文摘
背景。大约一半的世界人口与胃慢性感染细菌幽门螺杆菌,使其成为世界范围内最常见的慢性感染。幽门螺旋杆菌诱导活性氧的生产,DNA损伤,和加速肿瘤抑制蛋白p53的退化,这可能导致癌症的发展。在这项研究中,我们调查之间的关系幽门螺旋杆菌在胃粘膜感染和p53的表达一组的病人从约旦。方法。回顾性病例对照研究,胃腺体的上皮细胞在慢性感染了幽门螺旋杆菌检查了p53的表达。石蜡包埋的胃活检样本档案50约旦病人被诊断为慢性幽门螺旋杆菌感染和25个样品免费幽门螺旋杆菌被选中的感染和其他胃异常。分析了样本的存在幽门螺旋杆菌以及p53表达水平在黏膜和黏膜下层,免疫组织化学分析和免疫印迹。结果。幽门螺旋杆菌感染者中检测出胃组织(n= 50);然而,没有幽门螺旋杆菌发现感染的健康个体无毒性(n使用免疫组织化学= 25)。与未感染的胃粘膜,样品没有核p53表达受感染的样本中,检测出使用免疫组织化学。此外,p53的水平幽门螺旋杆菌阳性样品检测到免疫印迹明显低于那些消极的人。结论。我们的数据表明,p53蛋白表达减少胃粘膜感染的病人幽门螺旋杆菌。这个肿瘤抑制的损失可能发挥作用在肿瘤发生的风险增加相关幽门螺旋杆菌马车。
1。介绍
幽门螺旋杆菌革兰氏阴性细菌,长期在人类胃,几乎一两个全球人类感染(1,2]。感染了在生命的早期,它是最强的识别风险因素发展的窦的胃炎、消化性溃疡、胃癌(3]。幽门螺旋杆菌被归为一组1致癌物,国际癌症研究机构(IARC)。感染幽门螺旋杆菌被认为是必要的但不足导致胃癌的1,4]。这是由于细菌毒力因素和宿主因素之间的复杂的相互作用决定的进展和慢性感染(4]。研究最多的幽门螺旋杆菌毒性基因位于40 kb的基因组区域称为cytotoxin-associated基因致病性岛(cagPAI) [5]。其中最独特的毒性cagPAI cytotoxin-associated基因是基因(CagA),这是交在上皮细胞由cagPAI-encoded IV型分泌系统后细菌对宿主细胞。CagA是一个癌蛋白,可以破坏几位主持人的重要信号通路5]。
胃癌的发展被认为是一个多步骤、多因子的过程,包括癌基因的激活、抑制肿瘤抑制基因,氧化应激引起的DNA损伤幽门螺旋杆菌。事件的顺序从胃炎、萎缩,肠上皮化生,发育不良,最后胃癌可以几十年发展(5]。
幽门螺旋杆菌感染在大多数发展中国家仍然是高度普遍由于社会经济状况和卫生条件6]。普遍被报道为79.1%、63.4%、和54.7%在非洲,拉丁美洲和亚洲,分别在北美,只有37.1%左右(2]。在约旦,全国seroprevalence幽门螺旋杆菌是2018年的88.6%左右(7]。的患病率幽门螺旋杆菌在约旦胃炎和消化性溃疡患者,肠胃型腺癌和腺癌为82%,55.6%,和48.8%,分别为(8,9]。在2018年,我们表明,所有牙菌斑样本来自一群约旦志愿者阳性幽门螺旋杆菌(10]。
据报道,在胃化生和腺癌,CagA艾滋病患者幽门螺旋杆菌压力导致p53的损失函数(11,12),而其他研究发现p53表达肿瘤出现前的患者病变粘膜的感染幽门螺旋杆菌(13,14]。此外,患者的慢性胃炎和胃溃疡,野生型p53的表达被发现调节发炎组织(15]。增加表达野生型53也被发现在回应幽门螺旋杆菌体外感染(16,17]。另一项研究发现,幽门螺旋杆菌感染可以激活AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 (Akt1)在胃上皮细胞。反过来,Akt1导致E3连接酶的激活人类双2分钟(HDM2)和随后的p53退化18]。
p53诱导降解被认为是最常见的表型相关的氧化应激和DNA损伤感染,这是伴随着改变细胞生存和凋亡[19]。即使的患病率幽门螺旋杆菌在约旦高,没有研究到目前为止研究p53的表达水平胃粘膜感染的病人。因此,在这项研究中,我们分析了胃组织中p53表达约旦病人感染幽门螺旋杆菌。
2。材料和方法
2.1。人体胃样本
回顾性病例对照研究对formaldehyde-fixed石蜡包埋(FFPE)胃窦活检幽门螺旋杆菌负(n= 25)从15名男性和10个女性和收集幽门螺旋杆菌-正面的(慢性幽门螺旋杆菌pangastritis) (n= 50)收集从35岁男性和15个女性患者。样本收集2015年至2017年间的档案病理部门从两个选择转诊医疗中心(侯赛因国王医疗城)和北中部(Al-Karak政府医院)乔丹。入选标准是15 - 80岁和积极的组织病理学幽门螺旋杆菌在胃腺体正面样本和缺乏幽门螺旋杆菌控制样品。排除标准是幽门螺旋杆菌根除治疗前的三个月期间活检以及胃手术或胃癌的历史。根据记录,所有患者临床上患有腹痛、体重减轻、上腹部疼痛,呕吐,消化不良。胃组织病理学诊断为没有样品幽门螺旋杆菌感染或其他任何异常被用作消极的控制。
2.2。免疫组织化学
Formalin-fixed,石蜡包埋胃活检像之前描述的那样受到免疫组织化学染色(20.]。五μ米块部分deparaffinized在二甲苯和水化的分级系列乙醇。然后,样本在95°C加热15分钟用抗原检索缓冲抗原检索(美国Dako)。样本然后用3% H孵化2O2在室温下30分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。样品被封锁在PBS 1%牛血清白蛋白在室温下一个小时。样本然后对p53染色,幽门螺旋杆菌和DNA使用单克隆鼠标anti-p53 1抗体(sc - 126, Santa Cruz)(1: 100稀释阻断缓冲区),多克隆兔anti-urease抗体(sc - 21016, Santa Cruz)(1: 100稀释),钙粘蛋白(1:100年,sc8424), DNA和DAPI染色(Sigma-Aldrich)在室温下了两个小时。二级标记抗体免疫荧光和免疫印迹分析西部从杰克逊ImmunoResearch购买实验室发表过(21]。
2.3。西方墨点法
总蛋白提取paraffinized组织根据制造商的指示(Qproteome FFPE组织,试剂盒)。简单地说,使用二甲苯,deparaffinized部分在100年被孵化μl提取缓冲。离心后,上层清液中回收提取蛋白质。直接与样品缓冲和恢复蛋白质涨跌互现煮10分钟的95°C。然后,凝胶电泳进行了使用垂直BioRad Mini-Protean II电泳系统,美国。等量的蛋白质受到12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。蛋白质分离减少条件下了两个小时在120 V。蛋白质乐队被electrophoretically到Immobilon-P聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,MA)使用BioRad electroblotting系统(BioRad迷你Trans-Blot电泳转移细胞,美国)(22]。最后,转移进行了三个小时用在4°C 250毫安。膜被封锁的5% fat-skim牛奶Tris-buffered盐水(TBS) pH值7.5,含0.05%渐变20一小时在室温(22°C)。接下来,膜被孵化一小时在室温下anti-p53和反β肌动蛋白抗体稀释在tbs 20 - 0.05%的渐变。20分钟的膜被洗3次tbs 20 - 0.05%的渐变,然后用二次孵化与辣根过氧化物酶抗体结合。信号检测与增强化学发光系统执行(ECL Amersham),通过混合化学发光方案1和2在1:1的比例。
3所示。结果
3.1。检测幽门螺旋杆菌在使用免疫组织化学胃活组织检查
的存在幽门螺旋杆菌在胃活检证实使用荧光免疫组织化学与特定抗体的脲酶酶幽门螺旋杆菌。七十五活检组织学检测的存在幽门螺旋杆菌感染(图1)。细菌检测胃粘膜表面和内腔的腺体从所有患者幽门螺旋杆菌感染(n= 50)(图1)。没有信号幽门螺旋杆菌中检测出所有负控制样品(n= 25)(数据未显示)。
3.2。p53的表达水平胃活检感染幽门螺旋杆菌
使用荧光免疫组织化学分析p53蛋白的表达水平幽门螺旋杆菌-正面和负面的胃活检标本。在控制样本,p53荧光信号强,大多数细胞中发现无论解剖网站。此外,p53信号局部细胞核的胃腺上皮(图2(一个))。相比之下,窝藏的病人幽门螺旋杆菌没有表达p53胃腺上皮细胞的细胞核。在胃组织中p53的表达水平样本相比显著降低控制标本甚至检测不到(图2(一个))。荧光信号强度的量化ImageJ证实核p53蛋白水平显著降低感染胃腺体(图2 (b))。有趣的是,在基质细胞幽门螺旋杆菌来华的粘膜,p53表达没有从细胞核和细胞质中的本地化(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
为了进一步支持我们的研究结果,我们使用免疫印迹检查和量化p53的表达水平受感染和未感染胃活检。与免疫组织化学的研究结果一致,蛋白免疫印迹结果显示显著减少胃活检p53表达的感染幽门螺旋杆菌而未受感染的活组织检查(图3)。
(一)
(b)
4所示。讨论
幽门螺旋杆菌触发器和差别,对这些故障的p53蛋白(12),使细菌阻止细胞凋亡,在感染细胞的主要防御机制,从而确保宿主细胞通过分解p53的生存在体外和在活的有机体内(23,24]。p53的防护功能也在许多癌症受损(25,26]。我们目前的研究支撑慢性感染之间的直接关系幽门螺旋杆菌和损失的p53表达胃粘膜的上皮细胞。核p53的损失可能使胃上皮细胞容易每天成百上千的突变发生在几乎每一个细胞在体内。完整的p53保护细胞DNA损伤通过激活DNA损伤反应,随后DNA修复或细胞凋亡25]。通过这种方式,细胞通常庇护对突变可能使他们转变。
许多细菌感染现在认为是一个因素在癌症发展,但他们的协会不那么果断证明幽门螺旋杆菌(6]。幽门螺旋杆菌的cagPAI IV型分泌系统被认为是炎症和可能改变的行列式幽门螺旋杆菌(23]。我们的研究没有能够确定幽门螺旋杆菌阳性样本被感染CagA携带应变,这就需要进一步调查。
我们的数据表明,相比幽门螺旋杆菌消极的腺体,胃上皮细胞感染幽门螺旋杆菌失去了核p53表达。失去上皮细胞p53表达的不仅是相关的幽门螺旋杆菌胃腔内的腺体,也是其独特的能力逃脱粘膜防御,从而确保终身坚持,可能与更高的殖民水平和对p53表达更明显的影响。
到目前为止,所有的证据都指向一个角色的p53肿瘤抑制以及其作为核转录因子(18]。因此,p53互动、修改,和亚细胞定位在细胞质中可能揭示新的意想不到的方面的广泛研究蛋白质和治疗干预提供了理由。有趣的是,我们的研究表明p53是本地化的细胞质基质细胞感染的病人幽门螺旋杆菌。是否幽门螺旋杆菌直接或间接地影响p53的亚细胞定位和/或翻译后修饰的基质是一个悬而未决的问题,需要进一步调查。p53的定位可能影响信号转导,新陈代谢,和细胞凋亡27]。而细胞质p53的几种机制导致激活细胞凋亡的描述到目前为止,和大多数的机制调节其细胞质活动在很大程度上仍未知(28]。我们的研究表明,胞质p53的可能贡献幽门螺旋杆菌相关肿瘤形成的确切作用的基质细胞在这一过程中代表调查的有前途的新途径。
总之,我们的结果代表了一种方法,可以揭示特定细菌感染之间的因果关系和人类癌症的发展。幽门螺旋杆菌引发的损失从上皮细胞p53,这可能提高细胞增殖和抑制细胞凋亡。此外,我们的数据表明,感染细胞可能获得癌症相关的表型,从而促进潜在的,深层次的洞察幽门螺旋杆菌。更确凿的证据感染和癌症之间的联系,更重要的是开发有效的疫苗和抗生素作为预防策略。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
这个项目进行了伦理委员会批准的医学院,Mutah大学Al-Karak-Jordan,在20170号根据当地制度伦理性考量和指导方针,符合《赫尔辛基宣言》。从组织病理学部门获得人体组织是来自两个选择转诊医疗中心(侯赛因国王医疗城)和北中部乔丹(Al-Karak政府医院)。
信息披露
这个手稿提出了预印在研究广场(29日]。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
发作和玛斯概念和设计研究,获取、分析和解释数据,起草了手稿。MAL、玛斯和WH收集资源。发作,玛斯,AA, GH, DJ, WH提供行政、技术、和物质支持,监督,概念化,和设计研究,修订后的手稿。发作,玛斯、AA和GH至关重要的知识内容的修订手稿和提供行政支持。所有作者批准了最终版本的手稿。
确认
作者要感谢教授托马斯·f·迈耶,马普学会生物感染,他支持在他的实验室里进行免疫组织化学分析和Rike Zietlow仔细的校对和有用的评论。