文摘
减少纤维素乙醇生产的成本,尤其是对纤维素水解酶,是至关重要的可持续增长和高效的纤维素乙醇产业和生物经济。使用一个产乙醇酵母能够产生水解酶,如ClavisporaNRRL y - 50464,是一个解决方案。NRRL y - 50464是快速增长和健壮,容忍抑制化合物布(糠醛)和5-hydroxymethyl-2-furaldehyde(羟甲基糠醛)与lignocellulose-to-fuel转换有关。它产生的三种形式β葡糖苷酶同功酶、BGL1 BGL2 BGL3,和纤维二糖发酵作为唯一碳源。这些β-glucosidases表现出理想的酶动力学参数对纤维二糖和高水平的enzyme-specific活动和许多低聚糖基质。他们容忍的产物抑制葡萄糖和乙醇,并稳定的温度和pH值条件。这些特征是可取的更高效的纤维素乙醇生产同步糖化和发酵。NRRL y - 50464提供了最高的纤维素乙醇浓度和转化率较低纤维素酶载荷,利用纯纤维素或农业残留物,迄今为止在文献中报道。本文总结了NRRL y - 50464的性能对纤维素乙醇生产精制纤维素,稻草,以各种方式和玉米秸秆加工,存在与否的糠醛和羟甲基糠醛。这种双重功能性酵母有潜力作为原型的发展新一代的生物催化剂。观点持续应变发展和更高效的纤维素乙醇生产过程工程改进从木质纤维原料进行了讨论。
1。介绍
可再生纤维素乙醇作为运输的先进生物燃料是一个有吸引力的替代使用减少化石燃料消耗和更清洁的环境。然而,商业化纤维素乙醇生产提出了重大挑战。木质生物质预处理过程,特别是稀酸预处理,通常产生有毒化学物质的副产品如布(糠醛)和5-hydroxymethyl-2-furaldehyde(羟甲基糠醛),抑制微生物的生长和发酵(1- - - - - -4]。碳水化合物嵌入在纤维素等植物纤维和全纤维素微生物发酵前需要水解单糖。额外的酶包括纤维素酶,β葡糖苷酶和辅助酶是酶法水解和糖化所需。在传统同步糖化和发酵(SSF)纤维素乙醇生产过程中,纤维素酶水解纤维素成oligoglucans和纤维二糖,和更多β葡糖苷酶将纤维二糖为葡萄糖,酵母发酵。Beta-glucosidase (β水解nonreducing -D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21)β从苷和-D-glucosyl残留β与低聚糖,释放葡萄糖。酶纤维素乙醇的成本比传统的淀粉基发酵大约10倍使用淀粉酶(5,6]。作为一个关键酶水解纤维素葡萄糖,β葡糖苷酶引起相当大的关注近年来纤维素乙醇生产的上下文中(7]。克服有毒化合物,降低酶的成本和提高效率的纤维素乙醇发酵的重大挑战,需要解决经济再生纤维素乙醇的生产。已经取得了显著的进展在过去的几十年,但仍面临着诸多挑战可持续、经济生产纤维素乙醇的木质纤维原料的工业应用。
因为大多数ethanol-fermenting不合成纤维素水解酶,微生物工程一直努力使产乙醇酵母生产β葡糖苷酶(8- - - - - -15]。然而,这些菌株都不够β葡糖苷酶活动高效的纤维素乙醇生产的社保基金。最近的研究发现一种天然Clavispora酵母,甜高粱隔绝,可以生产β葡糖苷酶和纤维二糖发酵乙醇。thermal-tolerant和糠醛- HMF-resistant应变祖野生型菌株的生成,也就是说,Clavispora通过自适应进化实验室(NRRL y - 5046416]。应变NRRL y - 50464有可能降低生产纤维素乙醇的成本,因为它是一个快速增长的酵母,产生足够的本地β社保基金的葡糖苷酶酶活性,可以利用纤维二糖作为唯一碳源生产乙醇。其纤维素转换性能已经被来自美国的科学家调查一、中国和印度使用各种各样的基质和原料。NRRL y - 50464港口β葡糖苷酶家族至少有三名BGL1 BGL2, BGL3。本文总结了当前的知识β葡糖苷酶酶由NRRL y - 50464和从精制纤维素和纤维素乙醇生产农业残留物。角度对未来应变增加乙醇生产力发展和改进的过程工程也提出了继续调查。
改编的ClavisporaNRRL y - 50464是一个快速增长的酵母的增长速度超过酿酒酵母在葡萄糖。它可以利用纤维二糖作为唯一的碳源和产生足够的本地β葡糖苷酶对乙醇生产活动由社保基金(17,18]。当挑战15毫米的糠醛和羟甲基糠醛,NRRL y - 50464的文化很快就克服了化学压力经过短暂的停滞阶段,完成了乙醇发酵在32 h。它转换糠醛nonharmful hydroxymethylfuran(呋喃甲醇或调频)在不到12 h和羟甲基糠醛为2,5-bishydroxymethylfuran (furan-2, 5-dimethanol或FDM)在不到24小时,而生产乙醇(16,19]。研究酵母在玉米秸秆玉米胚芽蛋白酶解物,NRRL y - 50464显示抗醋酸比酿酒酵母DQ1 [20.]。然而,它的宽容的特点对醋酸尚未定量验证。应变NRRL y在37°C - 50464年蓬勃发展,这是一个合适的温度对乙醇生产使用社保基金。
2。基本评估
2.1。纯纤维素性能
应变NRRL y - 50464发酵纯化纤维素基质Avicel或SigmaCell™发酵同样在社保基金在下列条件:刚做好的一夜之间文化NRRL y - 50464细胞的比例增加了60毫克/毫升湿重总量25毫升的发酵。商业纤维素酶(Celluclast 1.5 L)添加浓度为15.3每克纤维素滤纸单元(FPU)材料。没有额外的β葡糖苷酶酶添加。100 - ml发酵进行了耐尔根瓶排放使用23-gauge针和搅拌在250 rpm 37°C。与固体加载纤维素乙醇产量增加的比例从2增加到14%。47 g / L的最大乙醇效价达到了14%的纤维素加载在120 h (21]。一般来说,纤维素乙醇发酵率与浓度的增加减少。发酵率最大8 h为每个加载和纤维素之后急剧下降。从48 h - 72 h,转化率也有类似的对大多数浓度缓慢的趋势。大部分乙醇产在72 h和一个典型的乙醇生产效率在60%以上。72 h后,发酵的速度明显放慢有限的乙醇生产(21]。因此,乙醇浓度测定在72 h是最佳的时间来评估菌株发酵性能。在72 h,乙醇浓度测定观察40.44 g / L的纤维素的固体负荷为14%,相当于56.6%的转换效率。
其性能对社保基金的精制纤维素没有添加β葡糖苷酶优于大多数的工程菌株(表1)。例如,转基因酿酒酵母应变产生24 g / L从8%乙醇72 h后精制纤维素没有补充β葡糖苷酶活性(13]。应变NRRL y - 50464生产26.54 g / L乙醇从8%纯纤维素在72 h,等于65%的效率。96 h酿酒酵母应变达到这种效价。一个工程菌株产生大约25 g / L从纯纤维素乙醇72 h和达到更高的效价38 g / L 146 h (27]。NRRL y - 50464产生的效价明显高于47.74 g / L, 120 h从纯纤维素(21]。其他报道工程菌株显示更低的转换效率和乙醇浓度(23]。应变NRRL y - 50464到目前为止展示了最好的产品产量和纯cellulose-to-ethanol转换的速度没有补充社保基金β葡糖苷酶。
2.2。纯纤维素与玉米秸秆
纤维素乙醇生产通常是调查使用纯纤维素或作物生物质原料。为了评估应变性能可用纤维素内容,重要的是要比较指标从精制纤维素和木质纤维素乙醇转换在平等基础上的纤维素含量。标准的玉米秸秆进行预处理,DOE-NREL Energy-National可再生能源实验室(部门)协议含有37.84%的纤维素含量在干重的基础上,这是符合美国能源部生物质原料中列出的值组成和属性数据库(http://www.afdc.energy.gov/biomass/progs/search1.cgi)。因此,固体加载范围5 - 37%标准DOE-NREL-pretreated玉米秸秆含有1.89 - 14.0%的纤维素(21]。
在同样的社保基金文化条件下,对玉米秸秆乙醇转化效率明显低于纯纤维素。例如,一个从6%乙醇20 g / L的效价达到纯纤维素在48 h。相比之下,花了120 h等效的玉米秸秆纤维素基加载15%达到这一水平。同时,常常导致精制纤维素浓度的8%和10%乙醇浓度远高于等效载荷使用纤维素进行预处理玉米秸秆在20 - 25%的总生物量固体载荷。总的来说,转换效率使用玉米秸秆只有50 - 70%相比,使用纯纤维素(21]。因此,有巨大的潜力从玉米秸秆提高乙醇生产。在这一具有挑战性的领域,木质素在众多因素作为主要障碍实现更完整的从玉米秸秆纤维素的利用率。
2.3。标准的玉米秸秆与Delignified玉米秸秆
其他地方有详细的试验程序(21]。短暂、固体纤维素材料的常规dilute-acid-pretreated玉米秸秆获得DOE-NREL服用6 N氢氧化钠调节pH值为5.5。固体被四卷Milli-Q水清洗去除残留的盐。材料在60°C一夜干干重的测定纤维素。相同来源的传统预处理玉米秸秆固体被额外的原料处理程序使用过氧化氢(如前所述)[28]。生物治疗是孵化16 h与温柔的在室温下混合。泥浆被过滤,用水洗,直到滤液是明确的。固体调整pH值5.5和干体重测量。发酵进行了使用水不溶性固体(感知)内容15、20日和25%(干重)固体加载在最后没有葡萄糖浓度。发酵是在50毫升的总量进行耐尔根瓶100毫升23-gauge针发泄如上所述。酶的添加和细胞接种NRRL y - 50464和上面描述的一样。社保基金是在37°C孵化器风潮在250 rpm。比较研究,所有菌株都以同样的方式对待在相同条件下和细节可以在原来的报告。
delignified发酵玉米秸秆显示明显高于乙醇浓度测定,转化率和效率比DOE-NREL-pretreated玉米秸秆(例如,木质素完好无损)在同样的社保基金文化条件。使用delignified生物量显著,性能相似,使用纯纤维素。乙醇转换从delignified玉米秸秆纤维素是在72年完成h固体加载水平的15日,20岁和25%。相比之下,花了超过120 h完成发酵使用DOE-NREL dilute-acid-pretreated玉米秸秆(21]。乙醇浓度delignified玉米秸秆从30到40%,增加转换效率从40增加到60% DOE-NREL-pretreated玉米秸秆。的转化率明显高于delignified玉米秸秆为DOE-NREL-pretreated比玉米秸秆在固体转化率最高的载荷(0.0531 g L−1h−1)在15%固体加载。浓缩料浆,与固体载荷增加利率下降,尽管仍然类似于使用高固体纯纤维素(21]。
这表明木质素是主导因素阻碍玉米stover-to-ethanol转换。纤维素形态已经观察到影响纤维素的酶消化预处理玉米秸秆(29日]。去木质素删除非生产性的吸附网站结合了多种纤维素酶,同时增加纤维素纤维的可访问性,从而提高其消化率(30.,31日]。自delignified乙醇浓度测定玉米秸秆仍低于从等效纯纤维素在固体加载水平较高,也有其他干扰因素。然而,增加纤维素酶剂量没有提高发酵效率,其纤维素酶并不是限制利率或收益率(刘,未发表的数据)。更高效的生物质预处理策略将提供更为有效的酶水解和下游加工乙醇生产(32]。在湿生物质固体浓度很高,形成粘稠的泥浆,这不是混合在一个烧瓶或传统生物反应器系统。可怜的混合也会降低乙醇发酵的效率。过程工程的作用来提高社保基金是下面要讨论的。
3所示。乙醇产量从农业材料
3.1。工业加工玉米穗轴残留
玉米商业化用于木糖生产。木糖提取后,剩余的蛋糕,它包含超过50%的纤维素,可用于纤维素乙醇生产(33]。然而,高水平的有毒糠醛中残留的玉米穗轴蛋糕结合解毒和缓慢的发酵率的高成本阻碍其用于乙醇生产(14,33]。在这种情况下,发酵菌株y - 50463是一个合适的主人,因为它是健壮的糠醛,具有转换速度快、和自己生产β葡糖苷酶。
应变NRRL y - 50464生产26.6 g / L从社保基金使用20%乙醇工业加工玉米棒子的固体残渣在5天没有补充β葡糖苷酶(16]。相比之下,控制发酵接种酿酒酵母未能发酵产生大量的纤维二糖,只有一丝乙醇,可能从已存在的葡萄糖。乙醇转化的效率从玉米穗轴残留固体载荷增加时减少15 - 35%的社保基金使用NRRL y - 50464。而最高产量效率(55%)实现了15%的固体加载、乙醇浓度测定获得了最高的25%固体加载(16]。此前曾报导过类似的转换效率(53%)15%固体加载玉米(34]。在社保基金补充道β葡糖苷酶,乙醇生产和转换效率低于不添加的酶15岁和25%固体载荷。添加额外的β葡糖苷酶实际上并没有显示任何好处通过社保基金在大量重复发酵为乙醇生产16]。以前的报告也没有添加观察乙醇效价略高β比与[葡糖苷酶13]。17-h孵化后,NRRL y - 50464生产1.20 U /毫克/毫升具体β葡糖苷酶活性(16]。这高水平的早期表达足够的纤维二糖水解酶活性在社保基金和乙醇发酵。是否用药β葡糖苷酶干扰纤维二糖水解和发酵在社保基金仍不清楚。使用2 L生物反应器对社保基金,NRRL y - 50464产生了23 g / L没有添加乙醇在120 hβ葡糖苷酶(16]。
另一个更可靠的方法来计算转换效率是衡量总葡聚糖之前和之后社保基金(35]。使用这种分析方法,NRRL y - 50464显示最高的77.36和53.98 g / L对葡萄糖的消耗固体负荷为25%和15%,分别为(16]。自然,乙醇产量也显著增加。正如所料,较高的转换效率(93%的理论)发生在15%固体加载。效率显著下降20 - 25%固体载荷。因此,大部分的葡聚糖没有转化为葡萄糖高固体浓度。这一结果表明,需要更好的预处理方法来释放一种改进乙醇不溶性糖产量(36]。
3.2。DOE-NREL-Pretreated玉米秸秆
使用应变NRRL y - 50464, DOE-NREL-pretreated玉米秸秆在20%固体装载了34.7 g / L的乙醇浓度测定120 h社保基金进行了使用生物反应器(21]。它产生32 g / L乙醇48 h内线性增长率0.088 g / L / h(图1),这表明,运行时间可以缩短。相比之下,社保基金是瓶中进行文化时,玉米秸秆在同一加载不到15 g / L产生乙醇在48 h。因此,运行在一个生物反应器乙醇的产量翻了一倍,大大提高了转化率相比瓶子社保基金。这个比较展示了良好的混合的重要性(21]。
传统的瓶瓶发酵或磁力搅拌棒搅拌通常用于社保基金。虽然方便,但上面的例子表明,这种设置可能会导致收益欠佳时结合高固体。尽管机械搅拌生物反应器提供了一个更好的风潮,它仍然不是纤维素乙醇生产的优化设计,因为它是专为液体的文化。在这种情况下,调酒棒通常靠近船的底部,并提供有限的高固相泥浆混合。对高固体纤维素材料的载荷,不同的搅拌叶片与预计全面移动的运动机制,进一步提高纤维素乙醇生产的效率在实验室和试点规模。
3.3。传统的玉米秸秆
表演的应变NRRL y - 50464和酿酒酵母DQ1传统玉米秸秆比较使用水解玉米秸秆的发酵(CSH)由单独的水解或社保基金流程。详细的方法和具体步骤,读者被称为原始报告(20.]。在两种条件下,应变NRRL y - 50464表现出优越的性能对纤维二糖转换和乙醇生产的菌株酿酒酵母DQ1 [20.,37]。乙醇发酵效价NRRL y - 50464是使用enzyme-hydrolyzed 38 g / L的传统玉米秸秆在35%固体加载(w / w) [16]。在不同的研究中使用25,30岁和35%的CSH包含13.4,14.1,和16.5 g / L的纤维二糖,分别NRRL y - 50464年增长速度超过酿酒酵母DQ1 [20.]。应变NRRL y - 50464产生的水平明显高于乙醇固体负荷水平。增加固体加载水平的乙醇产量增加26岁CSH g / L为25%,最高38 g / L CSH 35%。乙醇产量的增长部分是由于CSH的纤维二糖自应变NRRL y - 50464可以直接将纤维二糖转化为乙醇。35%的固体CSH含有葡萄糖79.6 g / L, 13.2 g / L木糖和16.5 g / L纤维二糖。虽然两菌株不能利用木糖,额外的纤维二糖受益更多由NRRL乙醇生产y - 50464 (16,20.]。社保基金发酵是同样有效的乙醇浓度为37.7 g / L和38.1 g / L,没有补充道β葡糖苷酶酶分别(表1)。当β葡糖苷酶没有添加到发酵,乙醇浓度测定等同于55.5%的转换效率(20.]。稍低的乙醇浓度在社保基金通常观察到以前[13]。是否有多余的β葡糖苷酶干扰乙醇发酵目前不清楚。
值得注意的是,使用传统的社保基金进行预处理玉米秸秆只需要5毫克蛋白/ g葡聚糖,相当于6.7 FPU / g葡聚糖,这是最低的纤维素酶加载报告文学(表1)。降低纤维素酶将省下一笔巨款。另一个因素在实现更高的乙醇浓度测定是使用5 l生物反应器配有螺旋搅拌器(20.,36,38]。与传统的拉什顿或海洋叶轮、螺旋搅拌器设计混合纤维素浆在整个船舶在一个统一的方式,因此,非常适合使用在纤维素发酵。
3.4。稻草
乙醇发酵的菌株NRRL y - 50464在稻草评估使用mild-alkali不同预处理过程后,稀酸,或深低共熔溶剂。乙醇产量从mild-alkali-pretreated稻草社保基金从dilute-acid-pretreated显著高于稻草社保基金在10,15,20%固体载荷(24]。dilute-acid-pretreated稻草,NRRL y - 50464生产16.8 g / L乙醇120 h后15%固体加载。值得注意的是,这比大多数报道乙醇浓度使用dilute-acid-pretreated稻草和各种微生物,包括酵母,它只生产10.2 - -12.3 g / L乙醇(39]。然而,乙醇产量mild-alkali兑dilute-acid-pretreated稻草就更好了。乙醇产量增加到25 g / L以均匀的速度在36 h mild-alkali-pretreated稻草。mild-alkali-pretreated稻草的转换效率为79.2,64.0和45.4%从10,15日,和20%的固体载荷,分别显著高于观察dilute-acid-pretreated稻草糖。因此,mild-alkali是首选,稀酸预处理稻草乙醇转换由社保基金(24]。
进一步提高转换效率、先进方法使用一组深低共熔溶剂进行调查,这是由生物降解和环保的绿色溶剂(40]。除了干扰结晶纤维素纤维、绿色溶剂也从稻草中提取木质素,所有的这些显著提高发酵效率(26]。应变NRRL y - 50464容忍选择性绿色溶剂,包括氯化胆碱/甘油(CC-GLY),氯化胆碱/ 1,2-propane二醇(CC-PD)和氯化胆碱/乙烯(CC-EG),成功就是明证糖的发酵产生的共晶solvent-pretreated稻草。与大多数的预处理、乙醇生产24小时后达到19.7 g / L。36.7 g / L的乙醇浓度测定获得了在36 h深度水解物的共晶solvent-pretreated稻草固体20%,相当于89%的乙醇转换效率(25]。
3.5。摘要纤维素转换的性能
很难比较不同微生物的性能报告为纤维素乙醇生产因为生物量变化的内容和方法。精制纤维素社保基金,大多数菌株似乎产生相似的乙醇浓度。然而,应变NRRL y - 50464表现出更高的转换效率创纪录的效价为40.44 g / L从14%纤维素在72 h,和最大的效价48 g / L 120 h(表内1)。它显示大约增加10%效价在72 h工业玉米穗轴残渣处理。NRRL y - 50464是一个理想的酵母用于corncob-to-ethanol转换由社保基金,因为它容忍糠醛在衬底和更好的转换效率。
酵母菌株NRRL y - 50464证明稻草发酵的特殊乙醇生产力和浓度。mild-alkali预处理似乎优于酸洗稻草,部分原因在于这位前删除大量的木质素(25]。lignin-associated抑制的证据也证明比较研究delignified和un-delignified玉米秸秆(21]。更有效的预处理方法有望进一步提高纤维素乙醇生产潜力。乙醇生产的32 g / L DOE-NREL-pretreated玉米秸秆达到48 h内使用2 L生物反应器通过社保基金,转化率为0.0881 g L−1h−1使用DOE-NRRL y - 50464。应用5 L生物反应器螺旋搅拌器,这一毒株产生38.1 g / L从传统的乙醇浓度测定玉米秸秆由社保基金使用数量非常低的纤维素酶(5毫克的蛋白质/ g葡聚糖或6.7 FPU / g葡聚糖)(表1)。这是接近纯纤维素乙醇浓度测定观察;然而,它花了96 h而不是72 h达到这一水平。传统的玉米秸秆的转换效率也从DOE-NREL-pretreated低于玉米秸秆。它可能是变量的传统玉米秸秆的预处理过程可能会损害其乙醇转化的效率。总的来说,快速转化率NRRL y - 50464特殊不管纤维素材料的测试。
4所示。的证据β葡糖苷酶生产
4.1。表达式
生长在葡萄糖和纤维二糖的混合物时,β葡糖苷酶活性诱导葡萄糖耗尽后(17,41]。这表明,β葡糖苷酶诱导cellobiose-dependent。在纤维二糖文化中,最大值β葡糖苷酶活性BGL1发生在18 h。的快速诱导蛋白表达是一致的快速发酵(17]。同样的,基因的表达BGL3也观察到被纤维二糖诱导快速达到最高mRNA在20 h丰富。相比之下,观察到的mRNA丰富BGL2没有显示显著增加,尽管它的蛋白质表现出更高水平的β葡糖苷酶活性和基因克隆的菌株表现出快速增长速度对纤维二糖(41]。因为两个转化株包含相同的严格监管AOX1子,这样的结果出乎意料。其基因表达是否受到译后监管是不清楚的,和它的dna蛋白质相互作用是目前未知。
4.2。分离和鉴定
Beta-glucosidase活动从不同的细胞分数应变NRRL y - 50464进行评估与样本密切相关β葡糖苷酶生产酵母菌株。Cellobiose-inducedβ葡糖苷酶活动NRRL y - 50464似乎与破碎的细胞原生质球,和相对较低的活动观察在上层清液17]。而应变密切相关c . lusitaniaeNRRL NRRL y - 5394 y - 50464产生更高水平的β葡糖苷酶活性的测试分数。另一个酵母假丝酵母wickerhamiiNRRL y - 2563 (42),这是众所周知的β葡糖苷酶,酶活性的最高水平。然而,增长较慢的纤维二糖和一个贫穷的乙醇发酵器,这不到一半的乙醇生产的纤维二糖的价格相比NRRL y - 50464 (17]。目前,只有三种形式β葡糖苷酶的特点。自β葡糖苷酶活动中观察到的所有分数细胞提取物,额外的形式的酶可能存在,仍有待恢复。
第一BGL1被确定使用442氨基酸残基获得MALDI-TOF和TOF / TOF串联MS / MS分析。CLUG_01181的氨基酸序列匹配一个假想的蛋白质c . lusitaniae写明ATCC 42720基于计算注释。BGL1符合函数β葡糖苷酶直接酶测定(17]。这是与糖苷水解酶(GH)家庭3。催化亲核试剂n端结构域和一个质子供体c端域被发现位于Asp225 Asp224, Asp225;,Glu458 Glu449 Glu459 BGL1, BGL2,分别和BGL3从NRRL y - 50464 (17,41,43]。氨基酸序列的这些BGLs是不同于其他已知的β-glucosidases包括念珠菌清塞音,Debaryomyces hansenii, Meyerozyma guilliermondii, Scheffersomyces stipitis, Schwanniomyces etchellsii,Spathaspora passalidarum(17,41]。系统发育分析13微生物BGLs显示BGL1的亲密关系,BGL2, BGL3应变NRRL y - 50464 (41]。这些结果表明有BGL家庭至少有三个成员在NRRL y - 50464。他们聚集了β从另一个酵母葡糖苷酶的物种克鲁维酵母菌属marxianus(图2)。
4.3。描述的BGLs NRRL y - 50464
蛋白质的三个BGLs NRRL y - 50464有一个类似的结构长度从804年到844年的氨基酸残基。分子量为93.3,88.3和92.5 Kda BGL1, BGL2,分别和BGL3(表2)[17,41]。
观测到了最高的具体活动BGL1 pH值6(表2)。BGL2容忍低pH值显示类似水平的酶活性在酸碱4和5。BGL3对pH值不敏感,也有类似的活动从酸碱与最大活动4到6 5。特定的酶活性最高的最适温度为45岁,50岁和55°C, BGL1 BGL2,分别和BGL3(表2)。BGL3容许温度较高,其活动保持相对稳定的从60到70°C (41]。总的来说,这样一个广泛的最佳温度和pH值性能三个BGLs便于增长变量下的酵母发酵条件。
使用最佳的温度和pH值条件下,酶动力学参数β-glucosidases测定。这三个酶,BGL1、BGL2 BGL3,显示出了明显较高的底物亲和力对硝基苯-β-D-glucopyranoside (pNPG)K米从0.08到0.35毫米Novo188相比的K米(表0.448毫米3)[17,41]。BGL1和BGL2上级反应速率与最大酶速率显著高于Novo188,商业的来源β葡糖苷酶。
产物抑制等多种纤维素酶葡萄糖抑制纤维素乙醇过程来说是一个大问题,因为它可以减少水解率和限制最终的乙醇浓度。自然,酶需要容忍乙醇,和基因工程一直在努力增加乙醇的宽容β葡糖苷酶(44]。因为大多数β-glucosidases葡萄糖抑制高度敏感,确保葡萄糖宽容β-glucosidases高效的纤维素乙醇生产已成为一个重大的挑战[45,46]。所有这三个β-glucosidases NRRL y - 50464年展示高水平的宽容为葡萄糖,和BGL2由葡萄糖和最少的抑制K我(表61.97毫米3)[17,41]。相比之下,Novo188,商业的来源β葡糖苷酶,葡萄糖抑制更敏感K我0.735毫米。由于Novo188的混合酶,葡萄糖抑制敏感反应是否影响其破坏纯度还不清楚。
除了宽容葡萄糖抑制,BGL2是高度耐乙醇造成的产物抑制(41]。其特定的酶活性增强,低浓度的乙醇从4到12%,这是一个增强的功能自报道纤维素乙醇浓度通常小于10%。然而,BGL3是高度敏感的乙醇虽然宽容在极高的葡萄糖浓度高达1000毫米(41]。显然,这些酶的功能机制是不同的针对不同的环境条件。
4.4。底物特异性
纤维素的水解释放出多元化的低聚糖的混合物。除了使用显色底物测定pNPG,具体活动BGL2和BGL3评估对14纯化寡糖(41]。这些基质包括cellotriose、cellotetraose、cellopentose laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose, laminaripentaose,海带多糖,乳糖,lichenan,龙胆二糖,水杨苷,sophorose。BGL2较高的水解活动对纤维二糖与变量活动在温和的水平对所有其他基板检查(41]。另一方面,BGL3显示较强的水解活性对大多数低聚糖相比,纤维二糖。然而,BGL3整体特定活动的所有基板测试,包括纤维二糖,低于BGL2。
5。视角
Beta-glucosidase纤维素酶的重要组成部分是由社保基金end-hydrolysis cellulose-to-ethanol生产所需。降低酶成本仍然是一个重大挑战商业先进生物燃料的生产。微生物本身产生水解酶通常不是homo-ethanol发酵。快速增长和抑制剂健壮的酵母菌株NRRL y - 50464是罕见的在其生产的能力β葡糖苷酶和纤维二糖发酵,以及葡萄糖、乙醇。酵母也能够获得更高的乙醇浓度从精制纤维素像样的生产力。其乙醇生产农业材料上的属性,包括工业副产品玉米穗轴残渣,稻草,DOE-NREL-pretreated玉米秸秆,和传统的玉米秸秆,异常与其他报道酵母菌株在效率方面和经济。最重要的是,乙醇转化率NRRL y - 50464是杰出的其他可用β葡糖苷酶生产菌株。的识别β葡糖苷酶家族BGL1包含至少三个成员,BGL2,理想的酶特色BGL3进一步支持其双重功能的酶水解功能除了乙醇生产能力。而微生物菌株的快速增长和健壮性为工业应用的特征,应该小心,防止潜在的污染意想不到的应用自NRRL y - 50464生长速度比大多数酵母菌株包括美国麦酒e。需要指出的是,当前的乙醇浓度测定NRRL y - 50464仍低,没有准备好工业应用。显著地提高应变能力需要进一步提高其乙醇转换。
NRRL y - 50464可以利用木糖,但生产木糖醇,而不是乙醇。这是一个重大缺陷的应变为纤维素乙醇生产木质生物质自包含大部分木糖。这是一个重要的领域,它需要改进,以充分利用这一毒株为纤维素乙醇生产使用玉米胚芽蛋白酶解物。基因工程定向xylose-to-ethanol转换途径将大大增强其利用c - 5和其他糖混合,如完成酿酒酵母。特征明显不同酿酒酵母的基因背景ClavisporaNRRL y - 50464是鲜为人知。自的解毒机制NRRL y - 50464中所观察到的类似酿酒酵母,它可能不是一个far-reachable目标NRRL y - 50464年启用xylose-to-ethanol途径以适当的修改。
有很多工程的例子酿酒酵母使其木糖利用率(47- - - - - -55]。染色体的集成YXI,合成酵母codon-optimized木糖异构酶基因酿酒酵母实现了工业酵母组成型表达。使用YXI,单独与一组外生木糖转运体基因和下游促进基因;得到了一些新的基因型,显著提高木糖吸收和利用纤维素乙醇生产(51,53,56]。签名表达途径是显示说明外生的互动关系——和endogenous-source基因的转基因工业菌株酿酒酵母(56]。表达的本构YXI随后发起木糖代谢途径和促进相互作用关键nonoxidative磷酸戊糖途径分行加强对木糖吸收和利用率(53,56)(图3)。这种策略可以作为一个模型,使NRRL y - 50464在未来利用木糖。农业研究所开发的应变NRRL y - 50464,这是用于研究和开发社区向低成本的纤维素乙醇生产持续改进。利用两个c - 5的能力和其他生物质糖、纤维素乙醇生产力NRRL y - 50464预计将显著提高。
目前,基因组序列NRRL y - 50464还没有可用的和有限的遗传背景。这一毒株基因组研究将揭示基本机制的双重帮助其改善和扩展应用程序的功能。遗传背景的描述NRRL y - 50464,特别是对于那些β葡糖苷酶和相关基因,不仅有利于改善NRRL y - 50464,而且还可以应用于其他酵母应变增强和发展。随着科学技术的飞速发展和生物技术如基因组编辑和CRISPR工具,预计在未来可以实现更理想的菌株。NRRL y - 50464可以成为一种有价值的新遗传资源在这方面。
过程工程也需要进一步提高转换效率的生物反应器。传统生物反应器设计与底部搅拌液体发酵,这不是理想的乙醇生产的高固体预处理木质纤维素的原料。底搅拌限制转换效率明显当固体加载水平大于15%21]。高固体需要实现商业现实的乙醇浓度对蒸馏效率和最小化过程用水量。有必要提高在高固体通过改变搅拌混合机制。作为观察使用5 L生物反应器配有螺旋搅拌器,更高的乙醇浓度测定的38.1 g / L实现从25%固体装载常规玉米秸秆纤维素酶输入的一个重要低水平的5毫克蛋白/ g葡聚糖或6.7 FPU / g葡聚糖(20.]。它的转换效率是55.5%,相比提高32.4%观察传统2 l生物反应器底部搅拌(表机制1)。螺旋叶片搅拌提供更高效的传质泥浆在整个船舶在社保基金过程中适度的电源输入。这表明适当的生物反应器设计的重要性显著提高发酵性能。更好的混合也会导致更好的水解酶,导致低shear-related损失的活动。
木质素是众所周知的一个主要因素限制酶生物质能解构和更高的纤维素乙醇生产的滴度,而且它也从玉米秸秆转换使用观察NRRL y - 50464 (21,57]。Mild-alkali,自然深共晶solvent-pretreated稻草导致显著高于乙醇生产dilute-acid-pretreated稻草相比,由这些方法由于木质素去除(24,25]。大量的葡聚糖也观察到不可用的乙醇转化玉米穗轴残留物(36]。更有效的预处理方法去除抑制木质素和释放更多的不溶性生物质糖是非常需要一个经济下游酵母发酵过程。
因此,需要一个集成的改进,由应变性能、酶水解效率,更有效的预处理方法,和适当的过程工程,实现低成本的纤维素乙醇生产从木质纤维原料。22,58,59]。
信息披露
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的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢Drs。张健宝杰,来自华东科技大学,中国,和Adepu k . Kumar博士从Sardar Patel可再生能源研究所,印度为他们的协作研究。这项工作是由美国农业部农业研究服务。