文摘

碱性蛋白酶是一种最重要的工业酶的过度使用的洗涤剂工业、食品工业、饲料工业、制药工业、皮革工业等。60%的碱性蛋白酶生产洗涤剂行业的消费。在目前的研究中,细菌分离株能产生碱性蛋白酶的目的bio-detergent筛选中孤立隔绝电影院(尼泊尔东部的碱性发酵食品)。选择细菌隔离进一步筛查溶血活性和其他水解酶的生产。四种细菌隔离选择测试他们的能力在五个不同的发酵介质产生碱性蛋白酶。隔离BKHE产生大量的碱性蛋白酶(0.4705±0.035 U / mL / min)在发酵培养基中M2(蔗糖,11 g / L;酵母提取物、5 g / L;和生产硝酸钾,5.2 g / l, pH值9)。所选隔离被确认为芽孢杆菌amyloliquefaciensBKHE基于16 s rRNA序列和表型特征。这个菌株被发现是耐热的合流增长50°C)和耐盐10%氯化钠浓度。通用能力,细菌的分离或提纯酶的食物和洗涤剂行业具有广泛的应用前景。

1。介绍

在20世纪,也叫做有机化学的时代,沿海环境接收各种各样的陆源有机投入,不管是天然的还是人造的。其中,洗涤剂可能是最大的类技术产品为国内使用(1]。随着酶技术的兴起,洗涤剂领域的科学更先进,市场扩大。酶与不同的应用程序在洗涤剂行业,食品行业,饲料行业、制药行业、皮革行业,多肽合成,开发使用x光片(回收银的2]。其中,洗涤剂工业酶的主要消费者,在体积和价值(3),消耗掉美国约60%的所有产生的酶(4]。微生物碱性蛋白酶水解酶中,占主导地位的商业应用程序与一个重要的市场份额被枯草杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶芽孢杆菌种虫害洗衣粉应用程序(5]。碱性蛋白酶添加洗涤剂使蛋白质物质的释放从污渍6]。这些蛋白酶作为洗涤剂添加剂使用的增加主要是由于环境可接受的nonphosphate这些酶的洗涤剂清洗功能(2]。随着碱性蛋白酶;纤维素酶、脂肪酶和淀粉酶在洗涤剂配方的主要酶结合,淀粉酶是第二个最重要的酶用于洗涤剂行业(7]。

尽管protease-producing微生物、植物和动物普遍存在,微生物群落是首选由于其增长和简单的生成新的重组酶与所需的属性(8]。Protease-producing综述了微生物及其各种应用程序其他地方(2]。特别是,有许多研究生产的蛋白酶属芽孢杆菌(9- - - - - -14,许多研究声称,碱性蛋白酶产生的芽孢杆菌种虫害可以清除血迹和血凝块8,15- - - - - -17]。

芽孢杆菌物种大多从土壤分离,或从环境中直接或间接污染了土壤,但也发现在水,食物,和临床标本。这组细菌展品的生理多样性的能力,从好寒性的高温,和嗜酸性alkaliphilic;有些菌株耐盐和一些嗜盐的18]。重要的是选择一个隔离隔离细菌物种来源与适当的生理功能(19]。

我们隔离的来源是电影院,soybean-fermented食物,这是传统上被non-Brahmin尼泊尔居住在尼泊尔东部的丘陵地区,大吉岭山,和印度锡金,不丹的一些地区(20.]。其他地方的过程讨论了电影院(21]。表示是发酵的期望状态的形成一个典型的电影院味道由氨(21),所以电影院主要是碱性和pH值范围从6.6到8.5 (20.]。不同的芽孢杆菌种虫害已经从电影院之前报道来自不同地区的印度(22- - - - - -26]。筛查和bio-detergent碱性蛋白酶的生产应用程序从电影院样本不报道日期。我们选择了电影院,因为它已经是一个选择性的利基芽孢杆菌与碱性博士我们旨在分离和识别osmotolerant和耐热的芽孢杆菌sp.能够生产的碱性蛋白酶。

2。材料和方法

2.1。微生物及其维护

本研究中使用的生物隔绝电影院在营养琼脂样本。三晒干的电影院样本收集的丘陵地区Dhankuta区0.2尼泊尔。通用汽车电影院的样本均质10毫升无菌生理盐水(0.85%)。电影院的匀浆是镀系列稀释和扩散在营养琼脂其次是孵化37°C在有氧条件下24小时。隔离不同菌落形态被收集并净化文化营养琼脂板。在隔离中,革兰氏阳性和杆状细菌被进一步的研究活动。

所有的孤立的生物被冻干保存(27在−80°C)和存储长期存储和细菌偏准备研究活动。

2.2。碱性蛋白酶筛选

十革兰氏阳性杆状细菌的分离筛选与酪蛋白酸钠碱性琼脂培养基的能力产生碱性蛋白酶(0.5%胰蛋白胨、酵母提取物0.25%,0.1%葡萄糖、酪蛋白酸钠1%、0.44%柠檬酸三钠的。2 h2啊,20毫米CaCl2。6小时2啊,和1.5%琼脂(pH值:8))(10,14]。他们在30°C孵化48小时(14]。

2.3。筛查溶血活性

无菌血琼脂基础已融化,冷却到45至50°C, 5%(卷/期)无菌去纤维蛋白的血液,温暖到室温是补充道。当时媒体涌入中避免任何泡沫板。他们在37°C孵化24小时。溶血结算记录了区域的外观在殖民地(28]。

2.4。筛查水解酶的生产

淀粉分解的测试是由培养细菌淀粉琼脂(营养琼脂0.2%淀粉),孵化在37°C。48小时后板Lugol充斥着1%的碘试剂10分钟和排水。清晰的光环地区表示淀粉水解(18]。

细菌生长在营养琼脂1% CMC的纤维素分解活性。中央军委琼脂板在37°C孵化24小时。在孵化的结束,琼脂培养基被洪水淹没的水溶液中刚果红1% (w / v) 15分钟。刚果红溶液就倒了,盘子被洪水进一步治疗1 M氯化钠15分钟。形成一个清晰的水解纤维素降解[表示带29日]。

脂肪酶的生产能力在培养皿进行使用介质(组成:蛋白胨0.5%;酵母提取物0.3%;三丁酸甘油酯1%和2%琼脂蒸馏水)[30.]。培养板在30°C 48小时孵化。

脱脂奶粉,5 g 50毫升蒸馏水;琼脂,1 g的50毫升蒸馏水是热压处理过的分别在121°C,冷却到45°C,混合,注入中盘子。培养板在30°C 48小时孵化。光环地区显示蛋白酶生产(18]。

煤液化(液体)的形成被刺伤明胶琼脂测试(7.5 g / L琼脂半固体)深陷管。孵化后48 h,文化被放置在冰箱直到底部重新固化在4°C。如果水解明胶,媒介仍将液体制冷后。如果没有水解明胶,媒介将resolidify期间的时间是在冰箱里31日]。

2.5。碱性蛋白酶生产在不同的介质组成

选择的分离培养在不同的媒介生产:M1(明胶汤包含:明胶,10 g / L;酪蛋白酶水解产物,10 g / L;和生理盐水(w / v), 100 g / L;pH值(9)11];平方米包含((g / L):蔗糖,11;酵母提取物、5;5.2,硝酸钾pH9、修改没有给定成分的微量元素和最优浓度)[32];M3包含(1%葡萄糖,0.5%蛋白胨、酵母提取物0.5%,0.5% KH2PO4, 20%生理盐水、20% Na2有限公司3分别热压处理过的和最终的pH值10.0)(12];M4包含((g / L):酪蛋白,5;蛋白胨、5;酵母提取物,2;氯化钠、5;MgSO4.7H2啊,0.2;CaCl20.1;K2HPO4,1;和钠2有限公司310 pH值10.3。碳酸钠是分别热压处理过的和添加到其他介质冷却后)(33),M5包含((g / L):葡萄糖、10;蛋白胨、5;酵母提取物、5;K2HPO4,1;MgSO47;H2啊,0.2;Na2有限公司3,10;氯化钠、5;pH值10.5)(13]。所有的实验都在37°C, 120 rpm, 48小时的潜伏期。

2.6。蛋白酶试验

反应混合物在11毫升的总量是由5毫升的0.65%酪蛋白在50 mM磷酸钾缓冲,pH值7.5,1毫升的酶解,0.75毫升和0.5毫升3不同的测试集。10分钟后孵化在37°C, 5毫升的反应是终止110毫米三氯乙酸紧随其后的另一个孵化30分钟在37°C。2毫升测试滤液,5毫升的500毫米碳酸钠添加1毫升1 M Folin-Ciocalteu紧随其后的酚试剂。反应混合物在37°C孵化了30分钟,然后允许冷却至室温和测试滤液吸光度测量在660 nm空白和标准溶液在紫外- 1800日本岛津公司分光光度计。一个单位的蛋白酶活动被定义为酶的释放量1μ摩尔酪氨酸每分钟在试验条件下(34]。

2.7。选择细菌隔离的识别
2.7.1。的分子特征选择的隔离

16 s rRNA基因的DNA提取和测序:细菌隔离BKHE在10毫升营养肉汤培养。孵化进行24小时的37°C。细菌的基因组DNA是孤立的过程Sambrook和罗素35]。

16 s rRNA基因的细菌隔离使用通用引物扩增FL (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492 r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) (36]。放大部分纯化和测序Macrogen Inc .,韩国利用测序引物785 f (5′-GGATTAGATACCATGGTA-3′)和907 r (5′20 TCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

原始序列组装和减少使用密码子代码调整器。生成的序列重叠群受到BLASTN和数据库选择“核糖体rna /数据库”。十二个高度相似的序列(基于爆炸结果)被FASTA格式进行系统发育分析。

2.7.2。最大的吝啬分类单元的分析

进化历史使用最大的吝啬方法推断。引导共识树推断从1000年复制被代表类群的进化历史分析(37]。议员树得到使用tree-bisection-regrafting(创业)算法(38)与搜索级别1的初始树得到的随机序列(10复制)。这种分析涉及13个核苷酸序列。所有职位只有不到95%的站点覆盖率都消除,即。,fewer than 5% alignment gaps, missing data, and ambiguous bases were allowed at any position (partial deletion option). Evolutionary analysis was conducted in MEGA X [39]。

2.7.3。形态学和生化特征

所选protease-producing隔离BKHE被确认使用形态学和生物化学特征,根据-Bergey系统性细菌学手册(18]虽然糖利用率测试执行制造商的指令使用Himedia KB009TM HiCarbo工具包(KB009A / KB009B1 / KB009C)。

2.8。盐和耐温性测试选择的压力

耐温性,生物在营养肉汤培养,培养在不同的温度下(30°C, 40°C, 45°C, 50°C, 60°C)和盐耐受性,生物体在营养肉汤培养与不同盐浓度(2%、6%和10% (w / v)) (18]。细胞密度使用DEN-1B格兰特生物密度计测量。18φ试管被用于生成数据和数据得到麦克法兰标准。

2.9。统计分析

数据分析使用OriginPro 9.0, IBM SPSS 15.0和Microsoft excel。定量数据进行了方差分析,图基测试是用来比较的手段在95%置信区间。

3所示。结果

3.1。分离和筛选

纯化分离株中,只有10隔离是革兰氏阳性和杆状细菌。只有革兰氏阳性和杆状细菌进一步筛查碱性蛋白酶活动。图1说明三个革兰氏阳性和杆状细菌。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图1
革兰氏阳性的显微观察隔离(1000 x): (a)隔离BKTD;(b)隔离BKHA;(c)隔离BKHE。
3.2。筛查碱性蛋白酶积极的隔离

9中选择隔离研究酪蛋白水解,分离BKTB, BKHB, BKHC, BKHD被发现产生小得多的光环区相比,隔离BKTC(6.33毫米,SE = 0.88) 信心水平。光环的直径的差异区域的隔离BKTD(3.33毫米,SE = 0.33), BKRK(4.66毫米,SE = 0.33), BKHA(4.33毫米,SE = 0.33),和BKHE(5.66毫米,SE = 0.67)是无关紧要的 置信水平,如图2。一个选定的隔离(BKTA)呈负导致酪蛋白水解。


图2
比较晕区由不同的细菌分离酪蛋白酸钠琼脂。 光环带的平均直径明显降低与BKTC平均值的比较α= 0.05。
3.3。筛查溶血活性和水解酶的生产

进一步筛选细菌分离是基于其功能其他水解酶水解血细胞和生产。结果如表所示1、隔离BKTB BKTC BKTD, BKRK, BKHE被发现β溶血。随着溶血特性,这些分离株能产生其他水解酶蛋白酶后广泛应用于洗涤剂配方。图3所产生的水解酶的一个孤立的BKHE。

表1
溶血性和水解酶活动的结果。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
水解酶生产测试隔离BKHE: (a)碱性蛋白酶筛选在酪蛋白酸钠琼脂(pH值:8);(b)蛋白酶在脱脂牛奶琼脂筛选;(c)脂肪酶在三丁酸甘油酯琼脂筛选;(d)淀粉酶在淀粉琼脂筛选。
3.4。碱性蛋白酶生产在不同的介质成分

one-waybetween-groups分析观察不同细菌分离株的酶活性(图4(一)),和图4 (b)阐述了酶活性在不同媒介生产。虽然比较意味着不同媒介之间的酶活性成分由不同的菌株,发酵肉汤游离的隔离BKHE (0.4705 U / mL / min, SE = 0.035)和BKTC (0.3252 U / mL / min, SE = 0.031)显示显著高酶活性在生产中M2 置信水平;游离发酵肉汤BKTD (0.155 U / mL / min, SE = 0.059)和BKRK (0.193 U / mL / min, SE = 0.015)显示显著高酶活性在生产中M3 信心水平,如图4(一)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
比较酶碱性蛋白酶活动所产生的不同的细菌隔离(a)和生产媒介(b)。

虽然比较意味着不同细菌分离株之间的酶活性,细胞游离发酵肉汤的隔离BKHE在生产中M2显示显著高酶活性比其他细菌隔离 信心水平。所以,高分离酶被发现隔离BKHE和最好的生产介质相比的其中之一是生产介质平方米。

3.5。选择细菌鉴定
3.5.1。的分子特征选择的隔离

基于16 s rRNA基因序列分析,隔离BKHE显示高序列相似性属的成员芽孢杆菌(图5)。爆炸的结果在“16 s rrna序列(细菌和古生菌)”数据库BKHE显示,99.93%相似芽孢杆菌amyloliquefaciens应变NBRC 15535;99.86%的相似度b . amyloliquefaciens应变BCRC 11601;99.59%的相似度b . velezensis应变FZB42和b . valismortis应变DSM 11031;99.52%的相似度b . nematocida应变B-16,枯草芽孢杆菌168年微小应变,b . nakamurai应变NRRL b - 41091。


图5
最大的吝啬从16 s rRNA序列数据生成的树。分支对应于在不到50%的引导分区复制复制崩溃。的比例复制的树分类群聚集在一起,引导相关测试显示下一个分支。
3.5.2。表型的描述b . amyloliquefaciensBKHE

Gram-stain-positive棒大小3 - 5μm,运动型,耐热的,接近端点的椭圆形孢子形成的。在营养琼脂培养基上肮脏的白色,光滑,有点黏,微微举起和圆形,大约3 - 4毫米直径24小时后在37°C。过氧化氢酶阳性但氧化酶阴性。阳性乙偶姻,白明胶酶、脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶生产但消极吲哚、硫化氢、脲酶,纤维素和精氨酸dihydrolase。硝酸盐降低亚硝酸盐。柠檬酸是利用但不是丙二酸酯。它能够利用麦芽糖、果糖、葡萄糖、海藻糖、蔗糖、甘油、山梨醇、甘露醇和纤维二糖。对环丙沙星(mcf) 30日是敏感,庆大霉素(mcf)。10日,四环素(mcf) 30日,莫西沙星(mcf) 5、左氧氟沙星(mcf) 5、阿奇霉素(mcf) 15日,红霉素(mcf) 15日,万古霉素(mcf) 30日,和利福平(mcf) 5。增长高达10%的氯化钠。汇合的增长报道50°C。 Confluent growth up to pH 9.5 and no growth at pH 4.5 was reported.

3.6。盐宽容和耐温性测试选择的压力

选择压力b . amyloliqueficiensBKHE生长在不同盐浓度。细胞密度没有明显不同的介质中不同盐浓度 如图的信心水平6(一)。细胞密度在10%氯化钠浓度为2.05±0.07 MF。也是在营养肉汤培养孵化在不同温度下,观察高细胞密度在45°C (4.55 MF, SE = 0.21)明显高于细胞密度孵化时30°C, 40°C, 50°C, 60°C 置信水平,如图6 (b)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
比较的细胞密度b . amyloliqueficiensBKHE (a)在不同盐浓度和(b)在不同的温度下(b)。

4所示。讨论

我们已经确定了碱性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和surfactant-producingb . amyloliquefaciens应变BKHE,孤立的从尼泊尔东部电影院样本。只有隔离粘性殖民地纹理、革兰氏阳性和杆状筛选在碱性蛋白酶的生产的基本特征芽孢杆菌spp [18]。在九个碱性protease-positive菌株,其中五(BKTB, BKTC, BKTD BKRK, BKHE)能够水解血细胞。但筛查碱性蛋白酶的结果表明,隔离BKTD产生晕区明显较小,相比与其他hemolysis-positive隔离。BKTD,所以,只有隔离BKTC BKRK, BKHE相比进一步定量的生产碱性蛋白酶生产在不同的媒介。溶血性活动可能表明细菌分离是生物表面活性剂生产商,尽管其他各种裂解酶产生的压力可能导致溶血(41]。生物表面活性剂及其广泛的应用,也是抗菌素(42]。所以,产品从溶血性细菌连同蛋白酶活动可以有效地用于医院清除泄漏和血凝块和杀死传染性微生物。另一个筛选参数的能力生产其它水解酶。因为其他酶如淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶也用于洗涤剂配方、生产能力这些将具有重要意义。在四个选择的隔离,BKTC和BKTD被发现生产的水解酶,而BKHE和BKRK纤维素酶-(从表1)。由于酶的生产成本和下游过程成本很高,重要的是要降低成本,使这些酶的洗涤剂行业。生产多种水解酶的好处是,可以联合多个酶在同一发酵媒体同样的菌株。这些酶在洗涤剂行业不仅一起使用,这些都是一起使用的食品和制药行业。协同生产的鸡尾酒酶是降低生产成本的一种方法,这些方法被其他研究人员发现实际(4,7,43]。

在四个隔离选中,最高的碱性蛋白酶是由BKHE中等M2(蔗糖,11 g / L;酵母提取物、5 g / L;和生产硝酸钾,5.2 g / l, pH值9)。虽然比较不同的媒体组合,M2中被发现是最好的媒介相比。BKTC还显示高生产(显著高与BKTD BKRK但相比显著低与BKHE相比的置信水平 )本文只处理初步筛选和媒体选择碱性蛋白酶的生产。最优条件尚未确定生产碱性蛋白酶的生产。最优条件取决于温度、pH值、媒体组合、氧转移速率,不同的菌株(13,32,44- - - - - -49]。所以,有许多因素要考虑最优生产从选定的隔离。在我们的研究中,媒介M2中已被确认为最好的媒介选择的蛋白酶生产。蔗糖在中诱发蛋白酶生产(32)和硝酸盐有助于加快生产(50]。而在一些,酵母提取物给高蛋白酶比硝酸生产[13),在一些凝胶诱导蛋白酶生产(11]。还报告更好的碱性生产的葡萄糖作为碳源,酵母膏和蛋白胨作为有机氮源(12,33]。结果显示我们的分离为不同的隔离也不同。BKHE产生高碱性蛋白酶的酵母提取物,蔗糖,硝酸钾和低生产gelatin-based,葡萄糖基媒介等。因此,选择适当的碳和氮源是高度依赖于菌株,需要优化的按压力的要求。

16 s rRNA测序表明,隔离是“芽孢杆菌amyloliquefaciensBKHE”,并进一步研究了菌株的表型特征总结与多相分类方法(18,51]。的表型特征选择的应变与表型特征进行比较b . amyloliquefaciens(18]b . velezensis(40),b . valismortis(18从数据库中获得。因为爆炸和系统发育分析结果(图6)表明该菌株属于b . amyloliquefaciens但区分利润与其他物种。虽然比较表型特性表2,BKHE发现匹配的大部分功能b . amyloliqueficiens观察到,唯一的差异是棉子糖的发酵和水杨苷。b . amyloliqueficiens和BKHE氧化酶类负面b . velezensis和b . valismortis是积极的。BKHE,不同的表型特征b . velezensis硫化氢生产利用乳糖、木糖、棉子糖、蜜二糖,L-arabinose,甘露糖,水杨苷,肌醇,α-methyl-D-glucoside, ONPG如表所示。BKHE和之间的差异b . valismortis也可以观察到表2。的基础上的16 s rRNA测序和表型特征应变BKHE,它被认定为“b . amyloliqueficiensBKHE。”

表2
的表型特征选择与密切相关的物种隔离和比较基于爆炸的结果。

碱性蛋白酶与活动等理想的属性高pH值、温度和盐度、适用于商业应用在洗涤剂行业(44,52]。从超嗜热菌蛋白酶嗜热微生物的自然选择是探索固有的热稳定性(53]。因此,探索生态区位等极端或高温、pH值、盐度、压力,和毒性是一个有前途的方法来隔离微生物所需的属性(19,53]。电影院,也被碱性和干,适合分离碱性protease-positive隔离的利基。b . amyloliquefaciensBKHE被发现汇合的增长50°C的电影院样本是晒干的和耐热的菌株能够应对干燥过程。同时,这一毒株被发现耐受高盐浓度和pH值,所以从这个隔离可用于碱性蛋白酶生产配方bio-detergent,虽然进一步筛选纯化酶尚未完成。同时,这一毒株可以用于协同生产的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶,也用于洗涤剂配方。

5。结论

细菌被认定为高碱性protease-producing隔离能力b . amyloliquefaciensBKHE基于16 s rRNA序列和表型特征。纤维素酶的菌株被发现消极的和积极的蛋白酶,淀粉酶和脂肪酶。同时,其耐高温的能力和渗透性开门的多功能应用细菌或酶在食品、饲料、和洗涤剂行业。因为我们的应变产生多种酶,可用于多种酶的协同生产可用于洗涤剂和食品行业。

数据可用性

数据可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN121504

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者谢天谢地承认Shubham生物技术尼泊尔pvt Ltd .)和LOFAB加德满都大学的实验室,提供了研究空间。他们感谢Dinesh女子先生和拉库马Shrestha在研究活动的支持。这项工作是由生物技术研发中心私人有限公司(2073/074)和尼泊尔Shubham生物技术私人有限公司(2073/074)。