文摘
鲍曼不动杆菌(一个。baumannii)开发了几种耐药机制。细菌已被报告为多个爆发的起源。本研究旨在探讨使用射流泵和喹诺酮resistance-associated基因型突变机制的抵抗一个。baumannii在三级医院隔离。总数103人一个。baumannii隔离进行了鉴定和药敏测试后VITEK2 PCR扩增的紧随其后blaOXA-51。常规PCR扩增AdeABC外排泵(adeB,面,阿德)和喹诺酮(帕洛阿尔托研究中心和gyrA)抗性基因进行,其次是定量实时PCR AdeABC外排泵基因。射流泵表达的表型评价是由确定的麦克风之间的区别tigecycline之前和之后外排泵抑制剂。桑格测序方法用于序列帕洛阿尔托研究中心和gyrA扩增子。系统发育树是使用大型4.0评价菌株的亲缘进化。所有收集到的隔离blaOXA-51艾滋病患者。高电阻几乎所有的测试观察抗生素。射流泵被发现在75%的隔离机制的阻力。这项研究发现帕洛阿尔托研究中心在60%和基因突变gyrA基因突变在85%,而37%的隔离在两个基因突变。最小的进化距离隔离。AdeABC外排泵系统的使用积极的抵抗机制结合主要在点突变gyrA被证明有助于拓宽的阻力一个。baumannii隔离。
1。背景
鲍曼不动杆菌(一个。baumannii)是一个医院的高水平的耐抗生素病原体展品(1,2]。这主要负责感染革兰阴性球杆菌细菌在重症监护病房(3,4]。细菌引起肺炎、菌血症、败血症(5)、脑膜炎(6),和尿路感染7)经常出现在患者接受侵入性治疗,如尿导管、气管插管,和那些有潜在条件(2]。一个。baumannii展示了几种抗菌素耐药性机制(8- - - - - -10)对抗生素如氨基糖甙类、碳青霉烯氟喹诺酮类原料药、头孢菌素、四环素、sulbactams,利福平9),以及粘菌素(11- - - - - -13]和tigecycline [8,14最后),所谓的药物用于治疗感染[8,11- - - - - -14]。此外,文献报道最近开发的抗生素如eravacycline阻力(15]和cefiderocol [16]。细菌耐药机制也收购了数家房贷公司通过移动遗传元素(17,18),也显示出自然抵抗一些抗生素包括aminopenicillins,第一和第二代头孢菌素,aztreonam,厄他培南,磷霉素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶19)导致出现耐多药和pandrug-resistant菌株(8,9]。表达的主要机制一个。baumannii逃避抗生素攻击antibiotic-hydrolysing酶的生产,可怜的膜渗透,渗透缺陷,改变目标网站或细胞功能和活跃的射流泵20.]。
射流泵的主要介质耐药机制对许多抗生素类(21]。通过这种机制,避免细菌在目标站点上积累的药物,从而减少对抗生素的敏感性(17,21]。三个resistance-nodulation-cells部门编码一个。baumannii据报道,基因组导致抗生素耐药性一个。baumannii临床分离株22]。射流泵的过度表达一个。baumannii已经增加抵抗抗生素如tigecycline [14,23),碳青霉烯(24),二甲胺四环素,庆大霉素,强力霉素,四环素25]。几个研究人员支持,resistance-nodulation-cell部门总科中,磷酸腺苷盒式的不利影响(AdeABC)是最与耐药性有关一个。baumannii(26,27]。系统一般包括三个部分:耐多药转运体adeB捕获抗生素的内部膜磷脂双分子层或细胞质膜融合蛋白adeA作为膜融合蛋白,最后,外膜蛋白质adeC是一种膜通道蛋白,所使用的adeB运输的基板(26]。这个机制是受阿德和面双组分系统(26,27]。这个系统显示的工作机制adeB和监管基因阿德和面是主要的角色球员在AdeABC射流泵系统(28]。这种机制的阻力的敏感性降低一个。baumannii多个类抗生素(23,28- - - - - -30.),据报道与[新开发药物的耐药性有关30.]。
变更的目标站点或细胞功能由于突变使得内抗生素耐药性的出现一个。baumannii物种(15,31日]。使用这种机制的阻力一个。baumannii抵制氟喹诺酮类原料药(32],粘菌素[33小说),合成beta-lactamase ceftazidime-avibactam [34),和一些新开发的抗生素(35]。尽管文献报告质粒介导的喹诺酮抗性基因qnrA,qnrB,qnrS的耐药机制,以减少对喹诺酮类(36,37),一个。baumannii主要是耐喹诺酮通过染色体基因突变帕洛阿尔托研究中心和gyrA(38,39和其他的分子机制37]。单一突变的文献支持gyrA诱导一种氨基酸改变丝氨酸在83位置亮氨酸(丝氨酸83)减少的易感性。baumannii临床分离株对氟喹诺酮类原料药(40]。两个突变帕洛阿尔托研究中心80年位置(丝氨酸80)和84年(glu - 84)诱导改变丝氨酸异亮氨酸和缬氨酸谷氨酸,分别导致耐氟喹诺酮类原料药(40]。
活动使用的综合效应的射流泵和变更的目标站点由于基因突变导致扩大的阻力一个。baumannii压力和带来严重的临床医生在治疗挑战建立有效的治疗方案。多的爆发一个。baumannii感染已被观察到在全球范围内增加[抗菌药物的耐药性41,42]。在这项研究中,我们专注于使用AdeABC射流泵,帕洛阿尔托研究中心和gyrA突变,导致减少一个。baumannii在一个学术医院临床分离株对抗生素敏感性在比勒陀利亚。目的是研究射流泵的使用和喹诺酮resistance-associated基因耐药的崛起一个。baumannii菌株。
2。材料和方法
2.1。研究设计,设置,和样品收集
隔离在这项研究中收集2018年2月到2020年2月在乔治博士Mukhari三级实验室(DGMTL),一个单位的南非国家卫生实验室服务(科)。DGMTL是三级临床实验室常规实验室诊断病人的医生乔治Mukhari学术医院(DGMAH),和3区周围医院和诊所。DGMTL加上微生物病理学系的Sefako Makgatho健康科学大学(SMU)。伦理批准开展这项研究被授予Sefako Makgatho健康科学大学研究伦理委员会(SMUREC)。总数103人一个。baumannii从DGMTL分离收集,储存在−70o直到使用C。
2.2。分离鉴定和药敏资料
收集隔离使用表型和基因型的方法,确定了VITEK2自动化系统(bioMerieux、法国)和聚合酶链反应(PCR)扩增blaOXA-51基因。
药敏测试都使用了VITEK2自动化系统(bioMerieux、法国)。哌拉西林+ tazobactam (ptz)、头孢他啶(caz),头孢吡肟(聚全氟乙丙烯)、磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶(sxt)、庆大霉素(cn10)、环丙沙星(cip)、头孢噻肟(ctx), imipenem (imp) meropenem (mem)和tigecycline (tig)进行了测试。
2.3。耐药机制的分子调查
2.3.1。复苏的隔离和核酸提取
复苏的新鲜纯殖民地Muller-Hinton (MH)琼脂(诊断媒体产品、DMP,南非)进行的小额贷款银行仍是非盈利(的小额贷款银行仍是非盈利的™加拿大ProLab诊断Inc .)无菌环境。一个纯粹的殖民地被用于DNA和RNA提取。DNA提取使用沸腾的方法(43];短暂,铂环量新鲜纯殖民地于1000年暂停了µL的盐水(SABAX倒盐0.9%,爱德考克英格拉姆急救护理(企业)有限公司,南非)在一个埃普多夫管(股份公司、汉堡、德国)其次是孵化(Memmert孵化器IN30、德国)20分钟37°C±2。暂停使用涡被删除和动摇(涡、Heidolph Reax,德国)全速20年代。此后,暂停离心机(颂歌Nr Mikro 20日。Bajahr E亲属,Hettich Zentrifugen,德国)5分钟在130×100每分钟旋转(RPM)。上层清液被除去,resuspended在200年µL PCR年级水(BioConcept有限公司、瑞士)的埃普多夫管(股份公司、德国汉堡)。暂停然后穿上全能料理机(埃普多夫,全能料理机紧凑,默克公司默克化工有限公司(企业),南非)在90°C 10 mn 700 RPM。此后,穿上细胞粉碎机(粉碎机的精灵®、科学工业硅™,美国)10分钟。最后,悬挂离心机(颂歌Nr Mikro 20日。Bajahr E亲属,Hettich Zentrifugen,德国)10分钟130×100 RPM。包含DNA的上层清液传输,保存在无菌埃普多夫管(股份公司、德国汉堡)和存储在−20°C。
使用商业RNA RNA提取进行了隔离设备(隔离II RNA迷你工具,MagMAX™病毒/病原体,bioline,英国伦敦)制造商的指令后44]。提取RNA是量化使用分光光度计(NanoDrop Lite分光光度计、NanoDrop产品、热科学、美国)和规范化为1μ克/μl获得RNA是储存在−80°C。互补DNA(互补)合成了使用互补脱氧核糖核酸合成装备(SensiFAST cDNA合成混合反应的指导方针,Bioline子午线生命科学®英国公司)后,制造商的指示。互补脱氧核糖核酸产品储存在−20°C,直到进一步的使用。
2.3.2。常规PCR扩增AdeABC射流泵(adeB,面,阿德)和喹诺酮(帕洛阿尔托研究中心和gyrA)抗性基因
基因扩增常规PCR进行使用2 x MyTaq HS红色混合(MyTaq HS红色混合,子午线生物科学、bioline,英国)来检测基因的兴趣一个。baumannii。Bioline协议(45之后准备多重PCR (M-PCR)化验使用类似的熔化温度和monoplex PCR引物(M-PCR)引物不同的退火温度。为了避免错误在凝胶电泳检测扩增子的时候,AdeABC外排泵系统相关基因adeB和面这只相差3核苷酸碱基对是分开了。M-PCR运行基因面和阿德和m-PCR基因adeB。进行PCR反应混合物的总容积为25μL,组成如下:12.5μL 2 x MyTaq HS红混合(MyTaq HS红色混合,子午线生物科学、Bioline,英国),0.5μ每个引物L和6.5μL PCR年级水(BioConcept有限公司、瑞士)被添加到20μL, 5μL的DNA模板添加到构成25μL反应混合。正面和负面的控制运行PCR thermocycler (GeneAmp落空®PCR系统2700,应用生物系统公司、新加坡)。常规PCR和引物的热循环条件用于检测药物resistance-associated基因详细补充2。
2.3.3。PCR扩增子检测
PCR扩增子的检测是在1%的琼脂糖凝胶进行与溴化乙锭染色。
2.3.4。实时定量PCR(存在)放大AdeABC射流泵(adeB,面,阿德)
互补脱氧核糖核酸检测的存在是信使rna的存在,使用SYBR No-ROX工具包(SensiFAST™SYBR®NO-ROX装备,子午线生物科学、英国Bioline) Sacace实时PCR仪(sacycler - 96、实时PCR系统Sacace生物技术Srl, Scalabrini,意大利)。中存在的反应混合物制备的卷20μL组成4μL (cDNA、10μL SYBR, 0.8μ每个引物L和4.4μL PCR年级水(BioConcept有限公司、瑞士)。使用的热循环条件和引物在补充详细1和2,分别。
2.4。表型评价AdeABC射流泵adeB,面,阿德基因表达
功能性AdeABC流出系统评估评估之间的差异最小抑制浓度(麦克风)tigecycline (TGC)使用梯度扩散法(tigecycline麦克风测试地带,Liofilchem®Srl, 09 d 'Abruzzi、意大利)之前和之后暴露在外排泵抑制剂(EPI)羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone (CCCP) (Sigma-Aldrich,多塞特郡,英国)46]。简单地说,挺了两种MH琼脂板在100年的最终浓度µ克/毫升。一夜之间从一个全新的文化一个。baumannii0.5 Mac Farhland浑浊的样本(Densichek, BioMerieux Densichek加上,美国)。一个拖把被用来传播一个。baumannii每个琼脂板上,其次是放置0.016 -256 mg / L TGC E-strip测试中每个琼脂板其次是通宵孵化37°C。E。杆菌写明ATCC 85218被用作控制应变。
2.5。测序的喹诺酮Resistance-Associated基因(帕洛阿尔托研究中心和gyrA)
桑格测序方法(ABI3500XL;美国应用Biosymptoms) Inqaba研究(比勒陀利亚)用于序列帕洛阿尔托研究中心和gyrA扩增子。序列编辑使用ChromasPro软件(版本2.0),然后从基因库对齐与野生型序列使用BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html)。丝氨酸的83gyrA基因和丝氨酸的80年和84年丝氨酸帕洛阿尔托研究中心基因突变进行了调查。系统发育树是利用分子进化遗传分析(兆)4.0 (47]评价亲缘进化研究的菌株。
2.6。统计分析
数据捕获的微软专业Excel 2016和IBM SPSS数据分析进行统计26 (IBM®SPSS统计®version 26.0, 2019)。一个≤0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。分离鉴定和药敏资料
所有一个。baumannii隔离被VITEK2 pcr阳性了blaOXA-51。收集到的隔离的抗生素敏感性测试10商用抗生素。研究分离株耐头孢噻肟89%和85%耐头孢他啶和头孢吡肟(图1)。该菌对哌拉西林+ 76% tazobactam,青霉素和beta-lactamase抑制剂(图的组合1)。百分之八十三(83%)的隔离是抵抗imipenem和meropenem(图1),而耐庆大霉素、功效和环丙沙星为81%,82%,和83%,分别为(图1)。抗生素敏感性测试tigecycline显示87%的隔离是敏感的,而3%的证明(图中间易感性1)。
3.2。活跃的分子和表型评价AdeABC射流泵系统抗性机制
积极AdeABC外排泵系统的评价机制的阻力进行了使用遗传和表型测试目标的组合adeB,阿德,面基因。积极的PCR和目标基因的存在表明,感兴趣的基因存在,积极生产相关的蛋白质。表型评价证实了射流泵系统的实际使用作为抵抗机制在表型水平。
积极的目标基因的PCR扩增是100%adeB和99%,阿德和面基因(表1;补充3)。存在100%的阳性adeB、99%和98.1%阿德和面,分别。共有100个分离株(97%)为PCR阳性和目标存在adeB,阿德,面基因。在100年的分离,75%的这些表型上隔离了活跃的使用射流泵作为耐药机制(表1;补充3)和25%没有任何表型水平射流泵参与tigecycline阻力。25%的没有展示表型表达的射流泵使用,88%(隔离)22日完成所需的主动外排泵基因(表1;补充3)。有一个显著的积极传统PCR和存在放大结构之间的联系adeB和监管阿德基因与主动外排泵的表型表达(值< 0.05)。
3.3。调查的点突变帕洛阿尔托研究中心和gyrA
的点突变帕洛阿尔托研究中心和gyrA桑格测序后进行了PCR基因产品。所有的研究隔离(100%)pcr阳性gyrA和99%的阳性帕洛阿尔托研究中心(表2;图2;补充4),而2样品失败的质量控制gyrA桑格测序和不能被测序。的序列分析gyrA显示,89%的83年丝氨酸隔离显示点突变诱导氨基酸的变化从丝氨酸亮氨酸(表2;图3;补充411%),而没有这种突变。所有的隔离(100%)-丝氨酸84点突变帕洛阿尔托研究中心基因;在丝氨酸80年,39%的分离有一个点突变导致氨基酸的变化从丝氨酸亮氨酸。这个点突变不是观察到61%的分离序列进行分析(表2;图3;补充4)。两个基因序列的分析显示,36%(37隔离)都点突变。丝氨酸为83gyrA80年,丝氨酸帕洛阿尔托研究中心和10个隔离没有任何的突变(表2;补充4)。
(一)
(b)
(一)
(b)
突变的发生在隔离收集随时间增加了。在2017年,帕洛阿尔托研究中心突变在收集隔离是5%(1/22),36%(14/32),2018年,60%(25/42)2020年(表2;图3;补充4)。gyrA突变分离显示一个类似的趋势,86%(19/22),95%(37/39),85%(34/40),2017年,2018年和2020年,分别为(表2;图3;补充4)。
4所示。讨论
鲍曼不动杆菌增加抵抗抗生素可用的频谱是公共卫生关注的1]。类似于之前的研究,PCR扩增blaOXA-51基因被用作基因型的鉴定和验证方法一个。baumannii株之前被VITEK2 (bioMerieux、法国)49- - - - - -51]。尽管据报道在文学的一个。baumannii菌株没有港口blaOXA-51(53),物种的基因据报道内在几位作者49- - - - - -51,53]。的使用blaOXA-51被推荐为一个简单而可靠的识别方法一个。baumannii压力(49- - - - - -51]。
本研究结果揭示了高阻的大部分可用抗生素的临床医生使用的管理一个。baumannii感染(85% 85% 89%头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林+ tazobactam 76%, imipenem 83%, meropenem 83%,环丙沙星83%,庆大霉素81%,甲氧苄氨嘧啶和82%)(图1)。研究结果类似于一些报告由不同区域内的人员(54- - - - - -56和全球58]。在他们发表的报告的奥利弗·雷金纳德在南非的东开普省路边酒馆,Anane et al。55)强调,一个。baumannii菌株显示电阻率高于80%相同的抗生素在当前研究中进行测试。同样,劳et al。57)起两地区在南非豪登省报道盛行的阻力(69 - 90%)一个。baumannii菌株相同的抗生素在当前的研究中进行测试。
越来越多的隔离与中间易感性tigecycline(3%)的关注(图1)。加薪的最后抵抗抗生素一个。baumannii表明,很快将没有抗生素对局部循环的有效抗菌行动一个。baumannii。这份报告是另一个电话支持谨慎的处方和使用抗生素依照当地和国际准则(59)和压力需要开发新的抗菌替代对这种细菌。
AdeABC外排泵系统的评价机制使用的阻力一个。baumannii菌株在DGMTL显示高患病率的孤立adeB(100%),阿德(99%)和面(99%)。这是在协议与其他研究,报道了AdeABC射流泵系统作为最普遍和检出率最高的临床分离株相比其他外排泵基因(26]。这可能是解释的射流泵蛋白的生理作用的细菌细胞膜调节物质的运动细胞从内部到外部环境(60]。然而,高患病率的AdeABC射流泵在临床分离细菌可能解释为泵的参与在推动抵抗抗生素所假设的Ranjbar和他的同事们(61年]。在中国进行的一项研究表明,AdeABC射流泵负责耐多药的增加一个。baumannii菌株在儿科重症监护病房(42]。类似的研究结果报道在伊拉克AdeABC射流泵系统普遍在临床分离株的96%一个。baumannii(61年]。Mahmoudi et al。62年)还提到AdeABC射流泵系统在超过90%的基因存在一个。baumannii临床分离株在他们的研究。积极的统计协会的结构adeB和监管阿德基因也可能被解释成分子的结构组织AdeABC操纵子体系的监管阿德。的阿德基因已被确认为一种识别响应因子,作为转录激活因子的影响下面(26]。然而,探索之间的交互阿德和adeABCChang et al。63年)报道,阿德可以独立的行动面的影响力。他们的研究显示,阿德基因可能被激活的结果一个氨基酸替换重复主题之间的地区阿德和adeABC导致adeABC超表达,增加耐抗生素的行动。的完整理解AdeABC射流泵系统和监管工作机制仍然是有限的。尽管还需要更多的研究去探索这个机制的监管阻力,这份报告由常倾向于支持这一发现et al。63年),即,尽管存在面;一些AdeABC射流泵系统研究中隔离没有演示表型耐tigecycline(表1;补充3)。本研究数据显示,97%(100/103)的隔离所需的一组基因(adeB,阿德,面)的主动外排泵(表表达式1;补充3)。这些隔离,75%(75/100)展示了一个活跃的使用AdeABC外排泵机制的阻力,而25%(25/100)没有展示在表型水平表达AdeABC射流泵作为一种机制的阻力。文献支持,不仅仅是AdeABC面前流出pump-associated基因突变引发的但是他们的超表达诱导抵抗抗生素(15,63年,64年]。此外,它是记录一个。baumannii可以使用其他流出pump-associated基因(14,65年和总科22)开发一种多药耐药性概要文件。此外,研究人员报道,AdeABC射流泵的需要,在某些情况下,与其他耐药机制协同行动表达一定程度的抵抗特定抗生素类(67年]。所有这些可以解释22/25的表型结果隔离的研究没有证明AdeABC外排泵的使用积极的抵抗机制,而所需的一组基因是存在的,和他们的信使rna。
喹诺酮resistance-determining区域上特定区域gyrA和帕洛阿尔托研究中心氨基酸突变基因代码一个。baumannii它能够抵抗喹诺酮类(38,39]。这些喹诺酮resistance-determining地区发现密码子80(丝氨酸80)和84 (glu - 84)帕洛阿尔托研究中心基因密码子83(丝氨酸83)gyrA基因(40]。在这项研究中,所有的临床分离株(100%)PCR阳性gyrA和99%的阳性帕洛阿尔托研究中心(表2;图3;补充4)。的测序分析gyrA显示,89%的隔离显示83年丝氨酸点突变,突变对丝氨酸80 39.2%,没有隔离展品突变glu - 84帕洛阿尔托研究中心放大的基因。几项研究报告了类似的结果表明氨基酸替换gyrA和帕洛阿尔托研究中心基因与耐喹诺酮有关一个。baumannii(67年,68年]。分离菌株的表型敏感性测试一个。baumannii耐环丙沙星(83%)与氟喹诺酮类resistance-associated基因序列分析在这项研究调查。然而,众所周知,其他氨基酸替换gyrA诱导一个。baumannii耐喹诺酮。一项研究报道在丝氨酸81喹诺酮抗性突变gyrA基因诱导改变丝氨酸亮氨酸(31日]。隔离显示从81年甘氨酸突变缬氨酸和丙氨酸84 -脯氨酸gyrA基因也被报道为耐喹诺酮一个。baumannii(69年,70年]。37岁的所有研究的隔离在两个基因突变,而没有任何突变(表102;图4;补充4)。突变的存在gyrA和帕洛阿尔托研究中心基因导致更高层次的环丙沙星阻力而不是一个突变gyrA或帕洛阿尔托研究中心李和他的同事报道基因(72年]。当前研究的结果支持李的报告等。72年]。基因突变的37隔离在两个显示更高水平阻力tigecycline比10隔离,没有任何(表2;补充4)。这些结果表明,单引号或双突变帕洛阿尔托研究中心和/或gyrA及其伴随的存在与否两个基因影响的程度对抗生素的耐药性。
(一)
(b)
隔离的系统发育关系研究使用neighbour-joining方法(48在大型4.0(数字4(一)和4 (b))。分析显示非常小的进化之间的距离从DGMAH隔离。这个观察是最有可能因为基因的性质;帕洛阿尔托研究中心和gyrA管家基因非常必不可少的复制,从而高度保守的。
本研究中也观察到突变一个。baumannii隔离慢慢增加,从2017年到2020年,这意味着隔离在DGMAH越来越成为抵抗药物用于治疗他们。其他研究显示在阻力逐渐增加医疗机构(57,73年,74年]。
5。结论
隔离的一个。baumannii在DGMAH发病率高电阻可用抗生素。AdeABC外排泵系统的使用积极的抵抗机制结合主要在点突变gyrA有助于拓宽的阻力一个。baumannii在DGMAH隔离。这种情况尤其令人担忧,因为当地分离株证明tigecycline阻力的增加。司法支持使用抗菌素药敏结果应制定控制耐药性的崛起一个。baumannii菌株。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果中包括补充材料。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
补充材料
补充1。寡核苷酸序列PCR。补充2。热循环条件和积极控制菌株用于目标基因的聚合酶链反应扩增。补充3。分子和表型调查的主动外排泵机制的阻力。补充4。突变的分子调查帕洛阿尔托研究中心和gyrA喹诺酮耐药机制。(补充材料)