文摘

尽管兴趣西藏土壤作为一个有前途的功能酶的来源与潜在的生物技术应用,很少有研究考虑淀粉酶产生菌的筛选和鉴定西藏土壤。淀粉酶有很多应用在食品和饲料行业,纺织品和生物燃料的生产和生物医学工程。淀粉酶与特定属性的区域正吸引着越来越多的关注,因为它更好的应用于各种工业条件。本研究旨在筛选和识别amylase-producing菌株从土壤样品收集在林芝,西藏,然后探索细菌隔离是否优越独特的酶。本文总共有127淀粉酶产生菌分离的基于活动的筛选六西藏土壤样本。16 s rRNA基因调查确定了四个主要类群,即厚壁菌门,拟杆菌,变形菌门,放线菌,分化成十二属的主导地位芽孢杆菌(67.72%),紧随其后的是假单胞菌(8.66%)。微生物多样性分析显示,Kadinggou amylase-producing细菌社区的森林土壤样本显示最好的品种(0.69辛普森指数和香农指数是0.85)。细菌分离株的淀粉酶活力测定显示平均的0.66 U /毫升28°C和pH值5.2。基于温度和小灵通对淀粉酶活性的影响,一些细菌分离株能产生高温(50°C),好寒性的(10°C),嗜酸性(pH值4.2),alkaliphilic (pH值10.2)淀粉酶。此外,四个细菌的分离筛选淀粉酶、蛋白酶、酯酶的活动,显示多功能酶的能力。本研究将有助于我们对西藏的了解微生物资源及其科学研究和工业应用潜力。

1。介绍

作为陆地生态系统的最活跃的成员,如土壤微生物参与多种生化过程分解有机质、养分的变换,土壤腐殖质的形成环境和发挥重要作用的规定物质循环和生态的维护稳定。有各种各样的微生物在土壤中,这被认为是一个重要的资源获取许多微生物酶。淀粉酶、1,4 -α-D-glucanohydrolase,能催化水解淀粉,糖原,以及相关多糖转化为葡萄糖,麦芽糖,和其他低聚糖。由于其中一个最重要的淀粉水解酶在工业生产、淀粉酶是商业应用1894年医疗辅助治疗消化疾病。目前,淀粉酶已成为使用最广泛和最重要的酶制剂产量,占世界上30%的酶市场(1,2]。淀粉酶广泛应用在食品和饲料行业,纺织和生物燃料生产,纸和纸浆技术,生物制药工程等。2- - - - - -4]。微生物发酵到目前为止已经大规模的淀粉酶生产的主要方法。先前的研究已经报道,amylase-producing主要属于属的细菌芽孢杆菌对于工业应用,如枯草芽孢杆菌,地衣芽。,b . amyloliquefaciens b . coagulans和b . stearothermophilus(3- - - - - -5]。此外,商用真菌淀粉酶是由属曲霉属真菌(答:oryzae和答:尼日尔),青霉菌物种也是一个高效amylase-producing真菌(5,6]。

应该注意的是,随着淀粉加工业的发展和淀粉酶的扩展应用,淀粉酶资源的调查与优越的特性被认为是当前的酶制剂行业的一个热点问题。例如,高温淀粉酶是热稳定的温度范围内70 - 90°C,可重要的工业利益在淀粉处理的节能和经济效益7,8]。最耐热性的α-amylases用于工业生产地衣芽。,BLA [9- - - - - -11]。此外,hyperthermophilic细胞外α淀粉酶的海床furiosus(PFA)有其最优活动在100°C,这是明显比商用BLA(耐热性的12]。此外,枯草芽孢杆菌和b . amyloliquefaciens负责生产介质温度(30 - 40°C)淀粉酶(3,8)应用于消除的复杂步骤去除淀粉过程中钙离子的10]。同时,低温淀粉酶通常指的是一个特定的酶活性在低温下,以著名的好寒性的Alteromonas haloplanctisα淀粉酶(啊哈)显示其具体活动的温度范围内0-20°C (13,14]。cold-active财产授予好寒性的淀粉酶的巨大经济价值和广阔的应用前景,随着嗜中温淀粉酶低温下他们的活动大大减少。

除了上述温度特性(嗜热、嗜常温和低温性),其他功能特征的淀粉酶适应某一特定环境也应该是重要的为各种工业应用。例如,一个耐酸作用淀粉酶芽孢杆菌sp kr - 8104。15),维护其特定的活动在低pH值(pH值4.0 - -6.0),更有利于液化和糖化过程由于漏报pH值调整步骤和副产物形成的限制(11]。此外,嗜盐的(16),有机溶剂宽容(17],洗涤剂兼容[18),和金属离子独立微生物淀粉酶(19)也可以满足目前工业应用的要求。关于产品产量、降低总成本,淀粉酶与多个属性可以吸引更多的注意在工业淀粉加工,如耐热性的和酸稳定淀粉酶地衣芽。b4 - 423 (11),高温和钙独立淀粉酶芽孢杆菌sp TM1。19),嗜盐的碱和热稳定的淀粉酶Amphibacillussp。NM-Ra2 [20.),和嗜中温嗜酸性淀粉酶乳杆菌无性系种群。杆菌的ST-III [21]。集体,淀粉酶轴承优越特性能承受恶劣环境的工业加工不变性,使得他们被用作高效生物催化剂在不同的反应条件。

即使世界淀粉酶产业发展值得注意的是,为我们的国家是很困难的,中国,它的位置在国际市场上由于更少的品种和工业化淀粉酶的产量。因此,我们迫切需要大力发展国内产业。一方面,探索新的amylase-producing微生物资源仍是一个至关重要的目标。另一方面,进一步筛选淀粉酶为特定的适应性特征(例如,嗜热、嗜冷、嗜酸性和alkaliphilic淀粉酶)在一个独特的自然环境应该主要关注(22,23]。迄今为止,微生物具有独特性能的淀粉酶与水样(深海、温泉、湖泊)已经被很好的记录(11,20.,24- - - - - -26]。相比之下,soil-derived amylase-producing细菌酶优越特色得到了相对较少的关注。

林芝的城市,位于西藏东南部,是一个至关重要的森林资源面积和著名的粮食产品。根据数据来自中国天气(http://www.weather.com.cn),这座城市的特点是全年平均气温为8.7°C,年日照时间2000小时,年降水量650毫米,平均海拔3100米。最近的一项研究报道,年平均降雨量和年平均温度显著影响土壤微生物群落的结构(27]。此外,不同气候类型(热带、亚热带、温带、寒冷、潮湿,和半湿润气候的区域)授予林芝更多种类的土壤微生物生态系统与其他城市相比。总的来说,我们认为,西藏土壤,可能居住着专门的微生物或极端微生物,是一个令人兴奋的来源寻找独特的微生物淀粉酶。江et al。28)2007年报告细菌分离(地衣芽孢杆菌LT)耐热性的α从西藏温泉淀粉酶。关丽珍et al。29日]在2015年初步研究amylase-producing细菌分离株的分布在青藏高原土壤样本收集。

在目前的研究中,我们的主要目标是(我)屏幕淀粉酶产生菌从土壤样品收集在林芝的城市,西藏,使用一个基于活动的方法;(2)说明微生物的分类、组成和多样性在不同土壤样品使用16 s rRNA基因序列的调查方法和各种多样性指数的计算;(3)获得独特的细菌隔离生产优越淀粉酶通过对酶的最佳温度和pH值的研究活动;(iv)和探索多功能酶细菌分离株的能力。我们的研究希望实现从简单的发现转变为高价值利用西藏微生物淀粉酶资源。

2。材料和方法

2.1。学习网站和样本收集

收集土壤样本在这项研究从四个网站在林芝城市,西藏(即。Runa村,Guomo村,主要县,波密县Basongcuo, Kadinggou)。样品被分成两种类型:作物土壤和森林土。作物土壤分为荞麦、青稞、玉米。在一起,六个土壤样本名叫GM-b GM-hb, RB-c, RB-hb BSC-f, KDG-f。抽样的地理位置如图所示1。在所有样品中描述表的详细信息1。


图1
采样地点的地图。
表1
6个土壤样本的信息。

2厘米的表层土壤样品的过程中被收集。男童厘米从地面的混合样本收集到无菌容器,然后送到实验室,在那里暂时储存在4°C为后续实验。

2.2。培养基和化学品

大豆胰蛋白酶的大豆琼脂培养基(TSA)和胰蛋白酶的肉汤(TSB)从希望购买生物科技(青岛)。和方向的公式可以发现试剂瓶。甘油基tributyrate 3 5-dinitrosalicylic酸(DNS)试剂和醋酸钠缓冲来自Solarbio(中国,北京)。可溶性淀粉、葡萄糖、碘、碘化钾、脱脂奶粉,和其他化学物质都是由Sangon生物技术(上海,中国),年级的BC。

2.3。隔离和Amylase-Producing菌株的筛选

2 g的土壤样本添加到22.5毫升无菌水在一个锥形烧瓶。混合样本大力漩涡。持有沉积15 - 20分钟后,1毫升的悬架被添加到9毫升无菌蒸馏水,和一个串行稀释(10−1到10−3)准备。约100µ每个稀释了的l和分布式amylase-screening TSA板(30.含有0.2% (w / v)的可溶性淀粉。板块在28°C为16个小时,直到孵化典型的细菌菌落观察。淀粉水解被熏蒸检查板块与碘1分钟(31日),和积极的细菌菌落与淀粉酶活动选择通过可见的水解圈在一个深蓝色的背景下。殖民地显示一个明确的形态的差异进一步纯化亚文化在amylase-screening TSA盘子直到均匀单克隆细胞形态学观察和大小(32]。纯隔离被转移到TSB和孵化28°C在220 rpm 16小时。

2.4。识别和分类Amylase-Producing菌株

16 s rDNA分析识别物种和细菌分离株的分类法进行分类。16 s rDNA细菌放大使用通用引物27-F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 - r (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) (11]。pcr是运行在一个50的体积µl使用Phanta®马克斯大师混合(Vazyme,南京,中国),可用于直接PCR扩增的细菌样本没有提取基因组DNA。PCR系统包含(µl): 2×Phanta马克斯大师混合25.0,1.0细菌悬液作为模板,27-F (10µ2.0米),1492 - r (10µ2.0米),ddH220.0 O。PCR程序由初始变性在95°C 3分钟,紧随其后的是30个周期在95°C的变性15秒,退火55°C 15秒,伸长72°C, 90秒,最后一个扩展的时间5分钟在72°C。后1.5 kb目标片段PCR扩增子的验证以1%琼脂糖凝胶电泳(擤鼻涕、西班牙),PCR产物测序从桑格测序技术在Tsingke生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。随后,细菌16 s rDNA序列被提交到两个在线公共数据库,NCBI资源库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify),确定最近的前所述细菌和定位砸分类(33]。的识别结果比较和验证两个数据库,以确定细菌分离株的分类。

2.5。计算细菌群落多样性指数

微生物多样性是生态指数的计算比较,评估包括Berger-Parker指数(Dbp)的主导地位,马格列夫指数(d马)的丰富性,辛普森指数(D)非均匀概率,Shannon-Wiener指数(H′)的多样性,Pielou指数(Je)的均匀度。这些参数计算根据方程(1)- (5)[34- - - - - -48]:

n马克斯的数量是最出现的物种,N是所有物种的个体数量的总和,年代物种的数量,P我是属于个人的比例我th物种,n我的数量吗我物种。

Dbp是最丰富的优势物种,这表明样本与更高的物种多样性对应于一个低吗Dbp价值。而D是属于两个随机个体的概率(即不同的物种。样品不均匀概率),更高的物种多样性对应于一个更高D价值。作为量化熵指数(不确定性)和多样性特征,H′正比于丰富的马格列夫指数和Pielou均匀度指数。有两个关键组件社区的多样性:d马强调物种丰富度与直观的生态意义,Je反映了一个社区的所有个体的分布与敏感性物种丰富度(41,42]。

2.6。淀粉酶活性测定

amylase-producing细菌隔离在TSB孵化中16小时。培养基是离心20分钟,每分钟12000转,上层清液收集作为后续粗酶解酶活性测定。淀粉酶活性测定采用Bernfeld法(39),使用3、5-dinitrosalicylic酸(DNS)测量与淀粉分解释放的还原糖。0.8毫升的反应混合物由20毫米醋酸钠缓冲(pH值5.2;0.36毫升);1.0% (w / v)可溶性淀粉溶解在缓冲(0.4毫升);和粗酶解决方案(0.04毫升)。孵化后28°C 15分钟,DNS试剂开发颜色煮10分钟,然后冷却到室温。的释放还原糖测定spectrophotometrically在540纳米32,40]。一个单位的淀粉酶测定被定义为的酶量1.0中解放出来µ摩尔还原糖的每分钟1.0毫升的粗酶在特定试验条件下的解决方案。方程(6淀粉酶活性的计算如下:

一个是还原糖的浓度(毫克/毫升),V1是反应总额(毫升),t是反应时间(分钟),V2是粗酶体积(mL)。

2.7。在Amylase-Producing菌株酶性质的研究
2.7.1。温度和小灵通对淀粉酶活性的影响

粗酶源进一步特征的淀粉酶活性在不同温度下(4、10、28、50和65°C)和pH值(pH值3.2,4.2,5.2,9.2,和10.2)来确定最佳反应条件。

2.7.2。筛选细菌分离株的多功能酶的能力

2µl的细菌培养基加入protease-screening TSA盘子补充与脱脂奶粉(1.0%,w / v) [41)和esterase-screening TSA板块含有1.0% (w / v)丙三tributyrate [42]。水解直接检查清楚周围的区域增长幅度。

3所示。统计分析

淀粉酶活性测定确定了三个独立的复制,和数据的意思是三个平行实验。执行统计分析平均值之间的显著差异在95%的水平(与单向方差分析 值< 0.05)使用软件GraphPad棱镜(版本9)。

4所示。结果和讨论

4.1。从土壤西藏Amylase-Producing细菌的筛选

基于活动的筛查方法,我们获得了127株与淀粉酶活性在1184细菌菌落从六个土壤样本,占10.73%。统计结果表明,样本KDG-f拥有隔离amylase-producing菌株的比例最高,达到17.50%,其次是GM-b (15.52%)。详细的检查表中描述的6个样品的结果2。作物的土壤类型,荞麦隔离比率(GM-b: 15.52%)比玉米和青稞(GM-hb RB-c: 9.68%: 8.22%, RB-hb: 7.51%)。因此,我们提高淀粉酶的细菌分离假设可能与作物土壤类型有关,需要进一步调查。

表2
隔离和筛选amylase-producing细菌从六个西藏土壤样本。

我们得到两种淀粉酶产生细菌菌落在纯细菌分离株的获得:一个更大的殖民地水解的较小的区域(图2(一个))和一个小殖民地与水解的一个更大的区域(图2 (b))。然后,我们初步推测,后者有更好的能力产生淀粉酶水解圈的直径比基于菌落。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
两种类型的amylase-producing细菌菌落。(a)一个更大的殖民地与水解的较小的区域,和(b)一个小殖民地水解的一个更大的区域。
4.2。识别和分类的淀粉酶产生菌

随后,amylase-producing细菌隔离是识别和分类。从公开的系统发育分析16 s rRNA基因序列,127株属于四门(图3(一)),厚壁菌门(72.44%)、拟杆菌(13.39%)、变形菌门(12.60%),和放线菌(1.57%)。我们可以看到在图3 (b)细菌属的分类显示,占主导地位芽孢杆菌sp。(共86株,占67.72%),其次是假单胞菌sp。(11株,8.66%),Chryseobacteriumsp。(10株,7.87%),黄杆菌属sp(7株,占5.51%),Exiguobacteriumsp。(3株,2.36%),Paenibacillussp。(2株,1.57%),Raoultellasp。(2株,1.57%),小细菌属sp。(2株,1.57%),肠球菌sp。(1株,0.79%),农杆菌属sp。(1株,0.79%),克雷伯氏菌sp。(1株,0.79%)和Rahnellasp。(1株,占0.79%)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
127的分类学分类amylase-producing细菌细菌门级(a)和(b)细菌属水平。

16 s rRNA基因调查被用来洞察与微生物相关的物种多样性淀粉酶。我们的结果与之前的研究结果相一致3,5,43)中,芽孢杆菌是最常见的细菌属孤立淀粉酶分泌。在我们的调查,芽孢杆菌隔离被分化成九个细菌物种,其中b的仙人掌,b . megaterium,b . mycoides,b基因,b . aryabhattai,b . wiedmannii已经有据可查的淀粉酶生产(44- - - - - -47]。然而,b . toyonensis,炭疽杆菌,b . frigoritolerans仍然很少报道。此外,我们发现产生淀粉酶的能力也出现在其他细菌物种,如克雷伯氏菌aerogenes, Exiguobacterium acetylicum, Paenibacillus xylanexedens,和粪肠球菌,这是由以前的研究(48- - - - - -50]。然而,三种细菌物种我们孤立的淀粉酶活性,即假单胞菌kribbensis,P。glycinae,小细菌属phyllosphaerae从来没有报道,或发表在NCBI的编码对应的淀粉酶基因资源库。因此,还需要进一步的研究来确定上述细菌物种是否小说来源微生物淀粉酶。

根据爆炸搜索对已知同源16 s rDNA序列,17个冗余株可以忽略由于相同的身份其他现有隔离在我们的研究中,给出了表3。例如,细菌分离株1 d2和1 d21序列相似性为100.00%符合最近的具有代表性的细菌,芽孢杆菌mycoidesBF1-5。而隔离2 a6、2 g4和2 d5显示相同的序列相似度(99.93%)荧光假单胞菌Pf0-1。基于16 s rDNA序列相似性,总共110隔离被认定为非齐次个人在菌株水平。他们被选为测试菌株对我们后续的淀粉酶活性测定。

表3
爆炸的结果基于16 s rDNA冗余株序列相似性。
4.3。细菌组成和多样性分析

需要更多的研究来确定amylase-producing细菌隔离是分布在不同的西藏土壤样本。首先,相对丰度的分类栏图显示的细菌组成和分布(图6个土壤样品4)。我们可以发现,芽孢杆菌丰度最高的,应该是占主导地位的细菌属6个样品。具体来说,相对丰富的芽孢杆菌6份样品中为了是RB-hb (93.75%)、RB-c (83.33%)、GM-b (74.07%)、BSC-f (66.67%)、GM-hb(50.00%),和KDG-f (42.86%)。此外,样本KDG-f最多细菌属(7属),其次是BSC-f(8属),RB-c(4属),GM-b(3属),GM-hb(3属)和RB-hb(2属)。图4显示6个样品的细菌成分的细节。


图4
分类栏块六西藏土壤样本的相对细菌丰度在细菌属级别。

其次,不同样品的细菌多样性进一步评估各种多样性指数的计算,如表所示4。最高的样本RB-hb,优势度指数(Dbp丰富度指数(= 0.94),最低的d马= 0.36)和均匀度指数最低的(Je= 0.09),最严重的细菌多样性的特点。细菌群落组成的两个属,压倒性的优势芽孢杆菌(93.75%)Exiguobacterium(6.25%)。此外,最低的辛普森指数(D= 0.12)和Shannon-Wiener指数(H”= 0.06)进一步揭示RB-hb细菌多样性最低。然而,样本KDG-f优势度指数最低的(Dbp= 0.43)展示了最好的细菌多样性,这也可以证明马格列夫最高指数(d马= 1.97),辛普森指数(D= 0.69),Shannon-Wiener指数(H”= 0.85)。细菌社区由7个属,即芽孢杆菌(42.86%),黄杆菌属(33.33%),Chryseobacterium(4.76%),Paenibacillus(4.76%),小细菌属(4.76%),肠球菌(4.76%)和农杆菌属(4.76%)。关于样品GM-hb Pielou指数最高的Je= 0.63),最统一的细菌组成。细菌分离物均匀分布,为50.00%芽孢杆菌,33.33%的Chryseobacterium,和16.67%假单胞菌。因此,可以得出结论,6个土壤样本序列的细菌多样性从最高到最低是KDG-f GM-hb, BSC-f, GM-b RB-c, RB-hb(图4、表4)。

表4
细菌多样性指数6个土壤样品。

这些结果显示显著差异在6个土壤样本中细菌的组成和多样性,这说明一个可能的土壤特性和细菌多样性之间的关系。刘等人(2020年51]发现微生物群落的组成部分的变化解释了土壤的理化性质,其中pH值,土壤总磷、总氮和有机碳标识为主导因素。在未来的研究中,土壤理化性质分析确认与细菌多样性。此外,最近的研究阐明土壤理化属性是由各种因素,如高度和耕作实践,从而导致细菌组成和多样性的变化。Kumar等人(2019年52)报道,甘戈里土壤(高度:3415米)比Kandakhal土壤细菌多样性的丰富(1532米),通过大量的不同的细菌类群和Shannon-Wiener多样性指数就越高。这一发现似乎部分解释我们的结果,最高海拔样本,BSC-f(3480米),有细菌多样性高于最低海拔土壤样本,RB-hb(2750米),就是明证Shannon-Wiener指数0.41和0.06,分别。

更重要的是,我们发现森林土壤样品没有作物覆盖物(KDG-f和BSC-f)显示更高的细菌多样性相比,作物土壤样品(GM-b、RB-c和RB-hb)。结果是部分归结于这一事实种植实践(耕作治疗)的土壤细菌群落的组成,是由以前的研究支持。刘等人(2020年53)发现,免耕处理显著增加了土壤细菌种类的丰富性和均匀性比传统谷物和豆类种植实践。此外,杨等人(2020年54]表明,不同封面的单一作物(小米、荞麦和bean)影响土壤细菌群落的组成和分布,但没有显著差异在细菌的丰富性和多样性。他们的发现可能部分与我们的结果在作物土壤细菌多样性显著差异的样本。因此,它是很有价值的提供相关性的,深层次的洞察和土壤细菌多样性种植实践。

4.4。从细菌分离测定淀粉酶活性

使用DNS方法,淀粉酶活性测定进行了检查,比较细菌胞外淀粉酶的生产能力。如图5(一个)110中淀粉酶的活性细菌分离物为0.66 U /毫升28°C, pH值5.2。根据化验结果,淀粉酶活性的水平分类如下:高活动(> 2.00 U /毫升),矮秆、活动(1.00 - -2.00 U /毫升);一般活动(0.66 - -1.00 U /毫升)和低(< 0.66 U /毫升)的活动。因此,110个细菌分离淀粉酶活动分为四层:5株高活动(4.55%),12个菌株中矮秆活动(10.91%)、28株一般活动(25.45%),和65株低活动(59.09%)。此外,六个土壤样本的平均酶活性如图5 (b),排名从高到低GM-hb (1.12 U /毫升),BSC-f (0.66 U /毫升),GM-b (0.60 U /毫升),KDG-f (0.56 U /毫升),RB-c (0.49 U /毫升)和RB-hb (0.42 U /毫升)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
淀粉酶活性的分布曲线。(一)110细菌分离混合在一起。表示的误差的标准差均值为110淀粉酶活动在三个复制值(n= 330)。(b)细菌隔离从6个土壤样品中分离了出来。每个误差棒代表每个样本的标准差均值的淀粉酶活动在三个复制值,GM-hb 20株(n= 60),BSC-f 14株(n= 42),GM-b 25株(n= 75),KDG-f 20株(n= 60),RB-c 17株(n= 51),RB-hb 14株(n= 42)。

值得注意的是,五株高淀粉酶活性都来自GM-hb(图5(一个))。菌株2 a2 (2.16 U /毫升),2 d3 (2.16 U /毫升),2 f3 (2.14 U /毫升),2 c1 (2.09 U /毫升),2 b1 (2.06 U /毫升)被确定为芽孢杆菌mycoides,荧光假单胞菌,Chryseobacterium pennipullorum,c . pennipullorum,c . jejuense,分别。更重要的是,12株高淀粉酶活性中期也属于上述属:五株芽孢杆菌五株,Chryseobacterium,和两个菌株假单胞菌。作为一个结果,芽孢杆菌,Chryseobacterium,假单胞菌似乎是主要的细菌属较高的淀粉酶活动在我们的研究中。

4.5。独特的Amylase-Producing细菌酶的性质
4.5.1。温度和小灵通对淀粉酶活性的影响

这里,我们进一步进行淀粉酶活力测定不同温度下(4、10、28、50和65°C)和小灵通(pH值3.2,4.2,5.2,9.2,和10.2)来确定影响因素的淀粉酶活性细菌隔离。图6温度的影响下呈现出了八个酶活性的特点和小灵通。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
温度的影响(a)和(b)小灵通代表菌株的淀粉酶活性。

一方面,四个温度特征嗜中温淀粉酶、淀粉酶广泛的温度,高温淀粉酶、和低温性淀粉酶(图6(一))。具体来说,嗜中温淀粉酶显示28°C的最佳温度,低于或高于活动显著降低( 价值< 0.05)。酶活性的下降可以部分解释为特定功能的蛋白质结构的丧失。这些嗜中温淀粉酶产生6株(5.45%),2 a2, 2 d3, 2 f3, 2 c1、2 b1 2 b4,属于属芽孢杆菌,假单胞菌,Chryseobacterium。广泛的温度淀粉酶活性差异不显著28°C和其他温度下,分离得到102株(92.73%)。值得注意的是,高温淀粉酶和低温性淀粉酶菌株中分离的12 d18和3 f1,分别(图6(一))。高温淀粉酶从12 d18显示其最适温度50°C,酶活性的增加从0.86 U /毫升(28°C) 1.53 U /毫升。被确认为农杆菌属和其他细菌属(芽孢杆菌,普罗透斯,假单胞菌)也被报道的最大淀粉酶活性在50°C (47]。热活动50°C是低于先前的报道hyperthermophilic淀粉酶的最佳温度地衣芽孢杆菌NH1 (90°C) [55),地衣芽。b4 - 423 (100°C) (11]。然而,我们的高温淀粉酶活性最高的50°C可能有利于使用作为淀粉糖化酶过程。淀粉液化所得,淀粉浆的混合物,酶是第一次煮瓦解的分子,降低粘度在105 - 110°C,然后是部分分解淀粉需要冷藏50 - 60°C为进一步糖化(11]。对于好寒性的淀粉酶,最高0.79 U /毫升的活动在10°C,和生产细菌隔离3 f1属于芽孢杆菌mycoides。这是有据可查的b . mycoides耐寒的物种,一些菌株可以生长在7°C以下(56,57),这可能是原因之一b . mycoides淀粉酶展品cold-active属性。寒冷的环境可能带来的居住细菌一种自适应特征进化出一系列独特功能的酶。

另一方面,酸碱等淀粉酶活性的影响3.2到10.2显示其他四个酶特点:酸——或者alkali-intolerant淀粉酶、两性淀粉酶、alkaliphilic淀粉酶、酸和alkali-active淀粉酶(图6 (b))。具体来说,酸或alkali-intolerant淀粉酶显示活动急剧下降低于或高于pH值5.2。静止在极端的pH值下可能部分归因于变性酶的结构。有41株(37.27%)为酸分离,或alkali-intolerant淀粉酶,包括上面提到的6株,嗜中温淀粉酶(2 a2, 2 d3, 2 f3, 2 c1、2 b1和2 b4)。而两性淀粉酶展出其活性无显著差异从酸碱3.2到10.2。总共42株(38.18%)显示其淀粉酶活动内的pH值范围宽,大多是确定为芽孢杆菌(29株)。尽管早前报道的淀粉酶活性范围pH值3.5 - -7.0芽孢杆菌sp kr - 8104。19),我们的两性淀粉酶隔绝芽孢杆菌似乎有一个广泛的活动范围的小灵通。令人惊讶的是,alkaliphilic淀粉酶从24株(21.82%)显示峰值活动在pH值10.2。有17株样品RB-c隔绝,引发假说是否土壤样品的理化性质非常碱性,细菌在碱性淀粉酶效果最好博士此外,我们alkaliphilic淀粉酶隔绝芽孢杆菌(15株),假单胞菌(5株),Chryseobacterium(1株)克雷伯氏菌(1株)Rahnella(1株)Raoultella(1株),可以得出的结论是,的主要细菌属alkaliphilic淀粉酶芽孢杆菌。这一发现与先前的报告是相一致的芽孢杆菌sp.淀粉酶已经使用在一个碱性pH值(58,59]。类似的研究发现,碱性淀粉酶芽孢杆菌sp.显示的最大活动pH值9.0范围内的pH值8.0 - -10.0 (59),所以在我们的研究中,alkalophilicity pH值10.2可能会更加突出。最后,酸和碱活性淀粉酶在pH值为4.2和9.2,显示更高的活动而活动pH值5.2。生产细菌分离株(12 12 d7, 12 d8、d9)被确定为黄杆菌属psychrophilum,芽孢杆菌megaterium,b . aryabhattai,分别。嗜酸性pH值4.2活动可能带来的优势淀粉酶在工业应用。目前,有一个很大的兴趣提高低pH值工业淀粉酶的活性。淀粉液化过程是有限的pH值在5.8 - -6.2,这是在目前的工业淀粉酶的最佳pH值。然后,如糖化的后处理步骤需要进行pH值在4.3 - -4.8 (60,61年]。

最后,13代表细菌分离显示双重特征的淀粉酶对温度和pH值的活动,可以看到在图7。隔离1 d10 12 d17 12 d14, 1 d1, 1 d3 9 d16, 2 f4, 4 b5可以产生broad-temperature和两性淀粉酶。菌株3 a2, 1 d4-1, 1 d4 broad-temperature被孤立,alkaliphilic淀粉酶。此外,高温和两性淀粉酶菌株12 d18好寒性的和alkaliphilic淀粉酶菌株3 f1。先前的研究发现,属变形杆菌和芽孢杆菌能够产生高温、碱性淀粉酶,最优活动50°C, pH值9.0和45°C, pH值8.5,分别47,62年]。然而,12 d18属于隔离农杆菌属表现出最高的淀粉酶活性(图9.2 50°C和pH值7)。此外,低温性和alkaliphilic淀粉酶菌株3 f1 (芽孢杆菌mycoides显示最优活动10°C和pH值10.2(图7)。对淀粉酶的低温性和alkaliphilic活动,我们的观察似乎优于cold-active和碱性淀粉酶枯草芽孢杆菌最优的活动是在25°C和pH值8.0 (63年]。


图7
代表细菌隔离了淀粉酶的双重特征温度和pH值的活动。每个细胞都贴上相对淀粉酶活性(U /毫升)。
4.5.2。细菌分离株的多功能酶的能力

我们进一步探索淀粉酶的细菌分离是否有其他功能酶活性的一个基于活动的筛选(图的方法8)。有47株(37.01%)生产淀粉酶和蛋白酶活动,主要确定为芽孢杆菌(32株),紧随其后的是Chryseobacterium(8株),Exiguobacterium(3株)假单胞菌(2株),小细菌属(1株)Paenibacillus(1株)。13株(10.24%)能够淀粉酶和酯酶的活动,属于三个细菌属:芽孢杆菌(6株),假单胞菌(6株)黄杆菌属(1株)。明显,有四个细菌分离株(3.15%)分离淀粉酶、蛋白酶、酯酶,如图9。的四株triple-functional酶活性被确定为芽孢杆菌aryabhattai(1 d1、1 d3和1这里)荧光假单胞菌(1 e2)。根据上述研究淀粉酶特性、菌株1 d1和1 d3孤立broad-temperature和两性淀粉酶(图7)。这些细菌隔离可能会更多的关注于科学研究和工业应用。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
淀粉酶产生菌(一)蛋白酶活动和(b)酯酶的活动。

图9
的数量和百分比127淀粉酶产生菌分离株蛋白酶和酯酶的活动。三角形的颜色表示的样本来源菌株(黑色:GM-b,红色:GM-hb,蓝色:RB-c;格林:RB-hb、紫色:BSC-f,布朗:KDG-f)。

5。结论

西藏土壤可能会提供一个独特的环境有利于居住细菌生产功能酶与优越的活动。在这项研究中,127 amylase-producing细菌分离得到6土壤样本中收集的林芝,西藏。在这12确定细菌属芽孢杆菌应该是占主导地位的属对淀粉酶活性。对细菌群落的多样性,我们发现变异出现在土壤微生物,这可以部分解释土壤高度和耕作实践。此外,我们得到一个好寒性的和alkaliphilic淀粉酶的细菌分离3 f1 (芽孢杆菌mycoides)。当然,还需要进一步的研究来揭示关键氨基酸残基(结构性因素)寒冷的抵抗和alkaline-adaption。因此,细菌分离株在这项研究中可能潜在的淀粉酶行业的进一步利用。

数据可用性

Excel和其他数据文件用于支持本研究的发现可以要求从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

胡安林陆和香港设计的研究。郭Jiahui刘和Jiani amylase-producing菌株的分离和鉴定。Jiahui刘进行相应的数据分析和随后的调查的酶细菌分离株的特性。刘林和胡安起草手稿、陆和香港修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持的经费如下:(1)中国国家重点研发项目(批准号2021 yfc2100203);(2)上海科学技术研究项目(批准号19 dz2282100)。