成功的秘诀:建议和对细菌素的分离和描述的建议

文摘

细菌素是细菌产生的抗菌肽。虽然只有两个肽被批准用作天然防腐剂的食物,目前的研究专注于扩大他们的应用程序作为潜在的治疗对临床病原体。我们实验室集团一直致力于细菌素超过25年了,在这段时间里,我们有孤立bacteriocin-producing微生物从各种各样的来源包括人类皮肤,人类的粪便,和各种食品。这些细菌素纯化和特征,及其潜在的应用。我们还确定了生物工程的衍生品原型lantibiotic乳酸链球菌肽具有比野生型更可取的属性,如增强抗菌活性。在当前通信,我们讨论的主要是用来确认这种多肽的方法。此外,我们提供了一个按部就班的指导,实施这些方法,包括相关图。我们希望我们的建议和意见将在搜索中使用他人,和随后的分析,小说细菌素,和衍生品。

1。介绍

提出,几乎每一个微生物产生至少一个细菌素,包括古菌的物种的成员(1]。尽管许多特征,全面影响和作用这些生物活性肽在他们的生态区位尚未阐明1- - - - - -4]。已经观察到,在亚致死浓度,细菌素促进微生物之间的通信占据同一个空间,虽然存在于大量时,起到杀菌作用。

细菌素被定义为细菌产生,核糖体合成肽和抗菌性与其他细菌。与抗生素生产,使生物活性肽的能力是最古老的防御措施微生物之一。最初合成活性前体,在氨基端释放活性肽酶乳沟。在某些情况下,乳沟前肽进行转录后修饰尽管这不是一个普遍的特征(5,6]。尽管这些缩氨酸是不断调整的分类5,6),这些都是小的共识是,生物活性肽在一系列稳定pH值和温度条件。它最常观察到细菌素表现出有针对性的活动(5,6)对其他菌株密切相关,通常那些驻留在相同的生态位。然而,广谱细菌素与活动与更广泛的物种已确定,但程度较轻(7,8]。

市场目前的趋势表明,已经有增加即食(RTE)产品的消费,与一个对最小加工食品日益增长的需求只包含自然添加剂(9,10]。记住这些方面,食品工业必须提供产品保质期长,营养含量高,一个低风险的污染物。发现了细菌素的食品与食品安全统一消费需求的需要。

目前,只有两个细菌素被释放到市场,这两个作为天然防腐剂在食品应用。这些多肽提供高标准的保护与食源性疾病和腐败微生物,同时满足消费者对食品的需求低,人工防腐剂。一个这样的细菌素被用于实现这个Lactococcus冲击波肽,乳酸链球菌肽。乳酸链球菌肽是第一个细菌素是通常被认为是安全的(肝)和批准使用作为防腐剂在食品(5,11]。目前产品销往全球七十多个国家。肽已成功发现严重食品病原体包括抑制增长单核细胞增多性李斯特氏菌(12),隔绝RTE的食物,如煮熟的肉类和蔬菜通常吃(即。进一步,而不是加热或烹饪)[13- - - - - -15]。研究也发现,乳酸链球菌肽改善一系列商品的保质期,包括乳制品和饮料通过降低化合物的形成与腐败,同时提高香气和味道16- - - - - -18]。第二个细菌素肝状态和批准用于市场也来源于乳酸细菌。这种肽,pediocin PA-1D,显示类似的活动l . monocytogenes(19]。

给出有效的活动,表达了对食品污染的生物研究的其他潜在应用食品级细菌素已经被探索。在这一过程中,人们已经发现,这些肽具有杀菌活性与广泛的物种,包括临床相关的生物和诸如耐甲氧西林耐药菌株金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)20.- - - - - -22]。动物实验证实,细菌素能保持其生物活性和效力在活的有机体内,表明其潜在可摄取的或注射治疗(23- - - - - -25]。狭窄的频谱活动被一些细菌素(如苏云金菌素CD [26]),可以是非常有益的,因为,与传统抗生素、窄谱细菌素可以抑制目标细菌没有附带损害宿主有益菌(5,24,27]。细菌素的生物医学应用调查扩大远远超出他们的抗菌性能。目前有研究表明这些肽具有抗病毒、抗癌,杀精子的影响(28]。

在本文中,我们的目标是提供建议细菌素的分离和描述基于25年我们的实验室已经积累的经验和知识,补充与相关外部资源探索细菌素的潜在应用。这将通过提供一步一步的协议和图表,并将从集合中包含整个过程的潜在bacteriocin-producing测试环境来源的菌株纯化肽的潜在应用在复杂的媒体类型。这样做,我们希望我们的专业知识可以填补空缺,传统方法评价忽视了协助寻找新颖的治疗方法,可以驱车返回阻力及其的浪潮即将到来的威胁社会健康和福祉。

2。细菌素的分离、净化和描述

2.1。选择一个环境Bacteriocin-Producing微生物的来源

提出了图1,第一步确定细菌与抗生素潜力是一个位置的合理选择来隔离微生物,以及随后的检查化验确定菌株的活动。最常用的方法之一,识别潜在antimicrobial-producing菌株为原料延迟对抗试验。这里,一夜一个孤立的文化应变在调查中发现到一个新鲜的琼脂板和后细菌覆盖和孵化指标。孵化后,清理的区域的外观指标应变增长覆盖琼脂的抗菌活性的说明。尽管延期对抗化验是我们实验室最常用的方法,各种各样的其他在体外汤,为原料的技术进行筛选研究时可以使用。而体贴的化验,如培养目标菌株在孤立的存在在调查中29日]或在其细胞自由浮层的存在30.),已经成功地应用于识别细菌生物活性,为原料的方法更有规律地实现。常用的为原料技术包括如spot-on-lawn化验,纸片扩散,扩散分析(31日]。这三个操作使用类似的原则,即生物活性成分扩散通过固体培养基和活动来衡量目标菌株的抑制增长。在spot-on-lawn试验的情况下,10μL细胞自由文化的上层清液在调查中发现到琼脂板的表面一直有在整个表面均匀擦洗接种指标压力。纸片扩散试验与执行过滤盘已经浸泡在细胞自由文化的上层清液在调查之中。然后饱和盘放置在琼脂板的表面已经有在整个表面均匀擦洗接种指标压力。区域的外观清理草坪生长的文化被发现,或者盘放置,表明生物活性(31日]。然而,鉴于肽可能不会产生合适的数量,这些方法使用少量的潜在抗菌可能不是适合最初的筛选过程。

准备银行隔离取样,我们建议收集菌株在环境领域,理性选择。推测所有的菌株产生至少一个细菌素(1),因此隔离微生物抗菌生物活性与任何栖息地,假设,是一件简单的事。然而,重要的是要考虑指标株细菌素对在选择将测试环境收集菌株来源。

广泛的细菌素的特点,虽然存在一些广谱的生物活性肽,许多拥有狭窄的频谱是有限的活动密切相关的菌株或其他细菌共存同一栖息地内(24]。考虑到目标活动谱一些细菌素,执行一个屏幕使用隔离来自一个环境目标细菌此前被隔绝或已知感染或污染,因为这可能会增加隔离的机会与所需的生物活性肽。

意图等人进行的一项研究是一个典型的例子合理选址环境来源的筛查bacteriocin-producing微生物(26]。艰难梭状芽胞杆菌是一种投机取巧的病原体,通常侵入肠道当自然共生的微生物群已损坏或干扰。这些障碍可能发生以下的广谱抗生素,导致慢性腹泻,尤其是老年人和免疫功能不全的危险。鉴于感染站点的位置,意图等人推测,人类肠道细菌,可能自然抑制这种入侵病原体的生长。由于这个原因,30000隔离从成人的粪便样本筛选获得的文化梭状芽孢杆菌。获取一个细菌,并有针对性的活动梭状芽孢杆菌但这并没有打扰自然微生物群,意图等人从银行旨在分离出孢子形成的厌氧菌(26]。添加乙醇清洗步骤和厌氧稀释剂达到了这个要求。

30000 faecal-isolated菌株,分离,以后的应变苏云金杆菌,被发现产生一个小说,双组分肽称为苏云金菌素CD表达有效的活动梭状芽孢杆菌(26]。与自然力量对病原体,活动是具有高度针对性和剩余的,自然的肠道微生物群的安然无恙。大而多样的肠道生物群落的性质使它的一个有吸引力的目标bacteriocin-producing微生物的筛选和导致了许多成功的发现7,32]。出于这个原因,研究我们实验室正在进行中,正在调查gut-derived隔离抑制临床相关的潜在的病原体,例如,l . monocytogenes(33]。

第二个例子展示的重要性,合理的选址是在研究样本由奥谢et al .,导致一种新型阳离子细菌素的发现(7]。研究旨在确定抗菌生产商,可以对胃肠道病原体如产生抑制作用李斯特菌(34]。当设计一个研究来识别小说bacteriocin-producing哪个目标的肠道微生物病原体,奥谢等人选择生成一个银行唾液乳杆菌菌株进行调查。这乳酸菌居住在相同的环境李斯特菌曾被观察到发挥免疫调节和抗感染的好处他们驻留的主机的肠道。在这项研究中,10株,分离出人类和猪肠道样本,进行了基因组测序识别可能的细菌素。的分析唾液l .从猪空肠digesta DPC6502,原来孤立,导致基因簇的发现编码一种新型抗菌。纯化肽,叫bactofencin显示有效的活动金黄色葡萄球菌和l . monocytogenes,与lacticin 3147,另一个特征明显细菌素之前在我们的实验室研究7]。

合理选择环境的潜在来源的细菌素生产商是一个至关重要的步骤,设计一个结构化的计划目的是隔离的新颖的抗菌肽,反映在这个研究。通过筛选细菌殖民相同生态位的目标菌株感染,一种潜在的新型治疗严重的临床病原体是发现。然而,奥谢等人也理性由定心设计他们的研究项目在一个已知的生物活性物种的益生菌特征(7]。尽管这些菌株具有益生菌特性的观察并不本身就意味着一种细菌是细菌素生产商的情况下bactofencin强调为什么值得调查背后的原因可能是有益的效果。同样,奥谢et al .,奥沙利文等人进行基因组测序的研究只在一个银行coagulase-negative葡萄球菌菌株隔绝皮肤(35]。这家银行的基础上创建许多其他coagulase-negative菌株构成共生的微生物群,等葡萄球菌gallinarum和葡萄球菌hominis,被发现产生抗菌肽的数组。基因组分析可能导致一组13小说bacteriocin-producing菌株被发现(35,其中一个被发现的天然变体特征明显细菌素、乳酸链球菌肽(36]。乳酸链球菌肽J显示活动对一系列微生物相关的医疗和食品行业,如金黄色葡萄球菌,乳酸菌delbrueckii无性系种群。bulgaricus,Cutibacterium曼秀雷敦(36]。

2.2。选择合适的媒体和文化条件,细菌素产量

仔细考虑的媒体类型,媒体准备,培养条件筛选过程中使用可以极大地帮助细菌素的分离。如果媒体缺乏合适的营养物质和文化条件不利,污渍可能不会达到一个合适的细胞密度(37]。生物量较低会导致细菌素产生微不足道的数量导致未能遵守活动(37]。

收集环境样品时,必须注意在媒体和培养条件的选择,因为一些细菌可能无法生存从实验室条件下的生态位。这可能导致减少细胞生存能力和应变多样性在样本收集。为了避免细菌损失,最大恢复稀释剂可以用来缓冲和保护细胞,可能容易改变培养条件(38]。柯林斯等人成功地利用这个稀释剂当抽样从肠道内容、皮肤、鳃鱼(38]。尽管稀释镀是在2216年海洋媒体,最大恢复稀释剂的使用给敏感菌株额外的保护。以及,镀稀释样本后,柯林斯等人孵化样品三天,确保恢复菌株有机会增多。

确保有足够的碳源文化已经被证明是一种有效的方法优化肽的生产(39- - - - - -41]。几项研究试图确定因素影响细菌素产量已经证实的葡萄糖浓度从0.1%到3.0%不等的有效地增加细菌素的培养基(39- - - - - -41]。其他糖类研究为同一目的包括甘露糖、麦芽糖、果糖、乳糖和蔗糖,每个都有不同的效果取决于应变培养(39,40]。对于一些微生物,添加有机氮源是一个肽生产必需品,媒体就可能包含数量不足,或生物体可能无法biosynthetically来自其他组件在媒体上(42]。沉思室等人发现,当氮来源都从文化肉汤,细菌素的生产压力肠球菌mundtii2是完全无效的[曲43]。然而,即使一个氮含量元素的减少会导致文化观察活动大幅下降(43]。氮源可以追究他们的能力提高细菌素产量目标菌株包括胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆(40,41,43]。

最后,添加天然补充剂含有重要的宏观和微量营养素,否则可能会丢失的文化,还可以对肽生产测试,以确定它们的影响。Manzoor等人发现使用奶酪乳清(一种工业废料和丰富的乳糖,可溶性蛋白质、脂质、和矿物盐)乳杆菌培养基导致细胞密度显著增加文化,反过来,细菌素产量(40]。奶酪乳清已被证实提高细菌素产量等一系列其他物种片球菌属,芽孢杆菌,和Lactococcus(44- - - - - -46]。添加酵母提取物的培养基也被证明在某些物种,提高细菌素产量包括Lactococcus和芽孢杆菌(47,48]。大豆糖蜜玉米青贮饲料,脱脂牛奶汤,玉米浆进一步天然补充剂的例子,分析了他们对细菌素产量的影响40,41,49,50]。然而,与测试有关不同的碳源,结果取决于选择的应变(40,41,49,50]。

媒体的构成和如何使用它来达到合适的生物,因此大量的肽应该始终是一个重要的考虑。应用适当的碳和氮源在培养足够数量的生物活性评估检测和净化。对于一些bacteriocin-producing菌株(美国capitisCIT060 [8),美国capitisAPC 292336),而b . paralicheniformisAPC 157638]),细胞密度和肽生产达到适当的水平而不需要媒体的补充。然而,l . lactis菌株产生乳酸链球菌肽或lacticin 3147 (51- - - - - -53)是生长在tryptone-yeast汤,这两个是氮和重要的丰富来源肽生产过程在乳酸菌51,52,54]。

建立了合适的媒体组合时,理想条件下获得高细菌素产量必须确定。孵化文化在一系列温度(上方和下方的温度生态位分离)和调整的pH值开始文化都被发现影响肽生产的水平(39- - - - - -41,55]。另一个需要考虑的参数是大多数细菌素的时间点。好扩散分析执行文化孕育不同区段的上层清液已经被成功运用的评估这个因素(26,55]。这种分析不仅可以防止过早结束孵化但也表明当停止培养以防止细菌素降解的最佳时间,如果文化成为不利的条件。

l . lactis是公认的乳酸细菌的生物活性肽的生产,如乳酸链球菌肽和lacticin 3147。建议的名字,这个微生物产生乳酸的发酵糖在媒体上。在生长周期的晚期,乳酸的累积可以减少细胞生存能力和创造不利的条件。为了避免这种情况产生负面影响应变和肽,孵化的l . lactis菌株停止在16-20-hour马克和缓冲区,β添加甘油磷酸盐,调节pH值(56]。重要的是要考虑到细菌素产量的理想条件可能不是一种理想的文化条件。因此,相反,在一些压力,延长培养时间产生恶劣的文化条件可以诱导细菌素产量的增加。芽孢杆菌haloduransc - 125是一个孢子形成alkaliphile,最初从土壤分离(57]。它产生一个two-peptide lantibiotic haloduracin,曾被研究过在我们的实验室57]。调查haloduracin生产b . haloduransc - 125发现诱导孢子形成导致肽产生的数量显著增加(58]。这可能是通过增加潜伏期从20个小时到90小时,产生更多不利的条件在文化57,58]。

最后,它已经从它们的栖息地隔离观察,一旦删除可能需要刺激诱导细菌素产量。远离自然环境曾被观察到导致肽产量下降或不一致(59- - - - - -61年]。通过诱导habitat-specific强调媒体成分和培养条件,抗菌素生产可以显著增加62年]。Janek等人记录这一现象时施加的压力iron-limitation银行从鼻孔[89葡萄球菌菌株的分离62年]。铁是一个重要的营养参与许多不同的细菌过程(62年,63年]。它可以从周围环境中通过细菌产生的分子称为含铁细胞,这是专门为铁收购(62年,63年]。培养基中诱导铁限制可以提高细菌素产量压力(62年,63年]。通过建立iron-limiting条件通过增加铁的螯合剂,2,2′媒体关于环,Janek等人观察到52.5%的压力测试显示抗菌活性的增加m .危害和金黄色葡萄球菌(62年]。

本研究也暴露出同样的菌株H₂O₂,这是产生的链球菌的竞争对手,可以诱导细菌细胞死亡62年]。发现84%的antimicrobial-producing菌株在银行,18%显示增强的活动后暴露于0.01% H₂O₂。其他环境应力条件,可以应用于孤立文化包括降低温度缓慢的增长率,血氧饱和度,或添加有毒化合物,如乙醇浓度为1.0%,v / v,在中64年]。这些压力(温度低,血氧饱和度,添加1.0%,v / v乙醇)被发现增加细菌素的生产,amylovorin L471,合成乳酸菌amylovorus。

上述条件讨论了实验室规模的相关细菌素的生产分析,因此可能不是合适的和具有成本效益的工业大规模生产。例如,巴氏杀菌奶补充酵母提取物处理蛋白酶作为衬底的商业生产乳酸链球菌肽,作为传统媒体是不合适的65年]。

2.3。选择合适的指标

指示剂染色选择当筛查潜在细菌素是至关重要的,作为选择不当可能导致的失败观察抗菌活性。目标最好应该致病性菌株作为指标相关性,例如,的l . monocytogenes负责严重食源性疾病的爆发,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株在医疗设置构成重大威胁,或植物病原体根癌土壤杆菌,导致经济损失通过产品损坏(66年]。这给了细菌素的活动与市场需求的相关性(见表S1建议指示菌株及其相应的增长条件)。我们的经验在识别和描述细菌素让我们发现抗菌药物的敏感性不同菌株在同一物种可以差别很大,有些比别人表现出更大的敏感性。正是因为这一原因,我们建议,当进行初步筛选,多个同一物种的不同菌株被利用为指标来获得最好的概述潜在bacteriocin-producing分离菌株在银行。

菌株相同的目标包含大量减少的可能性antimicrobial-producing细菌被忽视了由于自然抗菌药物敏感性的变化。这是看到的一个例子(merrill Lynch)等人的研究当筛查bacteriocin-producing生物皮肤隔离在一个银行。六种不同的金黄色葡萄球菌菌株在屏幕(使用金黄色葡萄球菌NCDO1499、DPC5247 DPC5243,纽曼,5971年,RF122)。一个皮肤隔离在银行表现出活动对四个六金黄色葡萄球菌指示菌株小说后来被证明产生细菌素。包含众多的同一个目标生物减少抗生素生产商被忽视了的可能性由于自然应变抗菌药物敏感性的变化。只bacteriocin-producing隔离测试对吗金黄色葡萄球菌应变,应变的抗菌活性可能没有被发现。

与目标指示器应变,我们建议包括指标与高度的抗菌药物敏感性菌株屏幕。高度敏感菌株可以协助检测可能产生抗菌素,在低浓度或表明文化,没有有效的抗菌活性的主要目标病原体的研究。这是一个关键的一步,因为它可以减少的可能性小说生产商在银行要注意。敏感菌株筛选过程中采用的例子包括Lactococcus lactis惠普,乳酸菌delbrueckii无性系种群。bulgaricus6901年液化沼气,棒状杆菌属fimi国家反恐怖主义中心的7547年,微球菌危害(8,67年- - - - - -71年]。

即使活动对目标菌株的研究已经观察到,我们建议扩大调查孤立的活动通过应用更广泛,更多样的指标。这可能包括原地人类微生物组的成员,以确保他们不受到微生物的影响。这样做,可以评估活动和获得的光谱更全面概述小说抗菌素可以利用的地方。这样做,可以评估活动和获得的光谱更全面概述小说抗菌素可以利用的地方。同样,如果隔离在调查中没有显示对最初的活动,预期的目标指标,他们不应该被忽视。相反,这些菌株的潜在活动应该探索进一步对更大范围的病原体指标来决定其活动是否有潜在的在其他领域。

Actifensin是defensin-like细菌素和首次观察到所产生的放线菌ruminicola(32]。生产菌株分离从绵羊粪便样品32]。已经证实的存在对目标(抗菌活性乳酸菌delbrueckii无性系种群。bulgaricus液化沼气6901年- - -生活耐酸肠道里的细菌),Sugrue等人继续纯化肽的评估活动的范围。对革兰氏阳性微生物Actifensin呈现出广谱的活动,其中包括梭状芽孢杆菌和l . monocytogenes,众所周知的肠道病原体。肽也出现对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有效,表明其潜在对抗感染,发生以外的生产菌株的栖息地最初是隔绝的。这样的研究强调扩大领域的重要性指标检查,一些细菌素可能隐藏的潜在地区以外的自己的生态位。

然而,如果想要证明一个特定的利基是一个多产的抗菌肽的来源,一个人必须工作在反向:从网站获取隔离银行进行调查,确定相关的目标病原体,然后屏幕。确定一个适当的应变指标的重要性和应用它正确地反映在两个类似的研究目标,识别小说antimicrobial-producing菌株孤立的从人体皮肤。

奥沙利文等人进行的一项研究选择目标coagulase-negative葡萄球菌菌株在一个大银行的皮肤隔离来识别那些潜在的活动对病原体驻留在相同的利基,即。,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(35]。90000隔离从七个肤浅的网站获得20个人的尸体(140总样本网站)。这90000个殖民地被孤立在MSA或BHI琼脂板上。MSA是分离和识别中常用的葡萄球菌物种。递延对抗化验进行整个银行的反对乳酸菌delbrueckii无性系种群。发酵剂,保加利亚革兰氏阳性gut-colonising微生物,识别与潜在生物活性的菌株。这个屏幕后,最初的90000隔离测试,101株(0.12%的银行)入围,他们抑制目标菌株的生长。好扩散化验(见部分2.5这个测试的描述)是对同一个目标执行,使用中和上层清液的所有101隔离确认一种抗菌物质分泌到周围的媒体。这个测试的数量进一步减少入围细菌25(0.03%的初始样本大小)基于抑制带的存在。然而,在审查,这些入围的12株抑制性效应对目标被忽视,因为他们被认为产生区,太小了。剩下的13株,发现coagulase-negative葡萄球菌通过16 s rRNA测序,追求研究的其余部分。基因筛查确诊的剩余隔离小说在所有13株抗菌基因的存在(35]。

而奥沙利文等人在试图确定成功的小说bacteriocin-producing分离的菌株发现在皮肤上,指示菌株的使用不当(使用应变与乳制品作为对烹饪和微生物指标)筛查早期阶段可能有限数量的小说生产商发现(35]。奥沙利文等人有一个巨大的银行90000年开始皮肤隔离(35]。然而,99.98%的仅仅因为这是排除,抛开说菌株无法抑制增长的一个目标。鉴于一般细菌素具有窄范围的活动,选择一个目标已知微生物从采样站点驻留在一个完全不同的环境隔离的调查研究中可能导致不利的偏见导致抗菌活性被错过了。抗菌效果对这一指标只负责101隔离被结转进一步调查和只有13小说生产商被孤立35]。

比较,在同样的条件下进行的一项研究(merrill Lynch)等人看着评价抗菌生产从100年人为coagulase-negative葡萄球菌分离株(8]。虽然开始银行明显较小,林奇等人看到一个更高比例的隔离与生物活性比奥沙利文et al .,以下延期对立的性能试验(8,35]。这主要是由于菌株使用范围的指标。这里,延迟对抗化验对24个指标被占领执行相似生态位的分离测试,等m .危害,链球菌,金黄色葡萄球菌这是皮肤生物群落的成员。94%的隔离测试显示抗菌活性菌株对至少一个指标。其中一个隔离,CIT060,后来发现产生capidermicin,小说细菌素(8]。

本屏幕(中使用的两个指标Geobacillus kaustophilus DSM7263和Geobacillus stearothermophilus写明ATCC 12930)环境中细菌,类似l . delbrueckii无性系种群。发酵剂,保加利亚不会被认为是理想的目标微生物用于筛选skin-dwelling细菌(8]。CIT060,确认为一种菌株美国capitis没有抑制的增长g . stearothermophilus写明ATCC 12930。如果这是唯一指标(merrill Lynch)等人已经在他们的筛选,选择使用一个强有力的细菌素生产商就会被忽视,这表明应变指标选择的重要性。

正如前面所提到的在这一节中,一个细菌的敏感性菌株之间的抗菌素可以改变。出于这个原因,林奇等人使用多种菌株相同的物种,以确保准确的概述的抗菌谱可以确定8]。这说明了第二个重要问题有关指标选择在奥沙利文等人的研究。隔离是入围基于抑制增长的能力l . delbrueckiissp。bulgaricus(35]。然而,对只有一个应变(活动l . delbrueckiissp。bulgaricus液化沼气6901)是研究意义,一些银行可能拥有内隔离活动对物种但被错误地忽视,因为他们并没有显示出活动对这个特定的压力。我们觉得这是一个关键的一步减少可能小说制作人被忽视,可能被认为是在这项研究中,奥沙利文et al。

2.4。通过为原料延迟对立分析识别的抗菌活性

一个简单的方法通常用于标识隔离与抗菌活性为原料延迟对抗试验(见协议S2 (a),图S1和协议S2 (b)补充材料)。正如前面讨论的部分2.1,这个试验包括覆盖发现孤立文化与0.75% (w / v)琼脂接种一个适当的指标压力。试验允许抗菌行动的决心通过外表的抑制区应变的增长指标。

阐述了在部分2.3压力是至关重要的,适当的选择指标。最好的评估抗菌药物生产商在银行的数量,我们建议包括应变已知敏感抗菌素,如l . lactis惠普在避免失败的屏幕,观察活动可能产生抗菌素在低数量的菌株。我们还建议利用多个菌株相同的物种由于抗菌药物敏感性的差异可能发生(8]。

观察覆盖区域的增长表明抗菌作用的存在;然而,他们不能被用来评估抗菌效力,作为创建的区域的大小可能会误导人。如上所述,一些菌株可能产生抗菌素的数量低于别人,导致出现小产生的区域。区大小也可以减少由于干扰组件在媒体如硫酸带电糖或残留绑定抗菌,减少其生物活性(72年- - - - - -74年]。

抗菌素的结构是另一个因素可以影响区大小,因为它决定了肽通过复杂介质扩散。这是一个现象以前记录的希利et al。75年,76年]。在他们的研究中,劳斯等人试图调查12生物工程,突变的衍生品细菌素乳酸链球菌肽,以确定是否改善了抗菌活性与野生型相比肽(76年]。通过为原料延迟对抗化验,劳斯等人发现,12个衍生肽对至少一个显示增强抗菌行动的五个指标压力;他们创造了更大的抑制区,与野生型相比肽。然而,当这项研究转换到体贴的化验中肽需要扩散通过复杂的介质,增强力量的许多衍生肽消失了。相反,这些肽显示力量小于或等于野生型。劳斯等人猜测,突变(所有发生在乳酸链球菌肽肽的铰链区)给了生物工程衍生肽结构,允许更容易扩散通过复杂的聚合物,从而人为地增强区域的抑制在递延对抗化验(76年]。

2.5。好扩散分析

扩散化验(WDAs)可以应用于评估肽和多肽的生物活性菌株细菌素在不同阶段的识别和描述的过程。例如,WDA可以进行净化过程之前最好确定大多数抗菌集中,例如,当肽,它是分泌到周围媒体或保持绑定到细胞表面?通过比较从CFS获得活动的区域和整个细胞提取物(WCE)(解决方案包含抗菌剥夺了从细胞表面),可以很容易地确定最肽可以从[获得8,77年)(见协议S3和图S2的补充材料,制备细胞自由浮层和整个细胞的提取在一夜之间从一个文化)。如果在文化CFS进行这个测试,重要的是中和上层清液的pH值添加到之前对其进行井。这将允许确认任何观察到的区域的结算是由一种抗菌化合物的存在,他们不是由于上层清液的酸。WDA使用高效液相色谱后获得的分数可以识别哪些说分数包含活跃的细菌素,可以丢弃。同时,WDA使用纯化肽可以想象其活动在复杂的媒体执行体贴的麦克风测试(如详细的节2.4)[36,75年,76年]。

细菌素的分类是最集中的一个重要应用WDA(见协议S4和图S3补充材料)。许多净化处理方法提取肽专门从慢性疲劳综合症,没有提到WCE组件,例如,epidermin的净化,hominicin,葡萄球菌素T [36,49,78年- - - - - -80年]。在许多情况下,这可能是合适的,如果细菌素仅仅存在于周围的媒体(36,49,78年- - - - - -81年]。然而,它指出,细菌素,像那些由乳酸菌,能吸收生产者细胞表面(75年,77年,82年,83年]。

一项研究调查方法获得改进的细菌素从文化、杨等人发现,低pH值会导致细菌素被释放从细胞表面周围的媒体83年]。通过孵化细胞在低pH值(pH值2.5)与搅拌一小时,细菌素的更高的收益率将会获得比单独从细胞中提取自由浮层(83年]。一些细菌素,包括lactocin AL705 pediocin F,净化了这个方法(82年,83年]。因此,为了最有效的净化过程中,一个需要结合肽提取的CFS和WCE隔夜文化。如果这是被忽视的,文化会给低收益率,导致需要多种方法进行了净化收集合适数量的纯细菌素(8,26,77年]。

我们实验室使用一个类似的原则当提取抗菌肽l . lactis,细菌产生乳酸链球菌肽,生物工程生产增强生物活性乳酸链球菌肽衍生肽。虽然大部分乳酸链球菌肽肽存在于培养基,很大一部分仍然绑定到细胞表面,要求它被剥夺,结合肽纯化前的慢性疲劳综合症(75年,77年]。我们取得了通过孵化一夜文化的细胞颗粒在溶液中70%的异丙醇,0.1% trifluoracetic酸,和蒸馏水。Trifluoracetic酸是一个关键的组件。强酸,它生成一个合适的pH值(酸碱度≤2.0)和继续形成一个复杂的多肽,协助肽分离从细胞表面(84年,85年]。

2.6。抗菌活性的评估通过Agarose-Based径向扩散化验

如上所述节2.4应变大小的空地,覆盖指标增长可以减少干扰组件在媒体上,如硫酸带电糖或残留物(72年- - - - - -74年]。这些干扰因素可以与抗菌素和抑制其活动。克服这些不必要的交互,它已被观察到,执行agarose-based径向扩散化验(见协议S5和图S4补充材料)与CFS的孤立的应变是一个合适的解决方案(51]。

琼脂糖减少不利的静电相互作用的细菌素和媒体,和播种基础层的nutrient-limiting条件减少细菌繁殖的能力指标(72年- - - - - -74年]。第二个重要原因执行agarose-based径向扩散分析是针对革兰氏阴性抗菌活性指标的可视化。

革兰氏阴性细菌的外膜拥有作为一个堡垒,抑制某些细菌素的活性通过阻止他们进入细胞壁(51]。Agarose-based径向扩散非常敏感,能够使它们被用来想象的清算或小区域增长疲软的指标压力。这种方法已经成功地用来检测活动对革兰氏阴性菌株的潜在的敏感细菌素(乳酸链球菌肽),此前只显示活动针对革兰氏阳性菌株。实验参数可以调整呈现革兰氏阴性细胞容易受到细菌素,通常只影响革兰氏阳性微生物(亚致死的热接触,螯合剂,和渗透压休克51])。然而,agarose-based径向扩散分析能够想象抗菌细菌素和革兰氏阴性细菌之间的相互作用而不需要诱导敏感性,即使增长的抑制肽的程度很低。在agarose-based径向扩散试验,测试细菌只暴露在细菌素和缓冲区覆盖之前发生,这会减慢指示器应变增长和揭示了抗菌药物敏感性51]。

这个曾被证明了场等人当筛选乳酸链球菌肽衍生肽增强活动(51]。Agarose-based径向扩散试验表明乳酸链球菌肽,还有几个小说尼生素突变体显示活动对革兰氏阴性细菌Cronobacter坂,大肠杆菌,沙门氏菌,没有添加任何其它化合物诱导敏感性。结合,我们感觉的结果从agarose-based径向扩散分析那些从为原料获得扩散分析和允许改进评估抗菌药物生产商在银行的隔离。

2.7。净化的肽

在开始净化之前,我们建议执行WDAs CFS和WCE应变进行调查,评估当肽浓度最高的驻留,如前所述2.5。从CFS和WCE组件中提取抗菌肽(77年)将协助在净化过程中获得最佳收益(见协议S6补充材料)。

设置在一夜之间文化净化时,必须优化培养基和培养参数细菌素产量。当执行方法进行了净化乳酸链球菌肽和乳酸链球菌肽衍生文化2 L肉汤接种1%的隔夜文化被发现生产适当数量的肽(36,77年]。体积是很重要的考虑,这可能不是足够如果应变产生低浓度的肽。在某些情况下,它也可能超过是必需的。先前的研究已经进行净化小卷(1 L一夜之间文化(26])和其他研究需要大量L(3卷(8])。确保汤与所有的额外补充营养需求(例如,碳源、氮源和微量元素)和缓冲它需要。之前培养bacteriocin-producing菌株和高效液相色谱法,肉汤穿过一列安伯来特XAD-16N珠子(Sigma-Aldrich) [8,26,36]。这个澄清媒体通过去除疏水性和带电部件,可以形成非特异性相互作用的肽(73年)和干扰下游净化过程。

有收获CFS和WCE的细菌素,这两个元素可以汇集继续净化过程。我们实验室净化细菌素通过高效液相色谱使用Phenomenex C12反相高效液相色谱(RP)(木星4列μProteo 90 A, 250×10.0毫米,4μ米)(8,75年,77年]。促进乳酸链球菌肽的纯化及其突变的衍生品,我们雇佣一个梯度的30 - 50%乙腈和0.1%三氟乙酸。然而并不适用于所有的细菌素,尤其是如果它是第一个净化小说多肽和所需溶剂洗脱的比例尚不清楚。最初的净化,梯度5% - -80%的有机溶剂和酸应该用来保证一切都从列筛选了。在完成初期的高效液相色谱过程,WDAs应该执行使用运行每个分数,以确定哪些包含活性肽。关联扩散试验和山顶的结果画在高效液相色谱过程中,溶剂洗提肽所需的百分比可以计算。未来可以定制方法进行了净化一次溶剂比例是已知的,即,no longer have to start at such a low concentration (5%) and run until such a high concentration (80%) if it is known that the peptide elutes around 30–40% solvent.

肽的保留时间确定后,相关的分数可以组合和受到进一步旋转蒸发,任何剩余的有机溶剂现在必须删除(75年,77年]。剩下的液体可以lyophilised保留完整和适当存储肽(75年,77年]。

净化方法讨论一直被应用在许多实验在我们实验室几个物种的隔离细菌素(Lactococcus,葡萄球菌,芽孢杆菌)[8,36,38,52,69年]。然而,它可能不适合所有的肽。出于这个原因,如果上述方法不成功,备用选项,如化学溶剂,离子交换和凝胶色谱法(86年可以探索。硫酸铵曾被用作一种有效的化学溶剂沉淀从细菌培养不破坏生物活性肽87年]。另一种方法用于纯化肽从大量的文化是离子交换88年]。细菌培养的应用适当的列导致的快速纯化肽具有高程度的纯度。

rp和MALDI-TOF质谱分析可以用来确定纯化物质获得的分数包含一个汇集活跃,活跃的细菌素,或者多个肽。净化后,高效液相色谱的色谱纯化样品应检查是否存在多个峰值,表明取得多个肽(89年]。此外,纯度可以确定样品的质谱分析。类似于高效液相色谱分析,纯样品应揭示的存在一个明显的高峰。如果已经确定了多个肽存在,个人肽可以通过优化液相色谱分离条件。这可以包括操纵溶剂类型和温度,来帮助实现分离的多肽coelute [90年]。针刺在16%的丙烯酰胺凝胶和10%的丙烯酰胺凝胶分析与可视化银染色法是另一种方法,细菌素的纯度分数可能是评估(91年]。

结合肽纯化、基因分析识别的生物合成基因簇参与细菌素产量可以确定肽孤立执行是小说,可以协助确定结构。基因组挖掘工具,如百吉饼、BACTIBASE Anti-SMASH可以应用于识别感兴趣的基因,如与免疫相关的基因、监管、运输、和肽修改(92年- - - - - -95年]。爆炸搜索和定位工具,如ClustalW还可以帮助确定是否肽分离是小说。之前直接匹配的基因簇的特征肽可能表明纯化肽在过去已被确认。然而,如果应变在调查中只显示相似的基因,细菌素相关基因,那么它可能已经发现一种新型抗菌。

2.8。细菌素的敏感性和稳定性分析

几个特征包括耐热性、稳定在一个范围的pH值条件下,和蛋白酶酶敏感性归因于抗菌肽(96年,97年]。检查是很重要的,如果被调查抗菌具有稳定在一系列紧张的条件下确定其稳定范围和提出,基于其敏感性,哪些产品或环境可能是最好的应用。细菌素是蛋白质,因此敏感蛋白质降解酶(96年,97年]。暴露在蛋白酶可以减少或完全抑制他们的生物活性96年,97年]。蛋白酶敏感性分析已经成功地用来帮助小说描述的细菌素在许多研究[8,26,36,38)(见协议S7 (a)和图S5或协议S7 (b)和图S6补充材料)。

孵化CFS、纯化肽或部分/粗肽提取protein-degrading酶可能表明如果先前观察到琼脂的抗菌活性和体贴的化验是由于细菌素或传统抗生素的存在。抗生素次生代谢产物的化学结构,因此,他们通过与蛋白水解酶活性的影响。孵化后,如果生物活性的蛋白酶暴露样本是减少或抑制,可以得出结论,活性剂是蛋白质的性质。这个测试的次要目的是建立一个完整的肽对耐用性和对蛋白酶及其性质。确保整个光谱的灵敏度是衡量,各种各样的酶,包括蛋白酶K,α胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,可以用来对付肽(8]。鉴于其潜在的应用程序作为天然防腐剂在食品,蛋白酶敏肽应该建立的配置文件,因为它是合理的假设细菌素在调查中可能接触到消化酶或其他蛋白质降解酶,存在于一些食品。

关键是进行细菌素pH值和温度稳定性试验时,适用范围的实验参数检查给定的环境条件的范围细菌素可能面临当应用于食品或药品(见协议S7 (c)和协议S7 (d)补充材料进行pH稳定性和温度稳定性测试,分别)。可以确定潜在的细菌素热稳定性孵化CFS或纯化肽在温度低至0°C到121°C, 15分钟的时间(26,35,38,52]。扩散化验在热处理肽对目标菌株可以表现来确定生物活性受到影响。这些温度反映了食品存储、冲销和烹饪温度可以变性和灭活肽。同样,这包括温度制药药物产品的范围可能曝露在存储和冲销。的稳定范围肽可以深刻当添加或应用细菌素在准备食物或药物的制造过程。如果传统的高压蒸汽条件下细菌素是稳定的(121°C,在15 psi与温湿15分钟),它将简化添加肽的生产过程,因为它可以包含在终端消毒过程。

包含细菌素的慢性疲劳综合症或resuspended纯化肽应调整pH值范围从酸碱2到1126,35]。这也将建立一个完整的细菌素的稳定性在不同生理小灵通。不是所有的食物都有一个中性pH值,例如,发酵食品或饮料。如果细菌素保留其活动或成为变性,这将是指示性的环境中肽可能或可能不适合。扩散化验使用pH-adjusted样本对相关目标应变可以用来描述这些条件改变对肽生物活性的影响。作为第一个细菌素批准用于消费,乳酸链球菌肽已研究和特征。最稳定在低pH值,肽的发现了溶解度随着pH值增加(减少98年,99年]。尽管在冲销和准备过程中热稳定性高,高温存储超过一段时间(25°正在°C进行为期八周)大大降低肽可行性(99年]。理解的稳定性和耐用性细菌素可以帮助了解其应用以及它如何可以用来改善产品或病人的需要。

这应该考虑虽然对环境条件的敏感性是面临的主要问题之一在活的有机体内细菌素的活性。尽管显示稳定当测试用肉汤和琼脂,细菌素可能对身体或行为不同。在动物试验,观察到当口头,lacticin 3147没有通过肠道生存交通One hundred.]。蛋白酶和不利的pH值条件灭活肽在到达目标站点之前。另一方面,当使用的静脉和interperitoneal路线,lacticin 3147保留活动101年]。尽管一个彻底的评估蛋白酶和pH敏感地可以表明肽适用性在实验室条件下,解决是否适合进一步的研究是必要的在活的有机体内使用。

2.9。最低抑制浓度(MIC)

方法通常用于确定抗菌的麦克风是由欧洲委员会描述药敏测试(EUCAST)和临床和实验室标准协会(CLSI) [8,12,102年- - - - - -104年)(见协议S8和图S7补充材料)。EUCAST所定义的,一个麦克风”的最低浓度的代理完全抑制增长根据肉眼可见,无视一个殖民地或一层阴霾的面积内接种点”(104年]。因此,目视检查所需的盘子后孵化是唯一的方法来确定麦克风。

如果进行MIC测定微量滴定板塑料96 -好,最佳实践是培养无菌溶液1% (wt /卷)牛血清白蛋白(BSA)溶解在磷酸缓冲的井,30分钟37°C (51,77年,105年]。这可以防止非特异性蛋白质吸收塑料表面,这将减少的生物活性肽。正如前面提到的部分2.3(选择合适的指标),我们建议谨慎选择目标菌株的鉴定。试图确定的活性肽对细菌外频谱的活动(如前所为原料扩散化验确诊)可能暗示不活跃,在现实中,肽只是被误用。重要的是要注意,一些肽可能增强扩散通过复杂的媒体与他人相比。固体的转变,复杂的媒体肉汤,不需要扩散,将揭示肽具有强有力的活动针对的目标指标压力和表面增强[75年,76年]。这种增强扩散会导致一个巨大的差距为原料中观察到测试结果和执行在汤,如深度节所述2.4。

麦克风化验端点测试,也就是说,一个单一的结果,或一组结果,一旦获得反应(肽的孵化与目标应变)已经停止了。潜伏期,年底的效力两个肽可能是相似的(两个麦克风差值)或同等学历。然而,这个终点的结果可能不准确地反映整个孵化活动,因此我们建议执行动态测试,如增长并杀死曲线。这些动力学分析可用于监测细菌细胞死亡和回收率目标菌株的暴露程度的肽。这是在部分进行更详细的讨论2.10(增长和杀死曲线分析)。执行麦克风化验时,重要的是,同一物种的多个菌株鉴于调查抗菌药物敏感性菌株之间的不同(8,56]。这可能导致不当的判断的抗菌谱肽(8,56]。

尽管麦克风试验是利用最广泛的黄金标准模型,它需要纯化细菌素制剂和活动表示为毫克/毫升。活动单元(AU)试验替代方法,可以用来表达活动CFSand活动作为活动的单位每毫升(AU /毫升)[35]。一个细菌素单元被张等人定义为“最高稀释的倒数,显示一个明确的抑制区”(106年]。

2.10。增长和杀死曲线分析

作为一个端点检测,麦克风测试不能洞察整个暴露在抗菌细胞的可行性,结果只有一个潜伏期结束时。正是因为这一原因,生长曲线分析(见协议S9和图S8补充材料)和杀死曲线分析(见协议S10和图S9补充材料)应该执行。这些化验可以想象影响肽对滞后时间和细菌细胞复苏。

场等人进行的一项研究试图比较新颖的生物工程乳酸链球菌肽衍生物的抗菌作用的野生型肽(107年]。动能拦截曲线分析了使用致命的细菌素水平对微生物测试,在野生型的杀死作用肽相比,三种不同时间点的导数的潜伏期(20分钟,40分钟和60分钟)(107年]。板计数使用样本执行文化在不同的时间点显示如何衍生肽都造成了更大的减少测试细菌细胞计数,同时抑制细胞复苏比野生型更大的时间(107年]。这个例子展示了如何动力学分析可以提供更深入的角度来看一个端点检测细菌素的抗菌效果不能。

当进行杀死曲线测定,最佳实践监控几个时间点获得的完整概述细菌素杀死靶细胞。连续稀释和电镀样品定期和比较菌落计数测试样本细菌培养的存在或缺乏肽将允许一个图表的绘制,抓住滞后阶段的差异。因此,重要的是要把这些测试融入肽的分析活动。在生长曲线测试中,测试菌细菌素的影响在亚致死的水平滞后,可以观察到复苏,增长超过24小时使用一个自动化板读者(77年]。

2.11。食物模型试验

至此,讨论集中在检查细菌素的抗菌活性,在传统媒体实验室。然而,尽管细菌素可能显示有效的活动对目标菌株在这些条件下,它已经指出,当应用到更复杂的环境中,生物活性,可以降低或完全否定。食物模型试验以可进行检查对各种食品的细菌素的抗菌活性。

进行模型试验食物时,是至关重要的一个相关的目标选择压力,确保试验反映现实条件尽可能(见协议S11系列(一)和协议S11 (b)补充材料)。如果一个特定的目标还没有选择,那么应该考虑以下。达到市场相关性和镜子食品生产企业面临的现实问题,选择一个曾被发现的细菌污染的食物,例如,l . monocytogenesl . (108年),大肠杆菌(109年),或c .坂(110年]。尽管可以使用代理应变代替致病性微生物测试,我们建议使用一种病原体,特别是一个被隔绝爆发的来源,例如:l . monocytogenes从李氏杆菌病暴发或孤立沙门氏菌菌株与沙门氏菌病暴发。众所周知,细菌也进入食物链通过受污染的食品机械加工或不洁食品加工环境(111年]。抽样从这些环境也将提供适当的抗菌素的目标。最后,正如前面提到的,药敏的程度可以不同菌株相同的物种。这一现象正如前面演示的贝格利等人观察乳酸链球菌肽宽容的污点变量性质的集合l . monocytogenes压力(112年]。获得更准确的概述肽活动,避免测试的缺陷对高度敏感或耐药菌株,我们建议对一系列测试菌株来自同一物种。

确定了合适的目标菌株致病性,已知病原体污染的介质必须选择的试验,以确保提供的条件都是相关市场和尽可能准确的现实生活中的污染状况;例如,致病性l . monocytogenes众所周知,污染巧克力牛奶(108年),大肠杆菌曾被发现污染苹果汁(109年),而c .坂是导致婴幼儿配方奶粉污染110年]。当接种食物样本的指标压力试验,必须考虑CFU /毫升的浓度。食品病原细胞的典型浓度样本可能太低检测通过电镀或可能不是一个合适的数量显示细菌素暴露的影响。例如,自然的浓度l . monocytogenes污染的食物通常是不到10²CFU /毫升(113年]。为了便于检测,我们建议接种在更高浓度,尽可能接近真实的培养液,但数量仍将给一个可行的CFU /毫升镀时的结果。以前的食物模型试验研究用培养液,标准化的最终浓度10⁵在几个食物模型(CFU /毫升,76年,114年),但所需的浓度可能取决于所使用的应变。

食品试验进行测试的能力乳酸链球菌肽及其生物工程衍生品来抑制相关病原体的生长在一系列的食品,如巧克力牛奶,胶凝剂卡拉胶,法兰克福香肠肉,鸡肉面条汤,婴儿配方奶粉和苹果汁12,76年,105年,114年]。如前所述,虽然肽可能显示有前途的抗菌作用在实验室条件下,复杂的环境中它可能适用于可能含有抑制因素,减少或完全否定生物活性。组件(如复杂的碳水化合物,脂类,蛋白质,和环境干扰的pH值,降低肽功能(76年,115年]。

剪秋罗属植物等人进行的一个特定的研究强调了细菌素的活动如何根据不同的食物添加(114年]。问题的研究评估了乳酸链球菌肽和两个乳酸链球菌肽衍生物的生物活性肽在一些食品,含有相关病原体。体贴的化验,野生型乳酸链球菌肽肽有麦克风3.75μ米(12.57 mg / L)对目标菌株,c .坂。野生型被孵化c .坂在婴儿配方奶粉的浓度60μ(> 100 mg / L)。尽管高浓度的肽,没有减少Cronobacter观察CFU /毫升。在这个例子中,肽被发现在汤,有效抵御病原体的活动似乎几乎完全被复杂的媒介。体贴的杀死曲线,衍生肽(乳酸链球菌肽V和乳酸链球菌肽S29A)野生型(相比均有显著增强114年]。增强活动时最引人注目的肽与食品级油一起使用,例如,香芹酚。然而,当应用于婴儿配方奶粉,衍生肽展示活动相当于野生型,尽管添加香荆芥酚油(114年]。

减少或抑制时可能发生的生物活性食品系统应用到一个模型,是在这项研究中,观察到展示肽描述过程中这些测试的重要性。剪秋罗属植物等人指出,尽管不活跃的婴儿配方测试飙升时,乳酸链球菌肽的活性肽是保留在商业上培养准备苹果汁,导致一个日志减少指标,大肠杆菌O157 [114年]。我们建议多种食物类型的不同成分已知目标菌株污染的调查,虽然肽可能抑制在一个产品,活动可以大大改进了在另一个。如前所述,抗菌药物敏感性菌株之间在同一物种不同(8,56];因此,我们强调需要多个菌株合并到这些研究肽的准确评估的活动在一个复杂的媒介。

2.12。生物膜化验

生物膜是细菌产生的胞外矩阵允许浮游细胞坚持生物和非生物表面(116年]。这些黏液层防止细胞被免职,保护他们免受有害化学物质等外部因素,例如,消毒剂(117年,118年),和抗生素(119年]。形成生物膜的能力允许有机体创建持久的污染来源影响许多不同的工业领域。公司参与食物的准备和包装面临的问题持续的生物膜的形成。微生物生物膜已被观察到的表面上形成钢管(120年),在设备表面(如坦克(121年]),在水下表面(122年),在包装食物本身(123年]。以前绑定细胞可以释放矩阵(124年,125年),允许微生物传递管道或分布在表面,污染产品poststerilisation [120年,121年]。这些新浮游细胞可能达到食物分布,销售和消费。社会与人口老化和免疫力低下的人增加,受污染的食物逐年增长的威胁(9]。

在医院,生物膜也同样要求的关注。有机会入侵身体,例如,通过被污染的医疗器械的植入材料,细菌形成生物膜内的主机上,创建一个不屈不挠的感染源(119年,126年]。这些感染非常难以治疗,为患者带来风险和痛苦。生物膜的发展也被观察到在供水和管道网络的医药制造企业127年),这是特别令人担忧的需要完全不育这类产品的生产和包装过程。如果发现了细菌素抑制临床相关病原体的生长与生物膜的形成,探索肽的能力减少或防止生物膜在不同的表面可能会导致一个更好的发展其潜在应用程序的概述。

静止的微量滴定板的方法可以用来评估目标菌株的生物膜增长(56,77年,128年,129年)(见协议S12和图S10补充材料)。这个试验成功地证明了乳酸链球菌肽衍生品可以减少生物膜的形成及其生物工程塑料和医疗设备材料表面(56,77年,128年,129年]。

在选择菌株生物被膜的抑制研究,重要的是要考虑应变被隔绝的,例如,细胞持续发现污染食物,菌株分离坦克、管道、下水道食品或医药行业,或从表面的一个移植医疗设备。每个应变的biofilm-forming功能应该追究细菌素暴露之前,可以通过研究生物膜覆盖的微量滴定板(圆形,带盖子的的平底盘子以确保不育),与结晶紫染色,测定的吸光度。我们实验室曾允许菌株培养在48小时的潜伏期在评估生物膜生产(77年,128年]。然而,最大生物膜增长可能比这更早的实现,取决于应变在调查之中。评估的因素会干扰生物膜胞外多糖形成的自然侵蚀和退化矩阵。据信剪切力等因素,生物膜的年龄,和培养条件下降会导致这个故障124年,125年,130年,131年]。因此,为了避免错误地分类细菌弱或温和的生物膜前,我们建议检查生物膜的形成在一系列时间点(hours-48 20小时),以确定当大多数生物膜的生成。Biofilm-forming菌株可以划分为“弱”,“温和”或“强劲,”克里斯腾森等人建立的标准。132年]。我们建议选择最好使用“强势”biofilm-forming应变测量细菌素的水平。

最近的一项研究Twomey等人证明了细菌素的潜在抑制生物膜的形成对医疗设备基板,暗示可能的生物医学和制药应用抗菌肽(56]。本研究旨在确定生物工程乳酸链球菌肽衍生品与增强生物活性与野生型相比乳酸链球菌肽对菌株美国epidermidis,以前在医院从患者的血液分离设置。Twomey等人观察到乳酸链球菌肽及其生物工程导数,M17Q,不仅减少了两个强大的形成美国epidermidisbiofilm-forming菌株在塑料微量滴定板表面,而且三个导管的表面材料(橡胶、聚氯乙烯、聚乙烯树脂),以及不锈钢材料,组成一些留置假肢设备(56]。

培养目标菌株时,建议在汤补充1% (w / v) D -(+)葡萄糖,葡萄糖的添加曾被发现提高生物膜的形成56,133年]。一旦生物膜形成和增长板块正在检查,清洗时应小心谨慎或转移液体从井。刮的井吸管提示或使用不必要的力会导致意外删除绑定材料将影响吸光度读数获取和生物膜的形成的整体评估或抑制。当将抗菌肽,我们建议这样做的浓度范围,例如,麦克风,2×麦克风,麦克风(半56,134年]。这将允许生物活性的评估之上和之下的两个麦克风,可以显示一个合适的浓度,可能完全抑制生物膜的形成。最近(merrill Lynch)等人采用这个方法来评估的anti-biofilm-forming功能细菌素capidermicin强烈biofilm-forming应变l . monocytogenes(l . monocytogenes缝隙)[134年]。在浓度2×麦克风,1×麦克风,1/2×麦克风(1×麦克风= 3.75μ米),capidermicin能够导致生物膜的形成显著减少比未经处理的控制。

抗菌素应该调查不仅抑制生物膜形成的能力,去除生物膜,鉴于这样的自然感染(见协议向补充材料)。评估肽清除预先形成生物膜的能力,必须允许biofilm-forming应变文化没有抗菌,直到最大的生物膜增长。孵化后,小心翼翼地把文化和与肽resuspended取代新鲜的,相关的肉汤。孵化的peptide-exposed生物膜18 - 24小时。在相同的背景下生物膜抑制测试中,我们建议肽浓度范围的测试。鉴于难以去除的矩阵,很可能大肽的浓度可能需要使用。(merrill Lynch)等人还测试了细菌素的能力capidermicin去除预先设定的李斯特菌在一个塑料微量滴定板表面生物膜(134年]。利用一系列浓度从1×8×麦克风话筒(1×麦克风= 3.75μ米),(merrill Lynch)等人指出显著减少束缚生物膜比未经处理的控制在五强biofilm-forming菌株(l . monocytogenesCD749、Ts45 F2365、缝隙和OB001102), 24小时后孵化细菌素。相同的传输液体时应小心谨慎,改变文化当分析生物膜的形成,刮掉生物膜通过粗心的移液可能导致不当断言肽可能删除预先形成生物膜的能力。

如上所述,事先建立的生物膜是一个不同的和更困难的任务比生物膜抑制,给出的强烈附着特性矩阵。然而,它已经发现,细菌素肽能够穿透黏液层。尽管他们不能完全去除生物膜,仍然能够产生抗菌肽影响细胞内,减少感染或污染的威胁。

快速比色XTT化验(与化学2,3 -二[2-methyloxy4nitro-5-sulfophenyl] 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide)可用于确定细胞内生物膜的可行性[77年]。颜色变化通过这个试验的结果发现四唑盐XTT被减少,转换,只有发生在可行的细胞。观察到的吸光度与活细胞的数量直接相关。现场等人利用这个测试来确定暴露在细菌素乳酸链球菌肽会导致减少在活细胞内生物膜。在一项研究中调查乳酸链球菌肽肽对生物膜的影响所致葡萄球菌pseudintermedius(影响人类和家畜的病原体),发现乳酸链球菌肽肽可以减少,但不能完全清除的生物膜(77年]。然而,XTT试验表明,生物膜内的可行的细胞孵化与乳酸链球菌肽是未经处理的样品相比显著降低。乳酸链球菌肽的生物工程导数用于这项研究显示增强抗菌作用对biofilm-bound细胞相比,野生型(77年]。

3所示。结论

需要新颖的、有效的和持久的抗菌治疗现在比以往任何时候都更需要考虑到即将到来的危险耐药性感染造成的发病率和死亡率。与他们的力量在低浓度,有针对性的活动,通过生物工程和潜力增强,细菌素在前面跑的抗菌研究[8,24,26,56]。乳酸链球菌肽,为数不多的细菌素目前市场上批准使用,被应用作为防腐剂在食品(11,135年]。不仅展示了其功能抑制致病微生物食品污染的增长但延长货架寿命和提高食品的质量16- - - - - -18,24]。尽管拥有活动与临床相关的病原体,没有批准细菌素药用日期(8,24,69年,77年]。它应该指出动物试验证实了保留生物活性在活的有机体内以及带来的毒性水平低肽(102年,136年]。面对减少抗生素的发现和不断升级的抗感染的情况下,当前形势下,不太可能,所以一些细菌素可供广泛使用,将会持续下去。

在这个手稿,我们总结的方法,可以应用于识别小说细菌素。本文在湿实验室实验中,应该注意在网上方法也被成功地应用于识别假定的细菌素在细菌基因组操纵子。然而,一旦以这种方式已确定操纵子说,湿实验室研究需要净化和肽及其活动的描述。因此,本文所讨论的方法可以支持的研究在网上自然也。

与市场潜力,促进细菌素的发现肽隔离和可靠的方法描述需要开发和共享。然而,并发症和实验因素阻碍生物活性测试过程中还需要确定和讨论。在这一过程中,实验室可以配备健壮的程序将在一个屏幕识别所有细菌素生产商,可以准确地评估环境中肽效价可能会应用到。未能考虑和调整参数,可以抑制肽生物活性,例如,指标选择不当、不良环境源选择、肽和媒体之间的静电相互作用,可能导致贫穷的可视化antimicrobial-producing菌株的活动或完整的监督。作为新型抗菌治疗的需要变得更加可怕,我们希望本文中提供的协议和技巧可以用来克服这些问题和完成的目标发现和描述小说bacteriocin-producing菌株的生物活性。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究的发现。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

艾伦Twomey在收到RISAM明斯特技术大学博士奖学金。作者想向那些工作没有引用的作者道歉这手稿由于空间限制和手稿的具体范围集中在我们自己的实验室经验,细菌素的分离和表征。

补充材料

辅料文档:协议和图表指南细菌素的分离和描述。图S1:为原料延迟对抗试验方法筛选抗菌活性的存在,使用Biorender.com创建。图S2:制备细胞自由上层清液和全细胞提取一夜之间从一个细菌细胞的文化。上层清液和应评估整个细胞提取生物活性,像一些肽可以保持绑定到细胞表面,而不是释放到周围的媒体。如果肽更高度集中在整个细胞中提取或分散在两个分数,从上层清液和完整的细胞中提取肽提取将增加产量在净化过程中,获得了使用Biorender.com。图S3:为原料以及扩散试验检测抗菌活性。的抑制区应变的增长指标表明抗菌活性,使用Biorender.com创建。图S4: agarose-based径向扩散试验检测抗菌活性的存在。区域的覆盖层抑制表明抗菌作用。这个测试可以用来检测样品含有低浓度的生物活性抗菌接受调查。 It can also be used to detect activity against Gram-negative organisms, created using Biorender.com. Figure S5: well diffusion assay to determine protease susceptibility of antimicrobial under investigation. If the antimicrobial is sensitive to proteases, incubation with the enzyme will cause the zone of clearing in the indicator strain growth to be reduced, created using Biorender.com. Figure S6: protease spot test to determine antimicrobial sensitivity to proteolytic enzymes. If the antimicrobial under investigation is sensitive to the protease tested, the zone of clearing will be impacted. A crescent moon shaped zone, rather than a round zone of clearing, will appear in the indicator strain growth, as the antimicrobial in contact with the enzyme will be inactivated, created using Biorender.com. Figure S7: broth microdilution method to detect the minimum inhibitory concentration of an antimicrobial. The minimum inhibitory concentration is defined by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing as “the lowest concentration of the agent that completely inhibits visible growth as judged by the naked eye, disregarding a single colony or a thin haze within the area of the inoculated spot,” created using Biorender.com. Figure S8: growth curve assay to assess the impact the peptide has on bacterial culture growth. Minimum inhibitory concentrations are considered “end point assays” meaning that a singular result is obtained once the test is completed and the reaction has been stopped. Kinetic assays, like growth curves, provide insight into the effects of an antimicrobial on cell growth and death over the duration of the test at multiple time points, created using Biorender.com. Figure S9: kill curve assay. By taking samples of the peptide-exposed culture at different time points, the kill effects of the bacteriocin can be assessed, created using Biorender.com. Figure S10: analysis of biofilm inhibition on plastic surfaces using the stationary microtiter plate method. Supplementing the culture medium with 1% (w/v) D-(+) glucose has previously been found to enhance biofilm production, created using Biorender.com.(补充材料)

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