文摘
探索内生细菌的研究Arcangelisia黄颜色(l)和他们的潜力已经不多了。本研究旨在探索和描述植物内生细菌的抗菌活性答:黄颜色对致病细菌。这项研究由几个步骤包括隔离细菌,筛选抗菌活性的测定使用双横条纹的方法,通过16 s rDNA分子识别分析和表征生物活性化合物的生产通过PKS-NRPS基因检测和gc - ms分析。有29日成功地分离出内生细菌答:黄颜色。抗菌活性表明,有四个潜在的隔离AKEBG21 AKEBG23, AKEBG25, AKEBG28可以抑制病原菌的生长等大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,和铜绿假单胞菌。16 s rDNA序列分析表明,这些隔离标识为蜡样芽胞杆菌。这四个隔离被认为是能够产生酮化合物的生物活性化合物通过检测合酶(PKS)和nonribosomal肽合成酶(nrp)编码基因。b的仙人掌AKEBG23最高抑制病原菌,根据gc - ms分析,五个主要化合物是涉嫌参与其抗菌活性如丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚),邻苯二甲酸二异辛酯,E-15-heptadecenal 1-heneicosanol, E-14-hexadecenal。这个结果暗示,b的仙人掌AKEBG23作为植物内生细菌答:黄颜色有一个有益的作用以及植物本身。细菌产生的几种生物活性化合物,涉嫌参与其对病原菌的抗菌活性。
1。介绍
Enggano岛是一个外岛在印尼的管理属于明古鲁省(图1)。外的岛屿,Enggano花卉等生态系统的多样性高的红树林,海滩,河岸,自然森林,沼泽生态系统。高植物多样性Enggano包括药用植物利用当地居民作为传统医学的继承了前代(1]。Arcangelisia黄颜色(l)是Enggano中的药用植物之一。当地人叫“kayu库恩”(黄)或“akar库恩”(黄色的根),通常包括三个不同的物种,如Arcangelisia黄颜色(l),Fibraurea tinctoria和Coscinium fenestratum(2]。答:黄颜色是广泛分布在印尼,如在朝贡、加里曼丹、苏拉威西、Java和马鲁古群岛(3]。
当地的人们使用答:黄颜色植物来治疗一些疾病,如疟疾、痢疾,和发烧4,5]。之前的研究也显示的效力答:黄颜色生产者的一种抗氧化剂,抗糖尿病的抗菌化合物如小檗碱(6- - - - - -8]。先前的研究也报道称,生物碱提取物答:黄颜色。有潜力又有些皮肤保护方面的新治疗真菌感染引起的吗白色念珠菌和毛癣菌属mentagrophytes(6]。
的潜力答:黄颜色作为药用植物中发现的不仅是植物代谢物的直接使用,而且其内生细菌驻留。一些植物内生微生物分离答:黄颜色树叶产生的抗菌化合物。先前的研究报道,腔孢纲AFKR-18,内生真菌分离黄色的,生产pachybasin为最主要的抗菌和抗真菌的化合物大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、微球菌危害,白色念珠菌,黄曲霉(9]。腔孢纲还生产间苯三酚具有较强的抗菌活性大肠杆菌(10]。而不是真菌,最近的一项研究也报道称,一些植物内生细菌答:黄颜色有抗菌活性,例如蜡样芽胞杆菌AKEBG28,抗菌活性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(11]。
根据这些研究,内生微生物答:黄颜色有潜力的抗菌化合物生产国。植物内生细菌的数据答:黄颜色从Enggano岛还没有得到深入研究,尤其是相关有益的微生物产生的化合物。因此,本研究的目的是描述植物内生细菌隔绝答:黄颜色起源于Enggano岛antimicrobe潜力,开展生物活性化合物的分析产生的细菌。
2。材料和方法
2.1。样品收集
的答:黄颜色收集的样本Enggano岛(图1)。工厂收集和分成3部分根,茎,叶,每个样本存储并将用作微生物源隔离。
2.2。细菌的分离和纯化
分离内生细菌进行了使用连续稀释法从10−1到10−8。植物组织surface-sterilized,压碎,无菌生理盐水稀释。高达0.1毫升每个稀释接种营养琼脂(NA)中使用扩散板的方法和孵化在30°C 24 - 48小时。种植的殖民地被接种到新的NA然后逐渐净化介质。
2.3。抗菌试验
筛选潜在的抗菌隔离执行使用横条纹的方法(12)与一些修改与四个致病微生物,即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌。隔离是培养在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)和调整使用的麦克法兰浊度标准0.5,这样细胞达到1.5×108CFU。高达1% (v / v)的致病微生物接种到100毫升的胰蛋白酶的大豆琼脂(TSA)±40°C,匀浆,倒到无菌培养皿中。TSA的内生细菌被条纹中含有致病微生物和孵化30°C 48小时。潜在的内生细菌周围明确区表示抗菌活性。区域的直径测量,以确定每个孤立的抗菌性质的力量。进一步抗菌试验所选潜在隔离执行类似的方法有三个复制。进行了分析通过使用一个纯菌落,滤液中,细胞颗粒,乙酸乙酯提取物。至于滤液和乙酸乙酯提取、使用的抗菌试验是磁盘扩散法(13,14]。
2.4。识别的细菌
16 s rDNA的测序是用来识别植物内生细菌。几个选择隔离种植在NA 48 h进行DNA提取。DNA提取使用Geneaid转眼间细菌的DNA提取工具包(Geneaid生物科技有限公司;新台北市,TW)根据制造商提供的标准协议。纯粹的基因组DNA被放大16 s rDNA使用通用引物63 f / 1387 r (15)使用T100热循环仪(Bio-Rad实验室;赫拉克勒斯、钙、美国)。PCR产物测序使用Sanger测序方法外包在实验室服务。分析了16 s rDNA序列使用ChromasPro软件(版本1.7.7;Technelysium Pte Ltd .);南布里斯班昆士兰,AU)质量检查和调整的过程。与会的正向和反向16 s rDNA序列相比,在线数据库资源库通过基本的局部比对工具核苷酸(BLAST-N) [16]。neighbor-joining树生成使用大型版本7.0 (17与1000 x]用引导的方法,复制。
2.5。生物活性化合物的提取和分析
生物活性化合物的分析是通过乙酸乙酯提取,然后继续在气相色谱分光光度法(gc - ms)分析。多达10毫升的24 h潜在的细菌分离株接种到1 L TSB介质,暂停在瓶孵化器孵化30°C 72 h。潜在的代谢物的提取分离是由乙酸乙酯的加入1:1 (v / v)和震动了20分钟。悬挂的上层(溶剂层)被分离和旋转蒸发器蒸发了42°C。然后蒸发提取获得加权和稀释1毫升二甲亚砜(DMSO)来确定浓度50%。gc - ms分析用日本岛津公司GC-MS-QP 2010(日本岛津公司公司;东京,日本)与RTX-5MS列。质谱的结果相比,当时国家标准与技术研究所(NIST)数据库版本11 (NIST;美国马里兰州盖瑟斯堡)。
2.6。战,NRPS-Encoding基因的扩增
放大的酮化合物合酶(PKS)和nonribosomal肽合成酶(nrp)编码基因进行选择的潜在的抗菌活性最高的隔离。PKS-encoding基因是ketosynthase放大使用特定的引物(KS)领域,degKS2F。gc 5′- GCSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3′和反向引物,deg.KSR5。gc 5′-GTSCCSGTSCCRTGSSCYTCSAC-3′NRPS-encoding基因放大时使用域nrp特定底漆deg.NRPS-1F向前发展。我5′-AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3和反向deg.NRPS-4R。我5′-CKRWAICCICKIAIYTTIAYYTG-3′(18]。PCR扩增T100热循环仪进行使用与PCR混合后,1μ每个引物(10 LμM), 1μL LATaq聚合酶(豆类;豆类生物;美国加利福尼亚州山景城),25岁μL 2 x缓冲与GC, 3μL纯粹的基因组DNA, nuclease-free水50μl .这些two-primer对PCR条件相同。多达30 PCR周期由以下步骤组成:初始变性在94°C 5分钟,变性在94°C 2分钟,退火60°C 1分钟,在72°C 1分钟扩展,最终72°C伸长10分钟。
3所示。结果与讨论
3.1。隔离和潜在内生细菌的筛选
有29个植物内生细菌分离成功分离出根,叶,干的答:黄颜色通过连续稀释法。这些隔离所表有不同的形态特征1。大约29隔离被筛选抗菌活性使用cross-streak方法金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白念珠菌。潜在的抗菌隔离(表显示周围明确区殖民地1)。
根据筛选结果,四个隔离定性抑制的增长潜力金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,即AKEBG21 AKEBG23、AKEBG25 AKEBG28。从干的这些都隔离了A.flava和有相似的形态特征,如浅色殖民地,杆状,革兰氏阳性(图2)。这些隔离将用于进一步抗菌试验。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。选定的内生细菌的抗菌活性
四个选择隔离测试进行进一步的抗菌活性大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,白念珠菌。隔离是生长在一夜之间TSB和离心浓缩细胞和分离细胞和它的媒介。纯的试验进行了隔离,颗粒状细胞,上层清液(媒介)、隔离和乙酸乙酯提取。根据分析,隔离可以抑制增长大肠杆菌和金黄色葡萄球菌要么纯粹形式的隔离,颗粒状细胞,上层清液(媒介),和乙酸乙酯提取物。然而,只有所有隔离的乙酸乙酯提取物能抑制铜绿假单胞菌相对较高的活动比滤液和颗粒状细胞(表2)。
隔离AKEBG23最高和最稳定的抗菌活性在四个分离株对病原菌进行测试。通常,抗菌活性被发现在纯隔离和乙酸乙酯提取高于颗粒状细胞和上层清液。先前的研究报道,从细菌分离株主要是浮在表面的游离没有抗菌活性金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。但是这些隔离的粗提取液有明显的抗菌活性(19]。相反,Danilova et al。20.)报道,浮层乳杆菌对食品变质和病原菌的抗菌活性。据说这是由于两种细菌产生细胞外地的抗菌化合物。根据这些前研究方法有效,那它就可以知道抗菌化合物可以发现在上层清液游离或粗提取液的细菌。
3.3。识别选择潜在的隔离
四个潜在的分离获得被确定通过16 s rDNA的测序。16 s rDNA序列与基因银行在线数据库使用BLAST-N [16)与一组搜索限制类型的材料,这样的DNA序列用于识别策划和有效识别。根据系统发育树分析(图3),所有的隔离都密切相关蜡样芽胞杆菌。它也支持的形态特征(表1),提到隔离AKEBG21、AKEBG23 AKEBG25 AKEBG28杆状,革兰氏阳性细菌的主要形态特征芽孢杆菌。
3.4。战,NRPS-Encoding基因的扩增
除了识别,检测酮化合物合酶(PKS)和nonribosomal肽合成酶(nrp)编码基因也进行了确定每个孤立产生的潜在生物活性化合物。战,NRPS-encoding基因的检测进行了使用特定的引物对degKS2F.gc / degKSR5。gc的与其生产700 bp扩增子和degNRPS-1F.i / degNRPS-4R。我nrp产生1000个基点扩增子(18]。
根据放大,这四个选择隔离有战,nrp基因标明可能产生生物活性化合物。序列分析通过BLAST-X b .仙人掌AKEBG21 PKS 6-deoxyerythronolide-B合成酶基因密切相关,glutamate-1-semialdehyde 2,从肠杆菌1-aminomutase泄殖腔,和b .仙人掌AKEBG23 AKEBG25, AKEBG28 PKS和枯草芽孢杆菌基因关闭ketosynthase I型(表3)。6-deoxyerythronolide-B合成酶和glutamate-1-semialdehyde 1-aminomutaseb的仙人掌AKEBG21被检测到酶从AKE KS-domain密切相关。根据保守域数据库,它的股票类似PksD域与酮化合物合酶(PKS)总科冷凝酶和脱羧基冷凝酶家族21]。
nrp基因分析表明,所有放大nrp片段是密切相关的芽孢杆菌(表nrp基因与不同的相似之处4)。先前的研究已经表明了这一点枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌强直与抗菌活性弧菌物种还窝藏PKS和nrp基因(22]。酮化合物合酶(PKS)和nonribosomal肽合成酶的酶多畴的负责生产生物活性化合物在许多微生物,特别是细菌、放线菌和真菌。此外,nrp与其基因有一个重要的角色在生物活性化合物生物合成肽的组成如多肽和lipopeptides [23]。
3.5。分析的活性化合物
抗菌活性最高的隔离,GC - MS的b的仙人掌AKEBG23乙酸乙酯提取显示有16个生物活性化合物粗提物中标识(图4)。据称,这些生物活性化合物直接或间接参与的抗菌活性b的仙人掌AKEBG23对四种致病菌。有五个主要的化合物与抗菌活性有关,也就是说,丁羟甲苯、邻苯二甲酸二异辛酯,E-15-heptadecenal, 1-heneicosanol和E-14-hexadecenal(表5)。
丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)被认为是一种抗氧化剂,这是常用的作为一个标准的抗氧化剂(51]。这种化合物被发现的最高检测化合物gc - ms分析。与其控制氧化过程,二叔丁基对甲酚也是报道的生物活性抗菌金黄色葡萄球菌(52]。另一个研究也报道,二叔丁基对甲酚还发现提取的绿藻栅藻obliquus与抗菌生物活性(31日]。
第二最高检测化合物主要是邻苯二甲酸二异辛酯称为人造污染物邻苯二甲酸酯(PAE)。然而,一些研究报道,PAE股权是由植物和微生物。PAE也据报道他感作用,抗菌和杀虫活动增加生产者的竞争力(53]。邻苯二甲酸二异辛酯是真菌产生的PAE之一尖孢镰刀菌和Phoma herbarum和微藻念珠藻属sp。它也有抗菌活性金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、毛癣菌属mentagrophytes,和白色念珠菌(50,54]。由细菌产生的报告与邻苯二甲酸二异辛酯是有限的;这可能是一个新的报告,发现在细菌、邻苯二甲酸二异辛酯b .仙人掌。
另一个主要的化合物中发现b的仙人掌E-15-heptaedecenal AKEBG23乙酸乙酯提取,1-heneicosanol, E-14-hexadecenal。E-15-heptadecenal和E-14-hexadecenal参与抗真菌活性。E-15-heptaedecenal中发现的b . siamensis概要文件是涉嫌参与活性化合物抗菌活性b . siamensis对一些植物病原真菌(C.3832),而E-14-hexadecenal内生真菌的抗真菌中含有的生物活性化合物Pseudarthria viscida(l) [25,55]。1-Heneicosanol是长链脂肪醇,据报道,对一些病原菌抗菌活性。一些研究报道,1-heneicosanol是植物中发现狗舌草coluhuapiensis和放线菌链霉菌属carpaticus(39,56]。
数据可用性
gc - ms, PKS和nrp序列数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
作者Sipriyadi和Masrukhin同样导致了这项工作。
确认
本研究支持的研究和社区服务中心(LPPM)明古鲁到2019年大学的科研补助金2177号/ UN30.15 LT / 2019日期为7月10日,2019年,和支持格兰特FKIK教员明古鲁到2020年大学的科研补助金(Hibah Penelitian Unggulan FKIK)号码:2338 / UN30.14 /香港/ 2020年8月24日,2020年。作者也感激Enggano岛的人,明古鲁省,和各方帮助完成这项研究。