文摘
石油是这个日期,一个独特的不可再生能源资源。石油泄漏,出现在运输、存储、和精炼,是最重要的环境污染物,它产生伤害周围的生态系统。生物修复是一种有效的方法用于治疗石油hydrocarbon-contaminated利用土著微生物土壤。各种碳氢化合物的降解特征(正己烷、苯、汽油、柴油)定性和定量调查使用芽孢杆菌隔离。微生物和生化方法已经使用包括隔离oil-degrading细菌酶的活动,物理化学参数的确定,生物表面活性剂的生产和提取分析、驱油试验,生物表面活性剂的抗菌试验,和生物降解动力学。因此,60的隔离能力快速降解不同的碳氢化合物,34被怀疑芽孢杆菌隔离能够在24小时或48小时在黑洞中补充2%的正己烷、苯、汽油、柴油、分别和橄榄油。34隔离中,61%(21/34)有能力生产biosurfactant-like分子通过使用汽油、柴油70%(24/34),与己烷85%(29/34),82%(28/34)和苯。发现堆肥隔离与盐酸可榨出的(100%)、硫酸铵(95%)、氯仿(95%)和乙醇(100%)。生物表面活性剂显示稳定在20°C, 37°C, 40°C, 60°C。生物表面活性剂分泌芽孢杆菌菌株的拮抗效应埃希氏杆菌属杆菌、弗氏志贺菌5 M90T,蜡样芽胞杆菌。选择隔离因此可以安全地用于生物降解。基质降解模式由各个隔离被发现显著不同。研究表明,苯降解快,其次是己烷、汽油、柴油。的芽孢杆菌财团使用可以减少碳氢化合物含量从195年到112年在15天(g / kg)。
1。介绍
行业的频率已经利用地球的自然资源使一个巨大的对地球的自然平衡的影响。不同的商业产品,如柴油、汽油、己烷、和benzene-like分子会造成土壤污染1]。土壤污染的有机碳氢化合物是环境问题的主要原因之一,在世界各地,因为它们广泛分布、持久性、复杂的成分,和毒性,导致他们在环境中累积浓度可能影响生物。物理、化学和生物技术已被使用多年来修复土壤污染的有机污染物(2]。大量的物理和化学方法用于场地修复被污染的土壤(1]。然而,这些技术是昂贵的,并可能导致不完全分解污染物的3]。最好的方法之一是不同技术之间的生物修复土壤和地下水的清理2]。它是一个环保的策略和主要是通过自然调节土壤微生物群落。生物降解的有机废物已成为一个日益重要的废物处理方法与主要优势包括便宜的设备,环境友好的过程,简单。某些微生物,主要是细菌,进化代谢这些污染物通过使用它们作为营养和/或能源(4]。生物修复的效率取决于适当的微生物的存在,也受环境条件和微生物群落组成的影响。污染土壤的生物修复可以有效地通过使用堆肥微生物(5- - - - - -8]。生物表面活性剂在工业生物表面活性的分子与多个应用程序(3,9- - - - - -11]。他们由两个不同的部分,因为他们是两亲性化合物,具有亲水极性一半和非极性疏水集团。这些属性使他们减少表面和界面张力,从而增加的表面积非混相阶段,增加流动性,生物利用度,和随后的生物降解12- - - - - -14]。他们是天然表面活性剂,它们的化学版本相比有很多优势。他们是环保,可降解,毒性和廉价,分钟。细菌属于属芽孢杆菌已报告生产各种类型的生物表面活性剂(4,5,10,11,15- - - - - -18]。属芽孢杆菌包括各种各样的物种,显示相当大的生物表面活性剂的生产和生产循环lipopeptides和脂蛋白,包括surfactins fengycin, lichenysin, bacillomycin生物表面活性剂的主要类型19,20.]。因此,应该进一步利用微生物表面活性剂的应用前景。
刚果共和国的经济多样化的较少,主要集中在油气开发。刚果是最大的石油生产国之一,但在撒哈拉以南非洲地区的每年生产1200万吨,生产没有停止增加。碳氢化合物是刚果的一次能源消费的70%以上。污染土壤的碳氢化合物是一个非常巨大的问题尽可能多的行业不使用生物修复防止污染土壤。这个日期,没有研究已经完成在刚果为了评估本土的生物修复潜力芽孢杆菌物种。本研究的主要目的是描述芽孢杆菌物种在生物修复和生物强化评估biosurfactant-like分子。
2。材料和方法
2.1。土壤采样
在这项研究中使用的代表性土样的土壤污染10多年石油污垢。样本中收集四个不同地区的车库(Bacongo 4°17′14.3“S 15°15′33.7”E, Ouenze 4°27′72.0“S 15°15′25.17”E, Talangai 4°23 26.37′S 15°29′44.95”E和Mfilou 4°24′45.47 " S 15°28′94.59 " E)布拉柴维尔。土壤的1公斤样品收集在三个不同的点使用无菌铲0-15 cm的深度。这些样品是在聚乙烯袋,立即向实验室进行进一步分析。不同土壤pH值等参数、电导率、总石油烃(TPH energy) [21)内容,水水分百分比进行评估。
隔离的能力容忍和/或降解烃类被评估为先前证明(15]。短暂,布什内尔-哈斯(BH)中使用多环芳烃降解菌的富集和隔离。它包含了(g / L)氯化钠:10.0 g,氯化钾:0.29 g, MgSO4.7H2O: 0.42 g, KH2阿宝4:0.83 g, NH4所以4:0.42 g、K2HPO4:1.25 g,琼脂:20克。这是补充2%的汽油、柴油、苯、正己烷、或橄榄油单独使用作为唯一的碳源和能源。媒介是热压处理过的15分钟的121°C。稀释1 g的每个野污染土壤样品无菌转移到无菌猎鹰管包含9毫升无菌蒸馏水。连续稀释和细菌悬液进行条纹在布什内尔哈斯介质和孵化在37°C 2天。与此同时,接种体也有BH琼脂培养基上没有碳源。
2.2。革兰氏阳性Oil-Degrading细菌隔离
细菌物种能够生长在BH琼脂培养基补充上述2%的污染物。枚举的殖民地是莫塞尔琼脂培养基补充4.2毫升的多粘菌素B用于排除革兰氏阴性细菌。板块在37°C孵化24小时。预选隔离被反复有莫塞尔琼脂板为了获得纯培养的细菌,然后保持偏相同的介质。
2.3。描述的隔离
为了描述隔离,大多数文化和生化测试是由使用标准微生物和生化方法。细菌菌落的形状、大小和颜色进行孵化的莫塞尔琼脂板24小时后。使用光学显微镜的形态表征已经完成(OPTIKA Italie)。革兰氏细菌隔离的状态已使用3%的氢氧化钾(KOH) [22]。孢子形成测试经历了确定隔离形成内生孢子的能力。氧化酶和过氧化氢酶测试所有菌株进行。细菌隔离群还测试了他们的能力,表明大多数芽孢杆菌物种是能动的。
2.4。酶的活动
芽孢杆菌菌株以降低酪蛋白和淀粉的能力。酪蛋白溶血和淀粉分解的活动进行评估所有隔离Kayath et al . 2019(正如前面证明了23]。酪蛋白的溶血活性,1 g的琼脂糖是一个包含100毫升的锥形烧瓶PBS(磷酸缓冲盐)。加热混合物,直到琼脂糖完全溶解后,它是在50°C水浴冷却。10毫升的脱脂牛奶补充道。混合物倒入培养皿,让凝固。井是无菌使用无菌黄色提示。50µL在一夜之间文化的上层清液井存入。在37°C 24小时孵化后,测量周围的光环形成的殖民地。为每一个隔离的测试都是一式三份。
另一方面,淀粉分解的活动,一个24小时的殖民地岁磅琼脂表面沉积含淀粉1%。培养皿在37°C孵化24 - 72小时。碘作为启示。周围的光环殖民地测量(23]。
为了显示芽孢杆菌隔离能够降解脂质,三个媒体。第一个媒介是磅琼脂补充1%橄榄油。第二介质和几滴渐变20磅琼脂。第三个媒介使用与蛋黄莫塞尔补充。一个新的殖民地是每个介质表面的沉积。光环围绕一个殖民地的外观进行了分析。
2.5。检测生物表面活性剂的分析
所有菌株都测试了不同温度下生长的能力(20°C, 37°C, 40°C,和60°C)使用BH中补充2%的污染物包括个人汽油、柴油、苯、正己烷、或橄榄油。隔离能够生长在不同的媒体选择了生物表面活性剂的检测分析。
2.5.1。微生物生长在碳氢化合物和生物降解
所选菌株的生长动力学。肉汤文化是生长在复制包含50毫升BH 100毫升玻璃瓶中不同的碳氢化合物2%:汽油、柴油、苯、正己烷、和橄榄油15天(15]。烧瓶孵化在旋转瓶在37°C。每隔一天,光密度测量在600 nm (OD600年)使用分光光度计(VIS斯派克图米)。
2.5.2。生物表面活性剂的生产试验
生物表面活性剂的乳化活性是其能力留住碳氢化合物或油在水中的乳状液。这个方法是非常重要的工业和环境的应用程序。5毫升的一夜文化注入试管中包含5毫升(v / v)的柴油、汽油、苯己烷,单独和橄榄油。混合大力动摇了3分钟使用一个旋涡混合器(VELP Scientifica,意大利)。管是在室温下培养24小时。乳剂层的高度和总高度的混合物被测量。乳化指数(E24%)使用标准的公式计算E24% = ,他=乳液高度,Ht =总高度的混合物,和E24% =乳化比例后24小时(24]。生产生物表面活性剂的稳定性是评价在不同的温度下(20°C, 40°C,和60°C)。
此外,堆肥能力被发现与溶血性相关活动。殖民地是飞跑到哥伦比亚血琼脂培养基。培养皿培养在37°C(48 - 72小时25]。积极的测试评估的存在一个明确的区域周围的殖民地。在这项研究中枯草芽孢杆菌应变GL48(加入:MK099888.1) [15已被用来作为控制。
2.5.3。驱油实验
驱油试验是评估通过测量的直径明显区域发生当一滴biosurfactant-containing解决方案放在一个油水表面。修改后的试验(26)进行如下:50毫升蒸馏水被添加到一个大培养皿(15厘米直径)。在这个阶段,20µL原油添加到水面,其次是增加10µL文化的上层清液肉汤。明确的区域确定的直径。每个选定的测试是一式三份完成的压力。
2.5.4。生物表面活性剂萃取
生物表面活性剂萃取方法由Kinouani Kinavouidi et al . 2020年已经完成在本研究27]。生物表面活性剂的提取进行了如下:1毫升的培养液用于接种100毫升Luria肉汤培养基一式三份和孵化瓶孵化器在180 rpm 37°C 24小时。每种文化在10000转离心20分钟。离心后,上清液游离的隔离治疗通过酸性降水添加盐酸滴不断,直到达成pH值2。上层清液被允许沉淀在4°C。收集的降水量在10000转离心20分钟。这个方法是反复用酒精和40%硫酸铵。获得的颗粒称重和用来评估他们的乳化能力(v / v)柴油、汽油、己烷、苯分别。芽孢杆菌隔离进一步的特征提取使用氯仿等有机溶剂。
2.5.5。生物表面活性剂的抗菌试验
生产生物表面活性剂提取的抗菌活性进行了测试与鉴定菌株(大肠杆菌,弗氏志贺菌5 M90T,蜡样芽胞杆菌)最近证明了Bokamba Moukala et al . 202024]。抗菌活性的琼脂纸片扩散法做了一些调整。进行了抗菌活性Luria肉汤琼脂。井是无菌准备到凝胶。被测试的微生物接种到凝胶。一卷50µl的生物表面活性剂溶液放置到油井上。24小时的潜伏期后37°C,抑制区域的直径测量。平均的三个被测量,以确保结果是可再生的。
2.6。生物降解动力学芽孢杆菌隔离财团
为了确定分离株的能力减少上述总碳氢化合物,碳氢化合物总量的估计在不同时期通过受污染的土壤。消毒野外污染土样之前,总烃含量被评估。1公斤的野生污染土样来自Bacongo车库热压处理过的15分钟在121°C。在环境温度下冷却后的土壤,碳氢化合物总量的估计是评估。选择最好的隔离的乳化指数和增长率的苯、正己烷、柴油,汽油,或橄榄油。一夜文化四个财团的芽孢杆菌隔离M28、M29 ST70, ST55600海里在野外被接种污染土样和孵化环境温度一段15天。野外土壤污染没有选中的细菌被用作消极的控制。每五天,土壤中的碳氢化合物总量估计。
2.7。统计分析
统计分析结果给出平均值±标准差(SD)。GraphPad棱镜7用于数据分析。
3所示。结果
3.1。土壤参数
土壤样品的理化参数评估和记录在表1。
3.2。描述隔离和微生物增长率的碳氢化合物
有效的堆肥芽孢杆菌在布拉柴维尔地区物种隔离受污染的土壤样本(Bacongo, Ouenze Talangai, Mfilou)。60隔离选择基于他们的能力成长中补充2%的汽油、柴油、己烷、苯、或橄榄油在不到48小时。根据Bergey手册,34岁的隔离的形态和生化特征进行了研究,他们被怀疑芽孢杆菌物种。获得的隔离检查对莫塞尔媒介文化特征与多粘菌素B补充,显微镜检查(杆菌)、内生孢子的形成,与3% KOH革兰氏阳性状态,酶的活动。69.7%的隔离是过氧化氢酶试验阳性,90.1%能够水解酪蛋白,84.8%是阳性淀粉水解,脂质水解为78.78%,66.7%是氧化酶试验阳性。此外,它是发现,93.9%的隔离群集测试是积极的。所有隔离测试能够生长在黑洞中补充2%(汽油、柴油、苯、正己烷、或橄榄油)分别在不同的温度下20°C, 37°C, 40°C,分别为60°C(图1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
特定的隔离增长率2%汽油、柴油、苯、正己烷、和橄榄油分别测定光密度的线性关系(OD)与时间。图1说明细菌分离培养的增长率在黑洞中含有2%的浓度汽油、柴油、苯、正己烷、和橄榄油分别作为唯一的碳来源。观察细菌生长速率(图一段15天1)。
3.3。生产Biosurfactant-Like分子
所有的三个测试,包括乳化指数(数字2(一个)- - - - - -2 (d)(图)和驱油方法2 (e)),用于筛选的生物表面活性剂生产商显示筛选芽孢杆菌物种的有效生物表面活性剂生产商。通过使用汽油、柴油、己烷、苯;有些菌株能够产生biosurfactant-like分子比例从10到100%(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。温度对生物表面活性剂的影响的活动
平均而言,隔离保留60%的活动20°C, 40°C,和60°C的汽油和柴油,分别。另一方面,一些隔离失去活动60°C。在室温下孵化一段7个月对生物表面活性剂活动(数据没有显著影响3(一)-3(c))。
(一)
(b)
(c)
强调可抽出的规范biosurfactant-like分子分泌芽孢杆菌物种,菌株能够乳化碳氢化合物(汽油、柴油、己烷或苯)已经进行了提取。降水在盐酸,硫酸氨、乙醇和氯仿已经完成。所有评估菌株表现出沉淀除SB6氯仿和M14酒精(表2)。乳化指数沉淀后进行E24(数据没有显示)。
3.5。生物表面活性剂的抗菌试验
为了评估生物表面活性剂与病原体包括的保护作用弗氏志贺菌5 M90T,蜡样芽胞杆菌,和大肠杆菌,对手分析已经完成解释方法。34岁的隔离测试,29.41%有抗菌活性蜡样芽胞杆菌(图4(一)),34%大肠杆菌(图4 (b)),只有5.88%的人反对弗氏志贺菌5 M90T(图4 (c))。光环的直径变化从0.7到6毫米分离从一个到另一个地方。
(一)
(b)
(c)
组成的一个财团四个隔离(M28, M29、ST70 ST55)是用于污染土壤为了确定生物降解烃类的能力。发现该财团可能降低碳氢化合物为57.43%(图5)。
4所示。讨论
本研究的主要目的是评估生物降解原地土壤杆菌物种在防止污染的潜力。共有十二个土壤样本获得的四个不同地区的布拉柴维尔城市(Bacongo, Ouenze Talangai, Mfilou)在不同物理化学性质的特征。结果表明,不同土壤的pH值变化相应地从7.75到8.73。pH值对土壤成分溶解度和生物利用度的影响,这可能影响土壤生物活性。土壤样品以某种方式从车库在Ouenze中性Bacongo相比,Talangai, Mfilou,分别是更基本。多项研究表明,pH值之间的相关性和微生物生物修复功效。可以生物降解五氯苯酚分子与pH值的变化和有机物(28]。这些经土壤电导率措施(29日]。虽然它没有提供一个直接测量特定的离子或盐化合物,它是一个重要指标,因为它影响土壤中微生物活动。过量的盐阻碍经济增长影响水平衡。这一研究获得的电导率值介于25 - 42µs /厘米,对应ISO11265:1994 30到60的标准µ为粘土土壤(s /厘米29日]。
许多研究已经提到,土壤中的微生物烃修复的监测技术似乎发出调查(30.- - - - - -33]。芽孢杆菌菌株孤立在这个工作从不同污染的网站已被证明能够降低一些污染物如多环芳烃。微生物能源使用石油碳氢化合物作为碳源。属于属的细菌芽孢杆菌经常参与生物修复和其他生物技术过程10,16,17]。许多芽孢杆菌压力包括枯草芽孢杆菌,b的仙人掌,已被证明能够降解复杂的碳氢化合物的混合物,如原油的生物降解10,16,34- - - - - -37]。芽孢杆菌种虫害更宽容的高浓度的土壤中多环芳烃由于其抗内生孢子,隔离属于芽孢杆菌sp.可以有效去除污染土壤中多环芳烃的2,38- - - - - -41]。34芽孢杆菌隔离在这项研究中能够生长在24小时或48小时在黑洞中补充了不同碳源(汽油、柴油、苯、己烷和橄榄油)2% (v / v)。这些细菌大多是不仅能够生长在污染物的碳氢化合物的存在而且在黑洞中补充2%橄榄油。研究表明,橄榄油是一种不利的基质微生物的增长。结果表明,这些细菌有一个有趣的生物技术工业生物转化潜力的油脂和脂肪(42]。在大多数环境中能够降解烃类的微生物存在。降低碳氢化合物的能力证明了大规模的修复。据报道,芽孢杆菌sp.是最主要的原油分离(2,40,41]。的表型和生化特征34隔离是相关的和面向属芽孢杆菌。34隔离相关的测序芽孢杆菌是歧视的方式的物种和扩增和测序吗fibE正在调查(23,43]。
微生物生长的模式从一个有机体到另一个不同。因素决定这种微生物增长取决于孵化温度、时间,所使用的底物(1]。增长模式反映在报告的乘法的物种。据报道,精炼石油只提供碳和能源居民微生物,而原油供应氮、硫、重金属、碳和能源(44]。光密度(OD600)表明,细菌物种有一个更好的增长与苯中补充碳源己烷,汽油,柴油,最后,橄榄油。此外,苯的降解速率和己烷更快的柴油和汽油相比,分别。这可能是解释的复杂结构和性质的商业汽油和柴油的许多芳香环。
并发与每个孤立的生长曲线在指定的时间,他们的乳化能力碳氢化合物在不同的温度下进行了研究。发现两个细菌隔离能够生长在黑洞中补充不同的碳源,但不利于一些生物表面活性剂的筛选方法。除了孤立ST70,其他没有显示溶血性活动。同意我们的研究结果很相似,很多调查显示溶血性活动作为一个不可靠的标准检测的生物表面活性剂活性细菌培养(4,45]。
虽然七隔离有利于驱油被发现,许多其他隔离显示活动与苯、乳化柴油,汽油和正己烷。
许多隔离在这个研究还显示一个产能快速增长和高增长率,表现出很高的对数生长期。结果提供有用的证据芽孢杆菌对污染环境的生物修复物种。苯和己烷的增长率高于汽油和己烷。证明、己烷、苯更轻和更不稳定,而汽油和柴油。的能力芽孢杆菌物种生存在这些石油产品使他们非常适合污染土壤的生物降解10,34,36,39]。
这项研究表明,生物表面活性剂的生产依赖于温度和潜伏期。结果表明,生物表面活性剂能够沉淀酒精(94.12%)、硫酸铵(91.18%)、盐酸(94.12%),94%被氯仿可提取的。
为了表明这些分离株能分泌生物表面活性剂能抑制病原菌,biosurfactant-like测试三个已知的致病分子分离弗氏志贺菌5 M90T,蜡样芽胞杆菌,和大肠杆菌。这项研究表明,仅从两个(2)生物表面活性剂产生隔离能够抑制的增长弗氏志贺菌。生物表面活性剂产生十(10)隔离抑制的增长蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌。这些结果是非常重要的去表现不仅在生物降解的重要性,但也避免任何与这些致病菌的污染土壤。生物修复的污染包括含油污泥采用致病性细菌铜绿假单胞菌,b的仙人掌,葡萄球菌sp,已经证明(36,46,47]。在这里,我们显示的证据芽孢杆菌可能是聪明的选择等生物修复因为菌株深深考虑肝生物(通常被认为是安全的)。
总石油烃污染土壤的内容来自Bacongo减少了从195年到112年在15天(g / kg)。虽然生物降解过程是缓慢发生,这表明细菌财团能够降解不同的碳氢化合物。生物修复使用财团已经证明(38,48- - - - - -51]。这个过程需要更多的更快降解条件优化。
5。结论
本研究揭示了原地芽孢杆菌物种隔离在刚果共和国是有效的生物表面活性剂生产商,他们可以迅速增长在媒体与苯、正己烷、汽油、柴油或橄榄油分别为唯一碳源。该财团的四芽孢杆菌隔离表明,这些微生物提供潜力巨大的生物技术和生物修复被污染的土壤。
数据可用性
Excel表包括数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者想表达他们的感谢员工的科学和技术学院Marien Ngouabi大学和研究所的分子生物学和微生物学实验室de矫揉造作的国家在科学准确等naturelle (IRSEN),开展本研究。作者感谢博士Kiele Molingo Mbemba培训支持的污染物,奥古斯汀博士博士和艾梅Lebonguy Armel Ibala Zamba为技术支持,Judicael Gabriel Okeni-Boba,戈马Tsaty薇罗尼卡分析土壤样本。