文摘

Hydrocarbon-derived污染物正在成为最有关的生态问题之一。因此,有必要研究和开发创新、低成本、环保、快速的技术使用生物制剂减少和/或消除污染物。孤立的研究,描述和识别潜在diesel-degrading细菌。样本收集花卉农场、湖滨、老年龄车库,沥青,沥青土壤和传播选择性培养基(布什内尔哈斯矿物盐琼脂)包含柴油作为生长基质。隔离是基于其增长模式特征使用光密度测量、生化试验、重量分析和确定使用生物测井数据库和16 s rRNA基因测序技术。随后,六柴油降能器识别并属于假单胞菌,Providencia,Roseomonas,Stenotrophomonas,无色菌,芽孢杆菌。其中,基于重量分析,三个强大的隔离AAUW23, AAUG11,和AAUG36达到84%,83.4%,和83%的柴油降解效率,分别在15天。因此,部分16 s rRNA基因序列显示,两个最强大的菌株(AAUW23和AAUG11)铜绿假单胞菌,而AAUG36枯草芽孢杆菌。本研究表明,细菌物种从hydrocarbon-contaminated分离和/或未被污染的环境可以优化作为潜在的生物修复剂柴油移除。

1。背景

碳氢化合物,如多环芳烃(多环芳烃)、苯、煤油和柴油是重要的有机污染物,输入不同的行业,汽车,和家庭活动的能量来源(1- - - - - -8]。其中,柴油大规模用于发动机,燃料和工业应用。它是石油化合物形成的产品在原油分馏和9之间的混合物组成的碳链和25可能包括芳香族和脂肪族烃的碳原子组件(4,6,9]。这些碳氢化合物组件可以排入环境(地下水、土壤和空气)来自不同来源(点和非点源的),如车库、加油站服务、化工和石化行业,农业废弃物,汽车尾气泄漏的石油、径流沥青路面,车辆排放,燃烧化石燃料(10- - - - - -12]。这种现象可能有意或无意地主要来自人为活动由于城市化、工业化,和文明3,10,11,13- - - - - -15),在某种程度上,由自然灾害(16]。因此,hydrocarbon-derived污染物immuno-toxicant,诱变,对人类和动物致癌和影响自然生态系统功能在许多方面(2- - - - - -4,6,7,14,15,17- - - - - -21]。

有不同的方法降低碳氢化合物的污染。这些包括机械、化学和生物方法。前两个提到的污染物减排需要高运营成本和容易二次污染,需要综合污染管理减少和/或删除从环境中有毒污染物(13,22]。另一方面,生物方法(生物修复)是一种很有前途的技术,突出,环保,节省成本,高效和容易适用于治疗hydrocarbon-contaminated环境(3,8,11,15,16,19,23- - - - - -26),但它需要很长时间完成污染物的降解(27]。这种方法主要依赖于两种主要的方法,即生物强化和促生22]。生物强化包括介绍选择hydrocarbon-degrading微生物菌株或财团污染环境来提高已经存在的潜在的微生物群落的生物降解过程(11,18,22,23,28]。然而,促生从事宏观和微量营养素的修正案,维持物理参数(pH值、温度和曝气),和供应表面活性的物质(表面活性剂)在受污染的网站优化土壤条件,提高生物降解增加土著(天然)的增长率hydrocarbon-degrading微生物(4,6,11,17,18,22,29日]。这种技术可以应用原位和非原位28)加强生物降解通过增加污染物的生物利用度和本地的增长率(土著和原地)hydrocarbon-degrading微生物(23]。因此,潜在的微生物利用hydrocarbon-derived污染物作为碳源和能源27,30.)和/或cometabolites,最后导致污染物的完整的矿化二氧化碳,水,矿物盐,和生物量2,3,11,13,19,25,31日]。

许多研究表明,不同的微生物或微生物群落,即细菌、真菌、酵母、原生动物、藻类、烃类污染物的生物降解中发挥重要作用,其中,细菌是最主要的活性下降(3,14,15,19,21,31日]。hydrocarbon-degrading细菌无处不在(6),其中最著名的属:无色菌,Marinobacter,Actinobacter,产碱杆菌属,分枝杆菌,节细菌属,芽孢杆菌,红球菌属,棒状杆菌属,微球菌,Flavobacter,诺卡氏菌属,Bravibacterium,链球菌,芽孢杆菌,Stenotrophomonas,Methylobacterium,肠杆菌属,假单胞菌(4,5,26,31日- - - - - -34]。烃类污染物的生物降解与解毒效果是由于各自不同的酶的活动包括水解酶、氧化酶,demethylase, dehalogenases,转移酶和氧化还原酶,可以催化不同的降解途径耗氧或厌氧3,4,11,15,24,30.,33,35),以及有效的繁殖潜力(16]。这些酶,这通常是由基因位于染色体或质粒DNA编码(30.,35),可以在各种各样的碳氢化合物通过有氧或无氧的路线(3,4,11,15,24,33]。碳氢化合物的快速和绝对退化或其他有机污染物是通过有氧条件(21,27,30.,35,36]。

需氧生物降解主要是利用加氧酶酶(单氧酶和加双氧酶)(12,26烷基侧链的氧化攻击和芳香环的羟基化(苯、甲苯、二甲苯和萘)。然而,厌氧降解是由厌氧或兼性细菌催化使用不同的最终电子受体,如硫酸、硝酸铁、锰,和有限公司2(26,30.,37]。的第一步氧化生物降解途径的激活环劈理(元或昊图公司乳沟)通过羟基化使用加氧酶酶(12,35]。短期和长链碳氢化合物氧化相应的酒精,由乙醇脱氢酶后转化成醛,和醛氧化成醛脱氢酶的酸。因此,产生的脂肪酸通过醋酸ß-oxidation系统(even-chain烷烃)和丙酸(odd-chain烷烃)。烃产品随后最终氧化成三羧酸循环中间体和矿化有限公司2和水(12,38]。因此,土著微生物能降解hydrocarbon-derived污染物通过自然补救或衰减到更少的环境中或无毒形式(3,10- - - - - -12,16]。然而,自然衰减通常是有限时缺乏适当的营养可用性、高能力的微生物群,和必要的分解代谢的基因完成烃降解[39]。此外,个别细菌只能有限范围的碳氢化合物代谢基质,如烷烃、和其他石蜡的芳香,但细菌财团与广泛的酶能力需要协同降解污染物的复杂的混合物(12,16,31日]。研究还显示,成功的生物降解,hydrocarbon-degrading细菌的数量应该在10的范围4到107每克土壤(CFU13)和高得多在hydrocarbon-contaminated网站(36]。

然而,细菌群落结构和功能完整的降解受到不同因素的影响,如固有微生物种群的遗传特性(分解代谢的基因或类型的酶),一些微生物(大小),微生物缓解或交互(单应变或财团),微生物多样性(细菌、藻类和真菌),微生物竞争(协同或拮抗),碳氢化合物的性质和特征污染物(化学结构、浓度、生物利用度,和毒性级别),物理环境(养分、温度、水分活度、pH值、土壤水分、呼吸和类型的电子受体),等等(4,6,8,11,12,15,16,18,19,23,25,26,39- - - - - -42]。

许多不同属的细菌被隔离从土壤和水生环境和证明降低碳氢化合物。此外,识别土著细菌隔离等diesel-degrading能力是至关重要的成功适应当地环境当应用于回收污染的网站。在埃塞俄比亚,车库、加油站、汽车研讨会、农业废弃物、工业废水是最重要的非点源的点源污染物,污染土壤和水,影响生态系统的功能。然而,关于碳氢化合物的生物降解,缺乏信息原产于埃塞俄比亚环境的细菌隔离。因此,本研究的目的是隔离,描述,识别潜在diesel-degrading细菌hydrocarbon-contaminated样本不同的研究地点。因此,本土diesel-degrading细菌分离和筛选的有效性和进一步的特点是文化(殖民地特征),增长模式(OD),生化测试,确定使用生物测井和16 s rRNA基因测序。

2。材料和方法

2.1。研究区域

岁收集土壤样本从旧网站,如车库(亚的斯亚贝巴地区,即Amanuel和Akaki),旧沥青岁(从亚的斯亚贝巴地区,Amanuel),沥青泄漏区域(从亚的斯亚贝巴地区Woira海基会),和Gallica花农场位于Menagesha(亚的斯亚贝巴)以西22公里的潜在暴露于碳氢化合物污染。Chitu碱湖等网站从亚的斯亚贝巴(180公里,位于埃塞俄比亚南部裂谷)没有已知的潜在风险烃污染物。土壤样本指定为AAUA (Akaki / Amanuel车库)的土壤样本,AAUAs(土壤样本Amanuel旧沥青网站)岁,AAUG (Gallica花农场的土壤样本),AAUW(样本Woira海基会沥青土壤),和AAUC (Chitu碱湖的土壤样本)。

2.2。样本容量和抽样方法

大约10 g的潮湿的土壤样本采集的表层土(5 - 10厘米)的每个选择研究地点(一式三份)使用简单随机空间抽样方法。样本转移到无菌聚乙烯袋,标签,保存在一个冰箱,运送到亚的斯亚贝巴科技大学微生物生物技术实验室并存储在冰箱(EVERmed LR270W, Motteggiana (MN),意大利)在4°C到使用。

2.3。浓缩Diesel-Degrading细菌

hydrocarbon-degrading细菌的隔离是由使用一个富集培养基的改良方法(13,16,19,37,39]。富集培养基或修改基底盐介质(BSM)包含(g / l(蒸馏水):KH2阿宝4(1.36),Na2HPO4(1.39),了解3(1.25),MgSO4(0.06),CaCl2(0.02),(NH)4)2所以4(7.7),在北半球4Cl(1.5),在北半球4没有3(0.85),K2HPO4(0.53),和100毫升的包含0.01克ZnSO矿物质的解决方案4⋅7 h2O, MnCl2⋅4 h2O H3薄4,CoCl2⋅6小时2啊,菲2所以4⋅2 h2O, CuCl2⋅2 h2O, NaMoO4⋅2 h2o .每个站点的一式三份土壤样品是手工均质和已筛筛网使用无菌2毫米。然后,1 g的每个样品称重和混合到9毫升生理盐水(0.99%的氯化钠),从1毫升的上层清液转移到50毫升的富集培养基补充0.5% (v / v)的柴油。在这个实验中使用的柴油从当地获得石油加油站(Jemal图·图鲁Dimtu总石油和天然气站,埃塞俄比亚),这是使用0.45 filter-sterilizedμ米直径的膜过滤3在100毫升容量厄伦美厄烧瓶。烧瓶在智能恒温孵化摇动培养内阁(ZHP-Y2112L系列,扬州Sanfa电子有限公司、江苏、中国)在30°C, 150 rpm为6天(10]。然后,10% (v / v)的丰富文化随后转移到浓缩媒体三次点心。

2.4。隔离和板Diesel-Degrading细菌计数

浓缩后,微生物培养物是准备使用适当的稀释使用无菌生理盐水(0.99%氯化钠;10−1,10−3,10−5,10−7),0.1毫升的悬挂在布什内尔传播哈斯矿物盐(贝克海姆)琼脂培养基含有0.5% (v / v)柴油。中包含MgSO4.7H2CaCl O (0.2 g / L)2(0.02 g / L), KH2阿宝4(1 g / L), K2HPO4(1 g / L),和北半球4没有3(1 g / L)和2滴FeCl的60%3在pH值7.2。两个控件(负面),也就是说,贝克海姆与柴油媒体而不是丰富文化和贝克海姆媒体丰富文化但不是柴油添加剂。板块在30°C到培养6天观察并确定菌落(CFU g−1)。隔离与不同的殖民地被连续镀在营养琼脂培养基纯化(HiMEDIA,班加罗尔,印度)。然后,隔离被指定为AAU(亚的斯亚贝巴大学)与识别网站(A = Akaki Amanuel车库;C = Chitu湖;G = Gallica花农场;岁= Amanuel旧沥青,和W = Woira海基会沥青土壤)和各自的身份证号码和保存在25% v / v甘油−20°C(冷冻柜C0450W电器发热、米兰、意大利)一个月。保留纯文化是亚文化,用作柴油降解菌剂化验。

2.5。细菌形态和生化测试
2.5.1。形态特征

隔离的形态特征进行了研究使用革兰氏染色协议和显微镜检查结果(43]。

2.6。生化试验
2.6.1。过氧化氢酶试验

三滴过氧化氢(3%)被添加到一夜之间成长文化试管和有力的泡沫的形成表明过氧化氢酶活性(5,7]。

2.6.2。酪蛋白水解

隔离种植在一夜之间在营养肉汤和接种到脱脂牛奶琼脂(HiMEDIA)和孵化30°C 48 h (5,7]。周围形成一个清晰的区域隔离在白色的背景下表示的酪蛋白水解活动隔离。

2.6.3。脲酶试验

纯细菌分离株接种到尿素肉汤(Difco, BD,沃金厄姆,英国)和孵化30°C为24 - 48 h (7]。颜色从黄色到粉红色的变化表明,脲酶的生产。

2.6.4。淀粉的测试

隔离种植在一夜之间在营养肉汤和接种到淀粉琼脂培养基(αChemika,孟买,印度)和孵化30°C 48 h (5,7]。盘子被克淹了碘。周边地区的形成一个清晰的分离与深蓝色的背景显示淀粉水解。

2.6.5。Diesel-Degrading细菌的生物降解能力

一夜之间细菌培养(31日)总板数108细胞/毫升(38]每个孤立被接种到100贝克海姆汤含1%和3% (v / v)柴油在250毫升玻璃瓶底物和保存在一个瓶孵化器在150 rpm 30°C (12)5、10和15天。增长(浊度)测量使用UV / Vis分光光度计(Mecasys Optizen流行系列,K实验室,大田,Mecasys有限公司、韩国)在600 nm (OD600年对贝克海姆介质)一式三份空白。

2.6.6。估计重量分析的柴油生物降解效率

隔离达到108细胞/毫升和接种到100毫升的贝克海姆补充了250毫升5%的柴油分发在旋转锥形烧瓶瓶(150 rpm)和孵化30°C 10和15天。柴油的残余浓度是评估使用方法和轻微的修改(17,19,40]。因此,1%盐酸1 n是添加到文化阻止细菌活动,和剩余使用石油醚提取整个内容和丙酮(1:1 v / v比)。然后烧瓶放在瓶在120 rpm 20分钟,油脂溶剂收集和上部的烧瓶,涌入preweighted培养皿(8]。这是重复三次,以确保完整的提取。提取的组件被允许蒸发干热灭菌器在72°C。然后,剩余柴油降解的百分比计算使用以下公式(8,15,20.]:

2.6.7。使用生物测井识别Diesel-Degrading细菌

初步鉴定分离使用Omnilog /生物测井系统根据制造商的规格(生物测井公司,海沃德,美国)Sebeta国家动物健康诊断中心,埃塞俄比亚。96口井的微型板块充满了碳源和其他养分和碳源的利用率和/或抗抑制化学物质是colorimetrically决定使用四唑氧化还原染料。细菌分离株的生长在生物测井普遍增长(BUG)琼脂培养基使用接种液使用的协议“A”(如果有)和一个默认的协议识别绝大多数的细菌种类,然后悬浮在一个特殊的“凝胶”接种液3(如果)细胞密度在90 - 98%。然后细胞悬液接种到的第三代微型板块(100μl /)和孵化33°C 16 h。孵化后,紫色的表型指纹井比较生物测井广泛的物种库(微生物)的数据库使用微型板块读者。

2.7。的遗传特性隔离
2.7.1。基因组DNA提取和使用特定细菌16 s rRNA引物PCR扩增

冻融技术被用来从每个纯菌落提取基因组DNA作为模板来增强细菌特定领域ca.1,500 bp 16 s rRNA基因。为此,殖民地是悬浮在50μl无菌水和细胞溶解,煮5分钟。当时在12000×g离心10分钟,1μl细胞溶解细胞的上清液转移到20µl的PCR反应混合液44]。16.2主混合组成µl PCR-grade水,2µl 10 x PCR缓冲(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA), 0.4µl(10毫米混合核苷酸(技术),0.4µl 20毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA), 0.8µL (MgCl 25毫米2,0.08µl 50µ每个8 M f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),和梦想Taq(技术)。DNA扩增进行使用thermocycler (Verti周期计,应用生物系统公司,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。PCR循环程序如下:最初在96°C变性10分钟,35周期95°C的30年代,退火30年代在56°C, 1分钟72°C伸长,最后7分钟72°C的延伸。聚合酶链式反应试剂成分混合物(50μ包含基因组DNA提取(5 L)μl), 10 x Taq缓冲区,核苷酸混合物(2.5 pmol),每个引物(20 pmol), Taq DNA聚合酶(2.5 U)。最后,16 s rRNA PCR扩增子是纯化使用Illustra Exostar DNA净化设备(通用电气医疗)根据制造商的规格。纯化PCR产品然后使用8 f接受部分测序引物测序工具(单向的测序)的莱布尼兹研究所DSMZ(德国的微生物和细胞培养,德国)。使用细菌的16 s rRNA放大了普遍的寡核苷酸引物1492 r f和使用PCR Verti循环系统(应用生物系统公司)所描述的45]。

2.7.2。核苷酸测序和系统发育分析

部分16 s rRNA基因测序进行使用Illumina公司/ Solexa测序设施,所描述的(46)和原始DNA色谱序列使用序列比对编辑器查看和编辑版本7.0.5.3 [47)和FASTA格式的存储。序列是编译并与NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov使用BLASTn) DNA序列数据库来验证近似系统的位置。

2.8。数据分析

数字数据进行了方差分析(方差分析),后跟一个多重比较测试(邓肯)与SAS统计软件(版本9.1.3;2003,卡里,数控、美国),考虑是有统计上显著的差异 - - - - - -值< 0.0001的diesel-degrading细菌。系统发育树构建在分子进化遗传学分析X(大型X;美国宾夕法尼亚州立大学)的引导价值1000复制使用最大似然法(48和Kimura-2参数模型32]。

3所示。结果

3.1。隔离Diesel-Degrading细菌

19 diesel-degrading细菌分离富集培养的不同采样地点(表1)。数据显示diesel-degrading细菌恢复沥青岁从旧网站,车库网站,和沥青的土壤,将碳氢化合物污染,从Gallica花农场,使用不同的农药含有多环碳氢化合物。此外,diesel-degrading细菌也从Chitu碱湖,极少或没有已知的历史之前直接碳氢化合物污染。

表1
diesel-degrading细菌的形态和生理特征与不同采样地点。
3.2。细菌鉴定和表征
3.2.1之上。描述基于细胞形态学和生化隔离的测试

在这项研究中,19细菌隔离用革兰氏染色法和生化特征测试(表1)。基于克的反应,大多数(85%)革兰氏阴性细菌和杆状,而15%是革兰氏阳性棒。隔离也基于标准的生化特征测试,和所有隔离是过氧化氢酶阳性,除了AAUG10 (急慢性Roseomonas)。此外,大多数柴油降能器(68%)酪蛋白水解的能力,排除Providencia rettgeri,无色菌xylosoxidans,Stenotrophomonas maltophila。数据还显示,42%的隔离是urease-positive和三个革兰氏阳性芽孢杆菌种虫害能水解淀粉。

3.2.2。使用生物测井识别Diesel-Degrading物种

第三代微型板块上测试面板提供了一个标准化的micromethod概要和识别广泛的基于65.5 - 99.9%革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌属内物种(表的识别精度1)。因此,确定细菌属假单胞菌spp。Roseomonas仕达屋优先计划芽孢杆菌。仕达屋优先计划,Providenciaspp。无色菌spp。,Stenotrophomonasspp。

3.2.3。Diesel-Degrading细菌的多样性

在孤立的物种,铜绿假单胞菌和Stenotrophomonas maltophilia分别占42%和16%(表2)。除此之外,蜡样芽胞杆菌和Providencia rettigeri每个占第三组分布(11%)。隔离是恢复从不同的网站,主要是碳氢化合物污染的组件或没有直接碳氢化合物的污染成分的历史。

表2
多样性和群落结构的隔离hydrocarbon-contaminated网站和nonpolluted自然网站(Chitu碱湖)。
3.3。筛选有效的隔离柴油降解
3.3.1。柴油降解(1%)

细菌利用柴油机的经济增长、能源和生物量的增加(1]。增长或增加生物质是浊度表示的生长培养基(贝克海姆)。在这项研究中,19个细菌的增长模式(有效降解)隔离枚举在贝克海姆与1%的柴油中补充。在10隔离显示显著增长th天的孵化从OD的0.41±0.002,1.3±0.004,表明显著差异( < 0.0001)的能力降低柴油。在隔离,b的仙人掌(AAUA13)显示一个OD值为1.3±0.004,紧随其后答:xylosoxidans(AAUAs16) OD值为1.28±0.002。其降解潜力10达到了顶峰th天增长的孵化,3倍高于5th天的孵化(图1)。同样的,铜绿假单胞菌(AAUW24),枯草芽孢杆菌(AAUG36),p . rettgeri(AAUAs17),铜绿假单胞菌(AAUC19 AAUG11 AAUW25),美国maltophilia(AAUA14和AAUA15)显示其经济增长无显著差异。在这项研究中,调查了,只有一个隔离,p . rettgeri(AAUG8),显示经济增长以增加条款的OD 10th天的孵化15 (0.41±0.002)th天的孵化(0.62±0.002)。


图1
增长能力的分离柴油(1%浓度在不同生长时期)。
3.3.2。柴油降解(3%)

细菌分离株的增长模式在烃降解柴油中(3%)也研究(图2)。最大的增长记录在10th天的孵化。隔离AAUW23 (铜绿假单胞菌)表现出显著增长能力的OD值2.14±0.016 ( < 0.0001)相比其他隔离。早前的一项研究也表明,铜绿假单胞菌是有效的降解高浓度的烃污染物(12]。此外,剩下的隔离标识为铜绿假单胞菌(AAUC21 AAUG11 AAUW22),p . viridilivida(AAUC18),美国maltophilia(AAUA14)也显示适度的柴油降解活动与OD值从1.43±0.003,1.71±0.022。在之前的研究中,美国maltophilia被确定为一个关键hydrocarbon-degrading细菌(2]。一些隔离还显示活动增加潜伏期10天以上,持续与OD值的显著差异。因此,美国maltophilia(AAUC20),Providencia rettgeri(AAUG8),答:xylosoxidans(AAUAs16),铜绿假单胞菌(AAUW22)确定为潜在的柴油下降的OD值为0.92±0.075;1.42±0.047;分别为1.6±0.022,1.78±0.038。因此,铜绿假单胞菌明显显示有效的柴油降解能力。这可能是因为铜绿假单胞菌有独特的适应性可能在一系列多样化的条件,包括生存环境,港口等大量的碳氢化合物浓度来源柴油(19]。


图2
增长能力的分离柴油(3%浓度在不同生长时期)。
3.4。重量分析柴油生物降解效果

七个细菌隔离被发现生长和显示有效的降解能力包含3%的柴油浓度在媒体贝克海姆。这些选择潜在隔离然后提供5%的柴油作为生长基质和重量分析法进行了10th和15th天的孵化(图3)。结果表明,两个隔离的假单胞菌spp。(AAUW23和AAUG11)枯草芽孢杆菌(AAUG36)显示,83.6%、84%和83%的柴油降解功效,分别在15th天的孵化。剩下的隔离p . viridilivida(AAUC18),p . rettigeri(AAUG8),美国maltophila柴油(AAUA14)降解效率较低(分别为58%、48%和31.6%)同一天孵化。之前的研究(17)还表明,柴油的最大退化观察15天后孵化柴油浓度53%增长0.5%。因此,在这项研究中,柴油是降解高浓度(5%)和短的曝光时间。


图3
重量分析柴油降解。
3.5。16 s rRNA序列和系统发育分析选定的隔离

三个最有效的细菌隔离(指定为AAUW23 AAUG36, AAUG11)显示最大diesel-degrading能力被选在重量分析方法,及其16 s rRNA测序。部分16 s rRNA序列的三个细菌隔离报NCBI,和他们的加入人数获得作为AAUW23 MT669825, MT669830 AAUG36, MT669831 AAUG11。16 s rRNA测序和系统数据分析这三个隔离使用爆炸搜索证实分离密切相关的一些16 s rRNA基因库中的培养细菌分类单元序列数据库。因此,两个隔离,AAUW23 AAUG11,属于伽马的细分变形菌门,而AAUG36属于厚壁菌门(表3)。

表3
16 s rRNA部分序列的系统发育关系的三个细菌隔离。

系统发育树构建在大型X使用最大似然方法,它描述细菌隔离AAUW23和AAUG11可能集群铜绿假单胞菌,而隔离AAUG36可以联系芽孢杆菌spp。(图4)。


图4
种系发生树基于局部细菌序列16 s rRNA地区的两个假单胞菌分离株和一个枯草芽孢杆菌(大胆和编码,其上有首字母缩写“AAU”)和加入数字16 s rRNA的物种名称紧随其后。数字在每个节点的节点表示引导值1000引导程序类似。系统发育树构建大型X采用最大似然法(48和Kimura-2参数模型32]。的大肠杆菌部分序列作为外群体。

构建系统发育树描述AAUG11 (MT669831)和AAUW23 (MT669825)共享98%核苷酸身份和≥99%的相似性与其他现有细菌16 s rRNA序列从数据库检索。隔离AAUG36 (MT669831)隔绝Gallica花农场土壤样本隶属于铜绿假单胞菌应变SKN3 (MK216848.1)和应变COdelsu (MK875780.1)的相似度99%先前孤立从植物叶围和原油样品,分别。其他隔离AAUW23 (MT669825)从沥青获得土壤样本也密切相关假单胞菌种虫害应变SKN3 (MK216848.1)和应变HBUM206341从环境样品(MT551217.1)先前描述。此外,隔离AAUG36 (MT669830)隔绝Gallica花农场与应变和形成一个共同的血统芽孢杆菌tequilensis流量控制阀B6 (MT704510.1)相似度为99.34%(78%)的引导价值之前隔绝disinfectant-contaminated生物膜样品。在这项研究中,因此,假单胞菌和芽孢杆菌是主流diesel-degrading细菌属hydrocarbon-contaminated沥青等领域中发现土壤和花卉农场。目前的研究显示,细菌存在于各种hydrocarbon-contaminated土壤/沉积物可以迅速降低柴油。

4所示。讨论

微生物在生物降解起着至关重要的作用(生物修复)烃污染物的污染环境(49]。在这项研究中,细菌隔离从土壤样品中恢复过来的已知或未知hydrocarbon-contaminated环境使用贝克海姆中补充0.5%的柴油作为碳源,以丰富其增长模式并确定其降解潜力。的人口密度枚举所有采样站点内的推荐数量的104到107为成功的碳氢化合物的生物降解(CFU每克土壤11]。然而,细菌分离株的数量有差异的抽样地点。事实上,不同数量的殖民地从这些网站可能会获得与细菌的多样性能够降解烃类及其衍生物(19]。此外,更多的diesel-degrading细菌可以恢复从车库样本网站和其他各种石油复合污染的网站(3- - - - - -5,12,20.,31日]。这可能与细菌生存的潜力等不同类型的烃组成部分的脂肪族(柴油)和芳香族碳氢化合物(单环或多环)3]。然而,土著微生物能降解这些污染物自然衰减非常低(11,16]。此外,目前的工作表明,hydrocarbon-degrading细菌也隔绝nonhydrocarbon-contaminated网站,如碱湖(正式)。协议,研究还显示,几株hydrocarbon-degrading细菌也被隔绝的环境没有任何已知的碳氢化合物污染(34,50]。这可能是由于碳氢化合物的存在于自然和人类学的起源或由某些微生物的降解和合成过程(51,52)等自然环境将包含高度减少形式的支持很重要的烃微生物群落的碳和能量来源(一样好14,29日,36,51]。

大多数的孤立diesel-degrading革兰氏阴性细菌,主要是5个属,即假单胞菌仕达屋优先计划。,Stenotrophomonas仕达屋优先计划。,Providencia仕达屋优先计划。,Roseomonas仕达屋优先计划。,和无色菌spp,发现47岁,16日,11日,5日和隔离总数的5%。其他研究也显示,革兰氏阴性属的物种假单胞菌spp。(38.94%)和无色菌spp。(7.96%)被认为是柴油降能器(20.]。此外,在确定的总隔离柴油降能器在这项研究中,16%被发现是革兰氏阳性分离株,这属于属的物种芽孢杆菌。diesel-degrading细菌物种也使用一些标准的生化特征测试基于他们的催化活动。一些隔离显示为过氧化氢降解的积极成果,酪蛋白,淀粉、尿素,但其他人没有。这可能是一个初步迹象表明,隔离有不同的酶催化降解各种和/或特定的底物。他们还发现了使用生物测井数据隔离的多数是由假单胞菌种虫害精度为84.9到98.1%。下一个主导diesel-degrading物种美国maltophilia(78.7 - -97.5%),其次是芽孢杆菌spp。(65.5 - -87.5%),p . rettigeri(85.6 - -99.9%),急慢性r .(70%)和答:xylosoxidans(95.7%)。铜绿假单胞菌,b的仙人掌,美国maltophilia,答:xylosoxidans,p . rettgeri从车库,恢复旧的老化沥青,沥青土壤环境污染的碳氢化合物通过人类学活动组件。其他相关研究也证实了这一点铜绿假单胞菌,美国maltophilia,b .仙人掌/微小也从各种各样的分离脂肪族和芳香族hydrocarbon-contaminated土壤(12,19]。此外,p . rettgeri,铜绿假单胞菌,急慢性r .从花卉农场被孤立,而铜绿假单胞菌,p . viridilivida,和美国maltophilia也从Chitu碱湖网站中恢复过来,没有直接接触烃组件。从当前和其他先前的研究,可能是意识到铜绿假单胞菌可能是来自不同的土壤环境中,主要是由于其普遍性的多样化的柴油降解代谢能力。

隔离的增长能力被发现在不同的柴油浓度(1、3和5%)。柴油浓度1%,两个细菌隔离,b的仙人掌(AAUA13)和铜绿假单胞菌(AAUAs16),显示显著增长模式在第十天的孵化。这表明芽孢杆菌种虫害和假单胞菌仕达屋优先计划。显示的柴油降解潜力(19,42]。此外,p . rettgeri和美国maltophilia被确定为潜在的柴油降能器(1,24]。值得注意的是,目前的研究表明,属的物种假单胞菌,无色菌,Providencia,Stenotrophomonas被确定为潜在候选人柴油降解/利用率相比其他隔离时间文化的时间(15天)和较高的底物浓度(3%的柴油)。此外,研究还表明,隔离执行活动3%的降解柴油浓度比1%的浓度在同一天孵化。这是增加OD的原因与柴油浓度生长介质表明hydrocarbon-degrading细菌数量的增加,因为他们将其作为碳和能源(14]。铜绿假单胞菌(AAUW23和AAUG11)都具有降解能力的最有效的柴油。许多研究也证实了这一点假单胞菌sp。显示了高超的柴油降解功效[1,12,14,15,19- - - - - -21,40]。这是因为它是一个亲油的微生物(16)和代谢多样性,或者它可能是共生相关土壤中(8),或者产生一种生物表面活性剂,它有效地使柴油更可利用率(4,9,18,40]。此外,其他研究也表明,这种细菌物种具有酶系统降解和利用柴油作为碳源和能源14,19]。此外,枯草芽孢杆菌(AAUG36)也被确定为一个强有力的细菌物种退化的柴油。这项研究还显示,这一物种在不同的环境中可以发现由于其生产能力内孢子通过严酷的环境下(13,22和表面活性的物质(生物表面活性剂)减少表面和intersurface紧张和增加污染物高效降解的生物利用度(22]。这增加生物特征是重要的生物利用度差访问柴油和提高生物降解率。因此,这项研究表明铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌显示最大降解更高浓度的柴油(5%)和不使用任何人工合成的表面活性剂。

16 s rRNA基因序列比对使用BLASTn搜索在NCBI以及三种潜在的生物测井识别系统diesel-degrading细菌隔离(AAUW23、AAUG36 AAUG11)透露,隔离被发现展览99%以上身份数据库中的现有培养细菌。16 s RNA基因部分序列(表3)确定了两种不同的细菌属,即假单胞菌种虫害和芽孢杆菌spp,隔离,AAUW23 AAUG11,是公认的铜绿假单胞菌和隔离AAUG36枯草芽孢杆菌。有趣的是,这些分离株的序列的相似序列与其他几个已知hydrocarbon-degrading生物,以及由此产生的种系发生树表示,这些隔离被分组到门变形菌门(AAUW23和AAUG11)厚壁菌门(AAUG36), Gammaproteobacteria最类(图表示4)。从早期的研究报告也描述门变形菌门在大多数情况下,特征与脂肪族和芳香族hydrocarbon-degrading生物密切相关(12,20.]。

5。结论

生物修复是当前方法之一,环境生物技术在环境微生物学或运动减少和/或烃类污染物的去除。微生物,细菌通常有特定的代谢能力,碳氢化合物的生物降解污染物至关重要。目前的研究提供了一个科学调查diesel-degrading细菌获得不同的土壤环境中基于文化相关的技术。发现潜在的细菌可能降低柴油容易会隔绝hydrocarbon-contaminated土壤样本或其他自然环境没有直接与烃残差污染。这可能是一个基础指标可能搜索潜在的细菌隔离hydrocarbon-contaminated环境的生物修复。16 s rRNA基因测序和系统发育树结构推断潜在的细菌隔离AAUW23 (MT669825)和AAUG11 (MT669831),属的密切相关的物种假单胞菌和AAUG36 (MT669830)隶属于芽孢杆菌主要能够生存和发展,1,3,5% (v / v)柴油。隔离也表现出最大的柴油降解效率使用重量分析方法。因此,这项研究证明了细菌物种存在于不同的栖息地被认为是潜在的生物制剂的高效生物降解柴油。本研究还对现有知识的补充导致这项研究对进一步改善环境污染最小化碳氢化合物污染的部件,如柴油。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以在请求从相应的作者。然而,部分16 s rRNA序列的细菌隔离已存入国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)加入数字MT669825 MT669830, MT669831。

信息披露

投资者没有参与决定发布结果。早期版本的手稿已经上传到预印本服务器。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢学院,为项目的成功提供了资助。作者要感谢Tafesse可兰经先生和太太Mekides Gebeyehu提供技术支持在获得生物测井工具Sebeta国家动物健康诊断与鉴定中心(SNAHDIC),埃塞俄比亚。作者也感谢支持莱布尼茨Institute-DSMZ-German测序所提供的设施。这项工作得到了亚的斯亚贝巴科技大学作为其内部研究资助计划的一部分的论文。