (3,4-dichlorophenyl) 1, 1-dimethylurea (DCMU) arylurea类的杀藻剂和除草剂抑制光合作用。这种除草剂抑制真菌的生长,和希望真菌耐可以获得。

3所示。结果与讨论

隔离和酶活性的结果测试隔离的菠萝种植园microfungi如表所示1。隔离使用选定的媒体在生物质材料的基质和土壤菠萝种植园取得11隔离列为lignocellulolytic隔离。的定性观察真菌酶活性通过查看是否存在明确的区(±),而定量观察活动通过观察酶指数(表2- - - - - -4)。

几个隔离展示积极的测试结果表明,周围明确区形成的殖民地视为孤立产生的纤维素酶在琼脂媒体(Bioggp 3、6、9、11、12)。木聚糖microfungi选择显示五个microfungi隔离(Bioggp 3、6、8、9、12)能降解木聚糖。两个隔离积极生产酶降解木质素(Bioggp 2和5),棕色的形成所示在底部和周围的殖民地。数据还显示,有许多隔离显示两个酶的能力,即纤维素和木聚糖,包括Bioggp 3 (曲霉属真菌sp。1), Bioggp 6 (曲霉属真菌sp。2), Bioggp 9 (青霉菌sp)和Bioggp 12 (拟青霉属sp)。Lignocellulolytic microfungi经常有各种各样的胞外酶,因为microfungi能够降解木质纤维素基质成更简单的组件。他们有两种类型的细胞外酶系统:水解和木质素分解系统,这是非常有效的。两个系统产生的纤维素酶、半纤维素酶和木质酶降解多糖和木质素和打开苯基环(19]。

所有隔离显示孢子产量高和可行性(表2)。数据显示,Bioggp 9生产最多的孢子,在4.5×10 CFU⁸孢子/毫升和1.2×10⁸分别CFU /毫升。然而,真菌生存能力的最高比例是发现在Bioggp 6(95.1%),最低的是在Bioggp 12 (78.7%)。真菌分离株可分为高孢子可行性如果他们达成CFU≥1×10的平均水平⁷CFU /毫升。此外,他们也分为中等水平,如果他们有一个CFU≥1×10的平均水平⁶CFU /毫升(20.]。因此,Bioggp 3、6和9隔离可以分为高水平的孢子的生存能力,而Bioggp 11和12是包含在温和的类别。

结果表明,孢子产量的平均数量和活力在木聚糖microfungi(表有不同值3)。孢子数量最高的生产和生存能力被发现在Bioggp 9中,4.6×10⁹孢子/毫升和2.6×10⁸分别CFU /毫升。Bioggp 12可行性最低比例相对于其他隔离落叶的菠萝。结果表明,木聚糖microfungi孢子的生存能力低于孢子产量。

表4礼物的数量和生存能力的菌株Bioggp 2和Bioggp 5孵化后14天木质素分解定性测试媒体富含愈创木酚。结果表明,Bioggp 2产生孢子的数量和活力为1.8×10⁹孢子/毫升和6.0×10⁸分别CFU /毫升等于95%;然而,Bioggp 5生产8.3×10⁸孢子/毫升和5.2×10的可行性⁸CFU /毫升,相当于98%。尽管Bioggp2产生较大的孢子,其可行性,比例低于Bioggp5发芽的。

表5显示了一些真菌特征基于他们的反应pH值、温度、和除草剂。所有纤维素microfungi隔离能够增长低pH值(3、4和5),这表明他们倾向于acidotolerant。与此同时,他们也能够生长在温度30°C。他们成长的能力降低,当温度增加到37°C,而且只有Bioggp 3隔离能够生长在那个温度。有趣的是真菌生长响应当microfungi隔离种植在媒体包含1%的除草剂。所有隔离能够生长在媒体ametryne含有1%,除了Bioggp 6,而所有这些纤维素分离增长1%敌草隆除草剂。

木聚糖microfungi分离株的生长的反应pH值、温度、和除草剂因素也是有趣的(表6)。隔离种植在低pH值(3、4和5)表明他们继续增长。他们也能够增长30°C和温度降低的能力成长温度提高到37°C。此外,隔离也耐除草剂1%,所显示的能力持续增长。

木质素分解microfungi分离株的生长反应pH值、温度和除草剂如表所示7。这些microfungi隔离(Bioggp 2和5)能够生长在低酸度(pH值3、4、5),但在这个过程中,也发现增加媒体的pH值增加的颜色强度愈创木酚氧化。这说明,如果条件是酸性更强,愈创木酚氧化反应降低,反之亦然。增长反应温度也看到如果这些木质素分解隔离不耐高温,而对除草剂的反应表明,隔离对ametryne 1%敌草隆,而不是1%。

清除区(halozone),似乎是一个积极的指标,隔离能够降解纤维素(CMC)(图2)。这是解释为Shahriarinour et al。21),清除区形成是由于CMC的主要碳源媒体降解真菌生长。纤维素酶是一种酶组成的复杂cellobiohydrolase,内切葡聚糖酶,β葡糖苷酶在自然界中降解纤维素协同传播。真菌菌落周围明确区也会发生由于隔离产生木聚糖酶能够催化水解过程。木聚糖的降解过程是一个复杂的过程,需要协调的木聚糖酶水解木聚糖和阿糖基木聚糖聚合物;其中包括endo -β1,4 -木聚糖酶攻击的主要木聚糖链,产生低聚糖(22];和β——D-xylosidase水解xylo-oligosaccharides D-xylose (23]。定性测试每个孤立的水解能力(水解能力)是衡量比较直径或面积的比值明显区和他们的殖民地15]。

木质素分解真菌的筛选过程是由检测下的棕色和殖民地的存在表明木质素的氧化反应的存在(6,16];较暗的颜色出现直径(深棕色)表明木质素氧化反应酶的活动变得更强。愈创木酚氧化反应是一个测试方法,最令人信服的定性的方法用于生产木质素降解酶(microfungi木质素改性酶(lm))。

4所示。结论

隔离Bioggp 3降解纤维素和木聚糖指数最高在所有隔离,尽管它不与孢子的数量和比例的孢子的生存能力。隔离Bioggp 5木质素分解指标和孢子可行性最高的百分比。大多数的隔离是耐酸性的条件下,不能承受高温,并耐除草剂1% (ametryne和敌草隆),除了木质素分解隔离受不了ametryne 1%。

数据可用性

数据可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究由理事会的研究和社区服务,研究和技术/研究、国家创新机构,印度尼西亚,合同号860 / UN26.21 / PN / 2019和教授研究格兰特,意大利楠榜与合同号1675 / UN26.21 / PN / 2021。作者感谢PT。伟大的大菠萝的研究部门,楠榜,印尼提供菠萝基质。