文摘
背景。不动杆菌物种是一个重要的医院感染病原体。多药耐药性的快速发展和形成生物膜的能力使这些细菌更适应生存在卫生保健设施,从而有效的管理带来了挑战。客观的。本研究旨在描述不动杆菌临床分离株spp和研究他们的药敏模式和形成生物膜的能力。抗不动杆菌检测extended-spectrum进一步分析ő≤-lactamases (ESBLs),金属ő≤-lactamases (MBLs), "生产,blaNDM-1基因的存在。材料和方法。总共有324种不动杆菌从各种临床标本分离提交给美国微生物学,援建柯伊拉腊健康科学研究所Dharan,尼泊尔,和研究抗生素敏感性测试,检测ESBL和MBL生产,以前生物膜的形成是由标准的微生物方法。进行了PCR确定blaNDM-1基因的存在。结果。主要的不动杆菌物种隔离calcoaceticus-baumannii复杂(Acb复杂)167 (51.5%)。其中,所有物种128(40%)耐多药耐药(MDR)。13(4.0%)在ESBL生产商,MBL 70(61.9%), 12(10.6%) "生产商。blaNDM1基因存在于33隔离。百分之三十七(121/324)的隔离形成生物膜。a .物种的多数耐头孢噻肟73.8%(239年)和头孢吡肟(241)的74.4%。生物膜生产商MDR的很大一部分(p‚AČ<‚AČ0.001)。结论。这家医院耐药不动杆菌形成大部分‚《超能样品的大量业务blandm - 1基因。非常关心的是耐多药表型的协会与生物膜的形成。这种情况下保证严格的监测和坚持感染预防和控制措施。
1。介绍
不动杆菌,广泛分布,腐生的细菌在自然界中,已经成为一个最常见的院内病原体(1,2]。虽然不同种类的不动杆菌可能造成感染,80%的感染是由不动杆菌引起的baumannii。易于生存甚至在不利的环境中,在表面形成生物膜的能力,拥有许多抗菌素耐药性基因这种细菌的重要病原体。潜在的细菌形成生物膜的能力在某些情况下,的确,提供了一种可能的解释为杰出的抗生素耐药性和恶劣的环境中生存属性的医院,特别是在重症监护设置(3‚Aď5]。
在过去的几十年里,它的临床重要性增加了由于接受抗菌素耐药性的能力因素6,7]通过质粒的转移或转座子含有抗菌素耐药基因,特别是在医院环境中抗生素的使用是巨大导致选择性压力(8,9]。耐多药耐药(MDR)被定义为不动杆菌物种隔离的主要三个类耐青霉素类及头孢菌素类抗菌药物——所有(包括抑制剂组合),氟喹诺酮类原料药和氨基糖甙类7‚Aď11]。这些菌株在内的各种危及生命的感染与机械通气相关肺炎(VAP),如尿路感染、血液感染,手术部位感染和感染与医疗器械有关,特别是发生在重症监护病房的病人。此外,生物膜的形成之间的显著相关性和多药耐药性归因于不动杆菌当前抗生素时代强加的威胁(8,9,12]。
耐多药不动杆菌感染的诊断是一个巨大的挑战由于各种物种的分布与类型的感染,抗菌概要,biofilm-forming表现型。因此,从有效管理和感染控制的角度,它是至关重要的减少相关的风险与不动杆菌感染在医疗设置。本研究进行了描述临床不动杆菌分离株与抗菌素耐药性的检测,生物膜的形成,的存在blandm - 1基因。
2。材料和方法
324不动杆菌物种从各种临床标本分离得到,提交给美国微生物学,b·p·柯伊拉腊健康科学研究所(BPKIHS) Dharan,尼泊尔。本研究从2017年9月至2018年8月进行的。道德的机构审查委员会批准了BPKIHS, Dharan,尼泊尔。
2.1。不动杆菌物种的鉴定
直接的Gram-stained涂片显微镜检查所有样品除了血液进行。接种的样本到合适的培养基,孵化,检测后的增长建议时间是由标准的微生物技术(13]。在血琼脂疑似光滑、不透明的殖民地对应nonlactose发酵殖民地MacConkey和cl琼脂板被假定为不动杆菌和进一步处理。识别不动杆菌属的物种是由几个生化测试包括三糖铁(TSI)发酵试验、氧化酶、吲哚、能动性,脲酶、精氨酸水解14,15]。
2.2。抗菌药物敏感性试验
抗生素敏感性试验对穆勒辛顿琼脂(尼古拉斯)Kirby鲍尔盘扩散法推荐的临床和实验室标准研究所(CLSI)指南(13]。埃希氏杆菌属杆菌写明ATCC 25922和假单胞菌绿脓杆菌写明ATCC 27853被用作控制和测试以及测试压力。抗菌药物测试是哌拉西林(100‚AČőľ30 g)、头孢他啶(‚AČőľ30 g)、头孢曲松(‚AČőľ30 g)、头孢噻肟(‚AČőľ30 g)、头孢吡肟(‚AČőľ5 g)、环丙沙星(‚AČőľ10 g), imipenem (‚AČőľ30 g)、阿米卡星(‚AČőľg)和ampicilllin / sulbactum (10/10‚AČőľg),电阻至少一个抗菌剂在‚Č•3抗菌类视为多药耐药性(MDR) [13]。
2.3。检测ESBL表型
按照CLSI指南,可能ESBL-producing隔离有头孢他啶的抑制区(30‚AČőľg)‚AȂȧ‚AČ22‚AČmm和头孢噻肟(30‚AČőľg)‚AȂȧ‚AČ27‚AČmm [13]。为了证实ESBL生产、头孢他啶(30‚AČőľg)和头孢他啶‚AČ+‚AČclavulanate (30/10‚AČőľg)光盘被放置在不动杆菌文化。区域的抑制与头孢他啶和头孢噻肟光盘比较孤单,相比之下,联合头孢他啶‚AČ+‚AČclavulanate盘。一个增强的区域的直径‚Č•5‚AČmm结合clavulanate隔离检查证实为ESBL (13]。
2.4。检测金属-ő≤内酰胺酶酶(MBL)表型
2.4.1。组合盘扩散试验
组合盘扩散试验来确定MBL-producing表型不动杆菌。尼古拉斯板草坪上的文化不动杆菌,imipenem盘(10‚AČőľ10 g)和imipenem盘‚AČőľ0.5 l‚AČM EDTA应用20‚AČmm除了中心到中心。周围的抑制区> 7‚AČmm imipenem-EDTA盘相比imipenem盘单独分类隔离作为MBL生产商(16]。
2.4.2。"生产测试
表型检测carbapenemase-producing MDR不动杆菌是由改性霍奇测试(13]。首先,一夜肉汤培养的大肠杆菌写明ATCC 25922调整到0.5麦克法兰标准和干表面传播的穆勒辛顿琼脂(尼古拉斯)用无菌棉拭子板。暂时的干燥后,10‚AČőľg imipenem (IMP)盘放置在板的中心,和测试菌株都有从中心到边缘板的四个不同的方向。隔夜后孵化在37¬įC, carbapenemase-positive隔离显示,扭曲的抑制区,和一个‚Auclove叶模式‚AĚ被隔离观察到由于"生产(13]。
2.5。分子检测blandm - 1基因
新德里金属βlactamase-1 (blaNDM -1)是一种新型的MBL,都产生了耐药性ő≤内酰胺抗生素aztreonam除外。在这项研究中,确定耐药生物体的blaNDM - 1由常规PCR基因(17]。
2.6。DNA提取细菌隔离
隔夜汤文化离心机在3500‚AČrpm 10分钟4¬įC。然后,上层的丢弃和颗粒被洗两次5‚AČml磷酸缓冲盐(PBS)离心紧随其后。颗粒是resuspended 1‚AČml PBS和离心10分钟每分钟10000转4¬įC。最后,上层的丢弃,剩下的小球储存在‚ąi20¬įC直到化验(18]。
颗粒溶解在200年‚AČőľL (TE缓冲。然后混合物加热在100年¬įC 10‚AČminutes摇摇欲坠,迅速转移到冰浴10‚AČminutes。离心进行13000‚AČrpm 30‚AČseconds 4¬įC。最后,100年‚AČőľL浮在表面的DNA被转移到一个新管。DNA的浓度和纯度测定Nanodrop 2000光谱仪(Thermofisher) [17]。
2.7。聚合酶链反应(PCR)检测blandm - 1
的blandm - 1gene-specific PCR进行检测blandm - 1。PCR反应混合液准备在25‚AČőľL最终体积也构成1 x试剂盒PCR缓冲,2‚AČmM MgCl20.2、0.1‚AČmg BSA /毫升、‚AČmM核苷酸的混合,0.8‚AČőľ每个引物NDM1-F M (≤5‚cag‚AčCAC‚AčACT‚AčTCC‚AčTAT‚AčCTC-3‚≤)和NDM1-R (5‚≤20‚AčCAA‚AčCCA‚AčTCC‚AčCCT‚AčCTT-3‚≤), 0.5单元的聚合酶,和2‚AČőľL的DNA模板。PCR扩增在埃普多夫进行Mastercycle优点(埃普多夫,德国)(i)初始变性95¬įC 5分钟,(ii) 35 c的变性永昌龙94¬įC 30秒钟,55¬įC 30‚AČseconds,然后在72年¬įC 30‚AČseconds,和(3)最后一个扩展72¬įC 10‚AČminutes。PCR水作为消极的控制和细菌培养的DNAblandm - 1PCR阳性结果被认为是一个积极的控制。放大DNA在2%琼脂糖凝胶电泳后5‚AČV / cm和溴化乙锭染色、DNA带是用紫外线照射19]。样品被确认为blandm - 1PCR阳性结果如果DNA带300‚AČbp,见凝胶。
2.8。检测生物膜的形成
生物膜的形成是由标准实验室的检测方法(其它地方描述的那样20.‚Aď23]。细菌隔离种植在一夜之间在37¬įC 5‚AČml的大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)。Methicillin-sensitive金黄色葡萄球菌写明atcc - 25923和(MSSA)铜绿假单胞菌写明atcc - 27853被用作正面和负面的控制,分别。96 - wellflat触底的每个好盘子装满200‚AČőľL在一夜之间文化肉汤(0.5麦克法兰标准稀释为1%葡萄糖‚AČ+‚AČTSB)。盘子盖着盖子,耗氧孵化24小时37¬įC。孵化后,每个井的内容被删除,洗了三次300‚AČőľL无菌磷酸盐(PBS);pH值7.2)为了消除自由浮动的细菌。
成功每洗盘子在倒置的位置排干。附着细菌固定150‚AČőľL甲醇20‚AČmin, 96孔板是由简单的闪烁,清空,一夜之间在室温下晾干。附着生物膜层形成在每一个96孔板‚《超能好沾150‚AČőľL 2%的哈克结晶紫15‚AČminutes。污渍洗了把这些过剩下的96孔板运行自来水,直到污渍有停止的释放。96孔板是在室温下晾干。然后,150年‚AČőľL轻轻95%乙醇的添加在每个的微量滴定板re-suspension为了允许细胞。在室温下的板是孵化30‚AČminutes没有颤抖。吸光度(一个)的每个解决方案,与结晶紫染色,测定570‚AČnm读者使用微量滴定板(23]。
‚盟的解释一个‚AĚ测量:平均‚盟一个‚AĚ值计算为所有测试压力和消极的控制。截止值(Ac)计算如上三个标准差(SD)‚盟一个‚AĚ消极的控制。Ac‚AČ=‚AČaverage‚盟一个‚AĚ负控制‚AČ+‚AČ(3‚AČ√o‚AČSD消极的控制)。菌株分为四类基于‚盟一个‚AĚ价值观:(a)一个‚AȂȧ‚AČAc‚AČ=‚AČno生物膜生产商(b)交流‚AČ<‚AČ一个‚AȂȧ‚AČ2‚AČ√o‚AČAc‚AČ=‚AČweak生物膜生产(+)、(c) 2‚AČ√o‚AČAc‚AČ<‚AČ一个‚AȂȧ‚AČ4‚AČ√o‚AČAc‚AČ=‚AČmoderate生物膜生产(+ +),和(d) 4‚AČ√o‚AČAc‚AČ<‚AČ一个‚AČ=‚AČstrong生物膜生产(+ + +)23]。
2.9。统计分析
数据输入2013 MS Excel工作表和统计分析进行使用R包版本0.55 (24]。主成分分析在MDR等几个因素,MBL,bla的NDM,生物膜是由使用‚Auprcomp‚AĚ的函数R统计包、相关性和可视化的情节被ggbiplot包了25]。
3所示。结果
在324隔离的不动杆菌,167不动杆菌(51.5%)calcoaceticus-baumannii复杂(Acb复杂)其次是83年(25.6%)答:lwoffii38 (11.7%)答:haemolyticus,30 (9.3%)a . radioresistens和6 (1.9%)答:junii。
在这些不同的标本进行了分析,Acb复杂是主要的物种(表吗1)。
在这项研究中,26%的样本从内科病房,获得20%的ICU,从门诊部当12%,11%来自外科,儿科,妇科6%,4%的紧急,NICU,整形。Acb复杂主要在重症监护病房(76.7%)。
3.1。抗菌药物敏感性试验
不动杆菌的耐药百分比频率降序排列的头孢噻肟头孢吡肟74.4% 73.8%,头孢曲松钠65.7%,72.5%头孢他啶,头孢他啶‚AČ+‚AČclavulanic酸72.2%,哌拉西林65.7%氨苄青霉素‚AČ+‚AČsulbactam 36.7%,阿米卡星44.7%,环丙沙星50%,imipenem 35.2%。Acb复杂被发现有最高的耐药表型分析抗生素抵抗imipenem 57.4%。Acb复杂,头孢噻肟是抗生素抗性频率最高(94%),至于a . hemolyticus 31隔离的38 (82%)。超过50%的a . lwoffii和a . junii隔离调查抗菌素(表是明智的2)。不动杆菌分离株从ICU对抗生素的抗药性要比其他病房。
在324隔离,MDR 128 (39.5%)。MDR的大部分来自病人在ICU 60.3%其次是门诊部当43.5%,病房32.1%,紧急20.0%。Acb复杂有最高的MDR表型率如表所示3。
blandm - 1基因中检测出33隔离。blandm - 1是所有物种的不动杆菌除了radioresistens。的33隔离,blandm - 1隔离从各种标本包括脓(64.3%)、血液(62.5%)、CSF (100%)、ET-tubes(42.9%)、禁欲的流体(33.3%),和尿(20%)。所有33blandm - 1本研究的生产商是XDR菌株。pcr扩增的产物blandm - 1基因是显示在图1。
3.2。生物膜的形成
在324年分离、生物膜生产中检测出121(37.3%)隔离。45 (37.2%)biofilm-forming分离得到的设备,从脓36例(29.8%),20例(16.5%)从血液、尿液18(14.9%)、7(5.8%)从痰。生物膜生产被发现在所有物种中描述表3。约60.3%的耐多药和64.4% biofilm-forming隔离来自ICU。此外,MDR表型和生物膜的形成表型显著相关(p价值‚AČ<‚AČ0.0001)而没有联系确定其他毒性表型,如ESBL MBL, ",和blandm - 1。主成分分析(PCA)在不动杆菌分离株中,起源、生物膜形成、耐多药和抗生素耐药性的图显示,发现圆更接近Y‚Aď轴代表生物膜而圆圈代表孤立和不动杆菌物种在图的起源2和图3,分别。同样,生物膜的形成是一直在ICU中分离出(图2),Acb复杂(图3主成分分析)所示。
4所示。讨论
不动杆菌是臭名昭著的院内病原体之一,其倾向于针对抗菌药物的耐药性感染控制是一个重要的理由在卫生保健设施。
在五不动杆菌物种,Acb(不动杆菌calcoaceticus-A。baumannii)是一个复杂的最主物种(51.5%)在这项研究中,这是与其他研究的结果(15]。这表明Acb复杂甚至更多的存活率在不利的环境中,导致医院获得感染。大约20%的隔离从ICU获得类似于之前的研究结果报道从尼泊尔26]。这表明ICU可能是最重要的位置不动杆菌在医院的殖民和生存环境(5,27]。ICU患者通常需要长期住院,需要反复的侵入性检查和利用各种设备对生命支持,并且经常收到广谱抗菌素治疗。大部分的样品分离的脓毒症的病例ICU。以前的抗菌治疗,医疗设备,长期住院治疗已知菌血症的危险因素在这些病人28]。
耐头孢吡肟(74.4%)和头孢噻肟(73.8%)被发现在74.4%和73.8%分别隔离,其次是头孢他啶(72.5%)、头孢曲松钠(65%),和哌拉西林65%。发现隔离电阻阿米卡星是44.7%,环丙沙星50.0%与其他报告是一致的28,29日]。这表明不动杆菌物种内在和/或容易获得抵抗机制的许多可用抗菌药物使这种病原微生物最重要的挑战之一。
虽然碳青霉烯是一线药物对不动杆菌感染在1990年代末,特紧张越来越全球报道(10]。在加护病房隔离,对氨苄西林/ sulbactam和imipenem 42.5%敏感。imipenem阻力的发现35.2%(114/324)提出了一个问题。
在这项研究中,128例(39.5%)隔离被确定为耐多药耐药(MDR),它被发现,所有物种都耐多药菌株。不动杆菌抗生素耐药性似乎倾向发展迅速,由于长期抗生素暴露。因此,不动杆菌的增加趋势全球耐多药菌株被报道(30.,31日]。
在这项研究中,235例(72.5%)的菌株耐头孢他啶,其中13例(4.0%)显示ESBL生产双盘协同测试不同意其他报告(30.,32]。由于药敏模式可能是变量取决于几个因素,监测研究具有至关重要的作用在决定治疗对不动杆菌感染(15]。在这个研究在MDR隔离中,10.7%已经证明" MHT生产的方法。MHT和Imipenem纸片扩散试验和EDTA被广泛用作表型分析"和MBL酶的检测,因为它是一个简单的测试执行。MHT敏感的检测发现了“漫步者”类(KPC)和类D(OXA-48)而其灵敏度很低的ndm - 1生产商也证明了在这个研究[15,33]。然而,灵敏度高,但特异性率低的组合盘测试检测MBL的生产由表型方法结果可能会增加假阳性的MBL [34]。
成了"生产和检测的识别blandm - 1基因PCR检测(35]。此外,等化验loop-mediated等温扩增(36已经开发的检测blandm - 1基因。在这项研究中,NDM-producing不动杆菌分离株为10.2%(33/324)的研究,进行了在尼泊尔西部[37]。不动杆菌的存在的证据blandm - 1全球基因已经被报道(38,39]。在这项研究中,91%的NDM生产商对第二代和第三代头孢菌素。此外,25.8% (33/128)blandm - 1gene-containing隔离MDR表型。然而,Imipenem研究中是最有效的抗生素只有35.2% Imipenem阻力。
不动杆菌的biofilm-forming表型是由96板试验,发现37.3%的分离是生物膜成型机与之前报道的不一致(73.7%40]。此外,65.3%的biofilm-forming隔离与耐药表型有显著相关。分离株的生物膜生产商Acb复杂(56.2%),其次是a . lwoffii (14.5%), a haemolyticus (21.1%), a radioresistens(20%)和a . Junii (16.7%)。Biofilm-forming隔离被发现主要医疗设备样本(37.2%),其次是脓(29.8%)和大多数的研究是可靠的,报告超过90% biofilm-producing隔离多药耐药性从医疗设备以及显示模式(41,42]。此外,biofilm-forming隔离在ICU为主(64.4%),其次是病房(31.1%)也符合其他的研究,表明,医疗设备帮助前殖民开发的生物膜的形成43]。生物膜中成型机在这项研究中,抗imipenem为62%(75/121)高于46.7%的报道Yadav et al。5]。本研究报道,ICU都表型临床不动杆菌分离菌生物膜生产商和多药耐药性(3,4,42]。此外,生物膜之间的联系生产者和抗生素已被多项研究证明。基本原理是,一旦设备被殖民,开发共享基本特征的生物膜的细菌生物膜,生物膜内的细胞和细胞外基质的保护,防护材料可以减少抗生素的有效性和宿主防御机制(44,45]。然而,很难确定biofilm-producer微生物的抗生素耐药模式手动AST,因为浮游细菌细胞用于敏感性测试。此外,抗生素耐药性甚至可能高于在目前的研究中,观察到细菌没有耐药性的分子基础(易感体外)可以抗生物膜的环境。
尽管有创新antibiofilm疗法包括APDT结合抗生素、植物提取物、或者biofilm-disrupting酶可以协助管理此类案件。它有助于增加微生物抗生素治疗的敏感性,违反生物膜的结构或令人不安的生物膜中微生物的种群之间的通信46]。
然而,不同的结果在不同的研究由于地理的变化,安排学习小组的标本,病人的病情,抗生素的使用。
本研究的数据表明,不动杆菌物种对许多可用的抗菌药物,使这些医院病原体微生物挑战的一个最重要的控制。
5。结论
在此设置不动杆菌的临床分离株耐多药MBL生产商blaNDM-1基因和生物膜成型机。此外,有证据表明,生物膜的形成是一个潜在的标记来确定耐多药耐药(MDR)表型。这些隔离被证明能对感冒引起院内感染治疗在医疗设置和挑战性。因此,综合努力,严格执行所有的卫生保健提供者的感染预防和控制活动,早期诊断,抗生素管理建议减少抗菌素耐药性的负担在病人和卫生设施。
数据可用性
这是一个以医院为基础的研究。常规诊断和基因分型过程中收集的样本程序。因此,可用的数据分析将从相应的作者或请求美国微生物学((电子邮件保护)),BP柯伊拉腊健康科学研究所Dharan,尼泊尔。
信息披露
本文的预印本版本提交研究广场(47]。作者也感激地感谢研究广场的皮审查过程的研究论文。
的利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。
确认
我们想表达我们深深的感谢所有在微生物实验室技术人员和学生(b·p·柯伊拉腊健康科学研究所Dharan,尼泊尔)为他们的合作和支持本研究。