生物转化的大豆苷、染料木素和柚苷配基链霉菌属物种从尼泊尔高海拔土壤分离

文摘

类黄酮取得了广泛的重要性在制药、食品和化妆品行业。此外,修改这些天然黄酮类化合物通过完整的细胞结构不同的化合物生物转化与增强的生物活动有许多生物技术的应用程序。本研究调查的生物转化潜力链霉菌属物种隔绝high-altitude-soil样本对选定的类黄酮分子。biotransformed代谢物经比较正宗的化合物的高效液相色谱色谱和质/ MS分析。这些隔离,链霉菌属物种G-18(加入数量:MW663767.1)催化异黄酮分子黄素和染料木黄酮在24小时生产羟化产品在一个完整的细胞系统反应的条件。黄素的羟基化(4′,7-dihydroxyisoflavone)被证实在B环的3′-安置生产3′,4′,7-trihydroxyisoflavone。此外,链霉菌属物种G-14(加入数量:MW663770.1)和链霉菌属物种S4L(加入数量:MW663769.1)还透露黄素的变换(4′,7-dihydroxyisoflavone)大豆苷在不同的位置比羟基G-18隔离,而你链霉菌属物种S4L反应混合物与柚苷配基底物还揭示了羟化产品。我们的研究结果表明,微生物分离出不同的生态位有广阔的应用。

1。介绍

链霉菌属革兰氏阳性细菌的生产不同的次生代谢物组;现在许多的商业用作抗生素(1]。多年来,这些微生物进化生态角色涉及改变土动力学、病机、营养耗尽,以及各种非生物和生物压力(2]。产生的次生代谢物链霉菌属为生物提供了竞争优势,以应对变化的环境(3]。基因组分析表明基因参与生物合成次生代谢产物主要是集群及其表达式是由不同的监管酶高度管制。链霉菌属不仅是不同的次生代谢物生产而闻名,但也用作生产大量的外国分子通过各种生化工程过程(4]。

独特的代谢和酶功能的多样性链霉菌属让他们一个健壮的主机的生产多元化的化学成分。链霉菌属将催化各种生物转化反应对类黄酮(5]。大多数的美国将催化的反应包括O N-dealkylations,羟基化、环氧化作用和碳键裂变(6,7]。微生物生物转化提供必要的生产新化合物的前体8]。此外,微生物倾向修改官能团的二次代谢产物,以提高它们的生物活性。大豆苷、大豆异黄酮、羟化了曲霉属真菌oryaze形成6-hydroxydadizein和8-hydroxydaidzein [9]。此外,这种大豆苷在antityrosinase调节力羟化活动的前体化合物相比,大豆苷(10]。因此,识别新的微生物与强劲的潜在转换外国分子科学的兴趣。

类黄酮是一个种类繁多的植物化学物质,是由各种植物物种和发挥重要作用在植物的生长和发展,以及抵御微生物和害虫作为plant-animal战争的手段11]。虽然植物黄酮类化合物的潜在来源,许多这些黄酮类化合物可以通过整个细胞微生物产生的生物转化系统或通过代谢途径工程(12]。有趣的是,类黄酮,并不是由植物可以通过特定的微生物产生的酶改性(13]。许多微生物可以执行一些生化反应如羟基化、甲基化,并通过特定的糖基化酶(14]。此外,使用完整的细胞生物转化系统的优势是,微生物产生生化反应所需的必要的辅助因子。此外,微生物分离出不同的气候和地理条件被证明是有效的生产各种酶催化性能也不同,进而扮演了一个重要的角色在不同的次生代谢产物的生产。因此,本研究的目的是在这样一种方式来评估类黄酮化合物的生物转化大豆苷、染料木素和柚苷配基链霉菌属物种隔绝high-altitude-soil样本。

2。材料和方法

2.1。化学物质

HPLC-grade甲醇、水和乙腈买来费舍尔科学、印度。染料木黄酮(4、5、7-trihydroxyisoflavone),白杨素(5 7-dihydroxyflavone)和芹黄素(4、5、7-trihydroxyflavone),柚苷配基,槲皮素,大豆苷、和3′,4′,7-trihydroxyisoflavone Byung哇金教授提供的是韩国首尔国立大学。

2.2。土样的采集和物种隔离

土壤样品的隔离链霉菌属物种收集从Gosaikunda Langtang国家公园,4380年尼泊尔,masl (28.0820°N, 85.4150°E)。链霉菌属物种隔离在一个ISP2介质与连续稀释法使用无菌撒布机。所有菌株以革兰氏染色时,经济增长模式和菌落形态。

2.3。链霉菌属培养基

孤立的链霉菌属物种培育R2YE中含10.3%蔗糖,葡萄糖1%,1% MgCl₂h·6₂啊,0.025% K₂所以₄,0.5%的酵母提取物,0.01%酪蛋白水解物,0.57%测试,0.005% K₂HPO₄,0.03% CaCl₂h·2₂O, L-proline 0.003%, 2毫升的微量元素的解决方案,5毫升1 N氢氧化钠。微量元素的解决方案包含ZnCl 0.004%₂,0.02% FeCl₃h·6₂啊,0.001% CuCl₂h·2₂啊,0.001% MnCl₂h·4₂O, 0.001% Na₂B₄O₇h·10₂O。

2.4。增长分析

孤立的生长曲线链霉菌属物种(g10 G-14、G-18 S4L)调查了50毫升的增长为96 h R2YE介质,分别接种使用1毫升preculture每个物种的培养液。扶轮的隔离是孵化瓶(250 rpm) 28°C四天。1毫升的文化的一个整除肉汤被撤回在12 h间隔,从0 h - 93 h。细胞群是收获5分钟,每分钟12000转,上层的丢弃。球团用蒸馏水洗净,干在烤箱70°C。干重的细胞质量测量使用称重机,和图形绘制干电池的重量vs。时间。

2.5。完整的细胞生物转化

使用完整的细胞生物转化的类黄酮链霉菌属物种在R2YE介质进行。类黄酮底物分子分别溶解在二甲亚砜,和100毫米的股票每个基质制备的解决方案。链霉菌属物种生长在R2YE介质使用preculture培养液。100年μ米底物分子的大豆苷、染料木素柚苷配基,槲皮素被送入72 h文化的肉汤链霉菌属物种。生物转化反应过程的监控24小时后的反应。代谢物提取使用乙酸乙酯作为提取溶剂。使用真空蒸发器有机层是干。

2.6。分析方法

代谢产物的高效液相色谱分析(lc - 2030日本岛津公司,日本京都)配有紫外检测器和C18柱(4.6×150毫米,5μ米颗粒大小)。溶剂的流量是1.0 mL / min,注入体积是10μl分析使用的流动相乙腈(CH₃组织CN):水(0.1%)= 3:7 (v / v)。在254 nm紫外线检测进行。安捷伦的质谱进行射流电喷雾电离源(五角ESI)在一份扫描和正极性模式。乙腈和水甲酸0.1%的比例3:7在运行使用。流量为0.5毫升/分钟。列温度是30°C,注入体积是2μl

3所示。结果

3.1。生长曲线的分析链霉菌属物种

黄酮类化合物的生物转化之前,孤立的增长模式链霉菌属物种被评估。这些隔离g10、G-14 G-18, S4L生长在96 h R2YE介质的28°C。的链霉菌属物种指数级的增长直到68小时在R2YE介质(图1)。最高生物量干重(毫克/毫升)记录的孵化20 h 48 h的时期,它揭示了指数增长阶段。然而,从48小时开始,经济增长停滞不前,没有观察到显著增加生物量。在分析链霉菌属物种,最高的增长是观察链霉菌属物种G-18,紧随其后链霉菌属十国集团的物种。

3.2。黄酮类化合物的生物转化

整个细胞生物转化反应与孤立链霉菌属物种进行了与类黄酮底物分子。分析反应产物进行了HPLC配有紫外检测器。初步分析表明,在几类黄酮分子生物转化潜力的筛查链霉菌属物种,G-18和G14显示biotransformed产品向黄素作为衬底。此外,G-18还透露对染料木素的生物转化产品,而S4L显示生物转化潜力对柚苷配基作为衬底。然而,所有其他评价基质并没有透露任何产品形成初步调查(表1)。

进一步证实反应的代谢产物是由高效液相色谱色谱的比较正宗的化合物。底物和反应产品显然是分离。大豆苷的反应产物是完全匹配的真实7日3′,4′-trihydroxyisoflavone。因此,大豆苷生物转化链霉菌属物种G-18在3′-安置(图2(一个)),而链霉菌属物种S4L G-14转变产品峰,这可能是由于大豆苷在6 -羟基化和8-position(见补充数据(可用在这里)),而与染料木黄酮,产品峰值是不同于染料木素,作为高效液相色谱的比较观察到真正的染料木黄酮,反应的产物链霉菌属物种G-18,控制只链霉菌属物种G-18没有衬底(图2 (b))。此外,反应的产物链霉菌属物种S4L显示不同的产品山峰柚苷配基的衬底相比控制反应的高效液相色谱(图2 (c))。产品识别和表征生物转化产品进行质谱分析。孤立的物种的生物转化的示意图表示如图3。

3.3。质谱分析的代谢物

生物转化的进一步确认产品是由质谱分析。的反应混合物链霉菌属sp。G18大豆苷显示两个不同的山峰女士[M + H]⁺= 254.9对应黄素和[M + H]⁺= 270.9的产品。由16个单位分子质量的增加是由于大豆苷羟基集团之一。基于比较高效液相色谱色谱与真实的3′,7日,4′-trihydroxyisoflavone和质谱进一步分析,我们证实大豆苷biotransformed链霉菌属物种G-18 3′-安置(图4)。

此外,染料木黄酮生物转化链霉菌属物种G-18被质谱证实。女士光谱染料木黄酮[M + H]⁺= 270.9和羟化染料木黄酮[M + H]⁺= 286.8揭示了由16个单位质量的增加反应代谢物,hydroxygenistein(图5)。基于光谱女士,我们推测,染料木素必须在3′-安置羟化,而链霉菌属物种S4L代谢柚苷配基(米/z= 272)羟化柚苷配基(米/z= 288),明显的由16个单位产品增加峰值相比,柚苷配基(图6)。

4所示。讨论

大豆异黄酮是天然的植物化学物质与多样化的健康相关联(15]。此外,他们是biotransformed通过氧化和还原反应在不同微生物,显著提高了生物活性相比原始基质(16]。最近,食品、化妆品,营养食品行业有兴趣的功能衍生品黄酮和异黄酮。因此,世界各地的科学家们正试图了解生产有价值的生物活性化合物的生物合成途径使用完整的细胞或酶生物转化。江崎等人报道曲霉属真菌saitoi从发酵食品显示有倾向产生8-ortho hydroxydaidzein和8-ortho hydroxygenistein [17]。从那时起,微生物全细胞/酶生物转化的可能性出现了。Komiyama等人也报告了羟基化的大豆异黄酮产品链霉菌属物种哦- 1094 (18]。此外,桑德拉等人报道了真菌菌株,即白僵菌278年,Absidia glauca我177,Absidia coerulea是93年,有能力黄素的糖基化,染料木素,biochanin [19]。

虽然植物黄酮类化合物的来源,提取和纯化不符合工业要求。此外,许多违背自然的类黄酮分子可以使用微生物生产主机。蔡等人报道,O-methyltransferase链霉菌属avermitilis参与生产4′,7-dihydroxy-3′-methoxyisoflavone,违背自然的化合物(20.]。因此,微生物生产biotransformed使用完整的细胞或酶分子是选择。最近基因工程的发展已经使人们有可能操纵基因和工程师高效生产的主机微生物以及强迫的isoflavonoids微生物宿主。在已知的微生物宿主,链霉菌属已经被证明是一个有效的主机不同化合物的生产。生产次生代谢产物的生物合成基因簇链霉菌属sp.涉及许多酶,这可能是有效的生物转化的不同分子。此外,代数余子式如NADH和/或NADPH所需的酶改性类黄酮分子从内部产生的微生物宿主(21]。据报道,细胞色素p450酶的过度表达与它的氧化还原伙伴CYP105D7 FdxH FprD美国avermitilis主机可以产生112.5毫克的7、3′,4′-trihydroxyisoflavone [22,23]。

尽管巨大的努力在过去的生产大豆苷使用整个微生物细胞或酶反应,ortho-hydroxylated ortho-dihyroxyisoflavone的工业化生产(ODI)仍然是一个巨大的挑战。黄酮类化合物的生物转化和isoflavonoids由微生物的溶解度很低,也阻碍了底物分子在水溶液中。此外,ortho-dihydroxylated代谢物undergoe加双氧酶酶迅速降解。因此,筛选的微生物从不同的环境以及蛋白质工程方法可以克服这种局限性。在我们的调查,链霉菌属物种G-18透露黄素和染料木黄酮羟化产品。黄素是羟化3′-安置,确认通过比较真实的化合物的高效液相色谱和质谱分析。此外,S4L也G-14羟化大豆苷在不同位置比G-18证实通过比较高效液相色谱色谱。这清楚地表明,大豆苷生物转化酶参与这些菌株和高度特定选择的不同。然而,大豆苷的生物转化hydroxydaidzein S4L染色和G-14很低净化产品结构说明。基于高效液相色谱色谱图中的位置,我们推测,6 -羟基化发生,8-position S4L和G-14黄素的压力。另一方面,应变S4L还透露对柚苷配基的生物转化潜力。质谱分析显示16个单位质量的增加;因此,该产品是羟化柚苷配基。柚苷配基的羟化产物可能圣草酚; as reported in cases of microbial biotransformation, the product of naringenin is eriodictyol [24]。进一步优化反应的产品可能会增加这些羟化代谢产物的生产,这使使用核磁共振结构识别。

5。结论

链霉菌属的物种是众所周知的生产不同的次生代谢物和被证明是有效的主机生产不同的化合物。然而,链霉菌属物种隔绝high-altitude-soil样本并没有探索对类黄酮生物转化潜力。高海拔寒冷的环境可能是独特的生物多样性的来源。在目前的研究中,我们已经成功地证明了链霉菌属物种从high-altitude-soil分离样品的生物转化是有效的大豆苷(4′,7-dihydroxyisoflavone) 3′, 4′, 7-trihydroxyisoflavone和染料木黄酮(4′,5、7-trihydroxyisoflavone) hydroxygenistein。此外,孤立的物种也揭示了生物转化潜在hydroxynaringenin柚苷配基。此外,识别特定的酶从孤立的物种以及主机工程的高效生产羟化isoflavonoid和类黄酮分子有着巨大的工业的重要性。此外,我们的结果打开搜索的未来可能性的一种新型生物催化剂不同的生态位。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

伦理批准收集土壤样本的Gosaikunda区域Langtang国家公园,尼泊尔,来自美国国家公园和野生动物保护,Babarmahal,加德满都,尼泊尔,推荐信的eco - 102 - 1503 077/78。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

BPP设计工作。LS, BPP, SPP所有实验室工作。公司KPR党卫军,BPP进行分析分析。BPM和地基处理技术工作的协助。BPP写的手稿。

确认

这项研究受到了格兰特大学拨款委员会的支持下,尼泊尔(奖。德意志联邦共和国科技′′′73/74 10)。作者感谢教授Byung哇金,首尔国立大学,韩国,提供正宗的黄酮类化合物进行分析。

补充材料

补充图S1:高效液相色谱色谱的生物转化链霉菌属sp。G-14黄素。(我)链霉菌属sp。G-14黄素作为衬底,大豆苷,(2)和(3)链霉菌属sp。G-14没有大豆苷粗提物。补充图S2:高效液相色谱色谱与daidzien S4L的生物转化。(我)链霉菌属sp。S4L黄素作为衬底,大豆苷,(2)和(3)链霉菌属sp。S4L没有大豆苷粗提物。补充图S3:槲皮素的生物转化的高效液相色谱色谱,(我)链霉菌属sp。G-14与槲皮素、槲皮素(ii), (3)链霉菌属Sp。G-14没有槲皮素粗提物。(补充材料)

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