分子检测抗生素耐药基因铜绿假单胞菌从临床前环境:公共卫生影响Mthatha,南非东开普省

文摘

评价抗antimicrobial-resistant基因的概要文件和检测细菌病原体的临床前环境必须评估可能的风险环境中耐药基因的传播。本文试图确定抗生素耐药基因铜绿假单胞菌从临床前来源Mthatha、东开普省和评估其公共卫生影响。从屠宰场废水收集的样本和水生环境被膜过滤处理和CHROMagarTM培养假单胞菌媒介。物种鉴定是由autoSCAN-4(戴德贝林Inc ., IL)。分离株的分子表征证实了使用实时聚合酶链反应(rPCR)和选择隔离进一步筛查窝藏抗菌素耐药性基因的可能性。51假单胞菌物种从屠宰场污水和地表水样品中恢复过来,其中36株铜绿假单胞菌(70.6%)。的铜绿假单胞菌隔离了抵抗aztreonam(86.1%)、头孢他啶(63.9%)、哌拉西林(58.3%)、头孢吡肟(55.6%)、imipenem(50%)、哌拉西林/ tazobactam (47.2%)、meropenem(41.7%),和左氧氟沙星(30.6%)。二十的36铜绿假单胞菌显示多药耐药性资料,归类为耐多药(MDR) (55.6%)。大部分的细菌分离株表现出高多重抗药性(MAR)指数从0.08到0.69平均3月指数为0.38。rPCR分析的十五岁P。绿脓杆菌隔离,隔离14(93.3%)发现窝藏bla_SHV,六个分离株(40%)存在bla_TEM和三个分离株(20%)存在bla_CTX-M,至少ESBL发生。当前的研究显示的结果铜绿假单胞菌从临床前环境隔离恢复抵抗前线临床相关antipseudomonal药物。这是有关,因为它对环境造成威胁,是一个公共健康的威胁。鉴于公共卫生的相关性,本文建议在废水环境中耐多药病原体的监测。

1。介绍

抗菌素耐药性(AMR)是一个人类和兽医公共卫生危机(1,2]。不合理使用抗生素在人类医学和动物生产的刺激经济增长的目的,metaphylaxis,预防引发的扩散和传播耐药性细菌和抗性基因导致严重的公共卫生和环境风险3- - - - - -5]。AMR对人类健康的威胁尤其对低收入向中等收入国家(中低收入国家的要求)。这是由于社区获得性耐药感染的可能性越高,高传染性疾病负担一般民众,和穷人获得卫生服务(6),从而导致发病率增加,住院时间延长,和医疗费用上升,从而发挥家庭单位和社会的经济负担(7]。

铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌),一个环境细菌,可以发现在各种陆生、水生栖息地。这是由于其广泛的代谢多样性,增强其分布、增殖,和生存,尽管不良物理和化学条件,从而提高其生态成功和潜在威胁公众健康(8,9]。铜绿假单胞菌是一个投机取巧的人类病原体胜任多种感染包括呼吸道、血液、泌尿道和皮肤感染10]。这对感染能力和能力对抗生素耐药性使得生物被认为是一个对公众健康的威胁(9,10]。铜绿假单胞菌利用内在和获得性耐药机制。获得性耐药机制是推动移动遗传元素通过水平基因转移(HGT)。这对人类健康构成更大的风险,因为易于表达和传播的11]。

抗生素的使用在农业部门还能抵抗加剧的传播在人类社会由于转让的环境传播抗性基因(12]。屠宰场废水能够污染地表水和地下水。从屠宰场废水排放污染环境引入的病原体可以影响土地和水的品质,从而危害人类,动物,水生生态系统的健康和构成的威胁人类健康和环境安全13]。病原体从屠宰场污水和动物粪便的可能性达到或者排放到水体和发展抵抗抗生素在人类感染是一个问题。这是因为这些感染通常难以治疗,常常导致发病率和死亡率尤其是最脆弱的社区成员(14]。

几项研究已经调查extended-spectrum的患病率和检测β内酰胺酶——(ESBL)和金属β内酰胺酶——(MBL)生产铜绿假单胞菌从临床分离样品(15,16),但有一个发生在临床前数据样本不足。需要识别和监控抗生素耐药基因在水体和废水是必要的评估其对人类健康的潜在风险。本研究调查的患病率在临床前的抗菌素耐药性和抗生素耐药基因铜绿假单胞菌在东开普省Mthatha,并强调了它的公共卫生影响。

2。材料和方法

2.1。研究设计和设置

一个横断面研究在2019年1月至6月期间。研究网站Umzikantu红肉屠宰场,Zimbane Mthatha, Mthatha河,Mthatha大坝。Umzikantu红肉屠宰场是一种高通量屠宰场位于Zimbane Mthatha位置,东开普省。这是唯一运营红肉屠宰场服务Mthatha在奥利弗·雷金纳德·坦博区及周边地区。认证和有能力屠宰动物每天50个单位。一个单位= 1牛/牛或两个小腿或六羊或四个猪。屠宰场对公众开放,提供屠宰和切割服务在一个合理的价格。同时也批发商提供肉类屠宰,超市,和医院。

Mthatha大坝(31°33′2 " S 28°44′24 " E坐标)是一个填土方类型大坝Mthatha河,靠近Mthatha镇,奥利弗·雷金纳德·坦博区东开普省的直辖市。这座大坝建于1977年,为市政和工业用途。水和卫生监督部门事务的大坝。大坝的下游区886公里²表面积测量25.42公里²。它有一个高38米测长620米。水库大坝的容量是253674000米³。

2.2。样品收集

屠宰场废水样品:使用标准的方法检查水和废水17),100毫升的屠宰场废水来自两个采样点到无菌瓶适当标记。所有样本存储在冷却器盒子的运输Mthatha瓦尔特·西苏卢大学医学微生物学实验室进行进一步分析,4小时内的样本集合。

水生环境样品:水样本收集Mthatha大坝在无菌100毫升无菌杜兰Schott玻璃瓶从不同采样点通过直接浸瓶约20厘米在水面以下。收集后,样本存储在冰冷却器盒子,送到实验室,保持在4°C到分析。

2.3。细菌学的分析

膜过滤法是根据标准方法(用于隔离17]。对所有样本,100毫升的三卷过滤(10通过一个0.45μ米孔隙大小的网格膜滤器(英国绘画纸实验室部门,梅德斯通)使用水泵(16824年模型缝匠肌)。过滤器被移除和无菌放在CHROMagarTM假单胞菌(CHROMagarTM;法国巴黎)琼脂板确保没有气泡被困。所有媒体都准备根据制造商的指示(CHROMagarTM;法国巴黎)。分析了每个样本一式三份。盘子被孵化24 - 48小时的耗氧在37°C。蓝色菌落的特征假单胞菌种虫害是亚文化获得纯粹的文化。

2.4。对铜绿假单胞菌

蓝色的殖民地的典型假单胞菌物种显色培养基亚文化溴棕三甲铵琼脂和CHROMagar得到纯粹的殖民地。葡萄的气味特征是有用的识别标记。革兰氏染色剂等表型测试,氧化酶试验,进行了过氧化氢酶试验(18]。物种鉴定进行了使用革兰氏阴性ID 2型板(美国贝克曼库尔特公司)的显微扫描autoScan-4自动化系统(戴德贝林Inc .迪尔菲尔德,IL)。增长42°C (18)在一个有氧孵化器也用来证实的身份铜绿假单胞菌隔离。所有的菌株都储存在-80°C 15%甘油直到进一步使用。

2.5。确认rPCR菌株的分子

一夜之间DNA提取:DNA提取细菌培养生长在溴棕三甲铵琼脂的殖民地。这是罗氏resuspended麦格纳纯细菌裂解缓冲,漩涡,在95°C加热10分钟,并通过离心13000颗粒状10分钟。四百毫升水中被用作标本在麦格纳纯紧凑(MPC)系统(罗氏应用科学,印第安纳波利斯),使用MPC核酸隔离设备1根据制造商的指示。洗脱管包含200µl纯化核酸被储存在-80°C,直到进一步的使用。LightCycler 2.0仪器(罗氏应用科学,德国)和快速启动LightCycler 480 HybProbes大师工具包(美国罗氏诊断)被用于聚合酶反应。特定的引物和探针(表1由TIB Molbiol(德国)目标基因,种群gyrB,被singleplex放大实时聚合酶链反应(rPCR)以下表所示的协议2。

2.6。抗菌药物敏感性试验

抗菌药物敏感性试验是由微扫描使用脱水肉汤autoScan-4系统采用方法在麦克风面板类型44 (NM44)(美国贝克曼库尔特公司)制造商的指导方针后(20.]。以下抗生素在面板测试:阿米卡星,aztreonam、头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、doripenem,庆大霉素,imipenem,左氧氟沙星,meropenem,哌拉西林/ tazobactam,哌拉西林,妥布霉素。麦克风进行了分析和解释根据推荐临床断点在CLSI指南(21]。写明ATCC质量控制生物被使用铜绿假单胞菌写明ATCC 27853和大肠杆菌写明ATCC 25922。Nonsusceptibility包括电阻和接触电阻的组合。耐多药(MDR)铜绿假单胞菌被定义为nonsusceptibility至少有一个代理在三个或三个以上抗菌类别根据Magiorakos et al。22]。多种抗生素抗性指数(玛丽)隔离的计算和解释所描述的Gufe et al。23]。短暂,它被描述为抗生素的数量的比例,分离株耐药(a),抗生素的分离株的总数是暴露(b),也就是说,多个抗生素抗性指数(玛丽)=一个/ b。细菌在毛伊岛> 0.2来自高风险污染来源,使用了一些抗生素,而玛丽值≤0.2表明菌株来源很少或从未使用抗生素。

2.7。分子ESBL和MBL rPCR的检测

孤立的铜绿假单胞菌殖民地溴棕三甲铵琼脂和CHROMagar假单胞菌被选为基因组DNA提取。十五具隔离从池中选择使用一个简单的随机抽样技术。模板DNA提取了麦格纳纯紧凑使用货币政策委员会(MPC)核酸隔离设备根据制造商的指示。实时PCR在LightCycler 2.0进行仪器(罗氏应用科学,德国)使用快速启动LightCycler 480 HybProbes大师工具包(美国罗氏诊断)。特定的引物和探针(表3)针对基因CTX-M SHV, TEM,小鬼,VIM放大singleplex rPCR使用相同的协议中描述表2。设计的引物被TIB Molbiol(德国柏林)。使用20 rPCR化验了32个旋转木马μL毛细血管与每个毛细管包含20的总量μL,包括2μL (LightCycler由于“快速上手”项目DNA杂交探针大师(罗氏诊断),2μL的引物为每个正向和反向(0.5毫米),2μ2.4 L的调查μL MgCl2, 2μL中提取DNA,和水的体积占20μl

绝对量化使用LightCycler软件4.05进行。在退火期间获得的数据。荧光测量每周期60°C孵化后立即(扩展步骤)。荧光曲线分析了LightCycler软件,版本4.05。结果表达的阈值测定周期(Ct)值,这表示样品荧光的周期变得非常不同的基线信号。包括积极控制压力肺炎克雷伯菌写明ATCC 51503 (bla_CTX-M),肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603 (bla_SHV),大肠杆菌据国家反恐怖主义中心13351 (bla_TEM),铜绿假单胞菌据国家反恐怖主义中心13437 (bla_VIM),大肠杆菌据国家反恐怖主义中心13476 (bla_小鬼)。这些都是来自国立传染病研究所,南非约翰内斯堡。

2.8。统计分析

所有数据进入一个Excel表,上传在SPSS软件(版本23.0 IBM,阿蒙克,纽约)。耐多药(MDR)的患病率铜绿假单胞菌从不同来源及其分布(水和屠宰场废水)测定和用百分比表示。

3所示。结果

3.1。隔离和抗菌药物敏感性试验

期间的研究中,51隔离假单胞菌物种被找到,其中36个隔离铜绿假单胞菌(70.6%)和15p .荧光/ putida(29.4%)。铜绿假单胞菌是主要的物种,其中19(52.8%)和17(47.2%)来自地表水和屠宰场废水,分别。其中的36株铜绿假单胞菌被选作进一步确认。他们确认的实时放大gyrB基因包括参考应变,写明ATCC 27853(图1)。抗生素的敏感性测试的结果铜绿假单胞菌菌株表现出不同程度的耐药性。临床相关抗生素的面板中,有抵抗aztreonam(86.1%)、头孢他啶(63.9%)、哌拉西林(58.3%)、头孢吡肟(55.6%)、imipenem(50%)、哌拉西林/ tazobactam (47.2%)、meropenem(41.7%),和左氧氟沙星(30.6%)(表4)。二十的36铜绿假单胞菌菌株呈现多药耐药性资料,归类为耐多药(55.6%)与60%的耐多药菌株来自屠宰场废水和40%来自地表水。大部分的细菌分离显示高玛丽从0.08到0.69的意思是玛丽为0.38。隔离的意思是玛丽屠宰场废水是0.42而水生样品= 0.34(图2)。

3.2。分子检测的频谱扩展β内酰胺酶(ESBL)和金属-β内酰胺酶编码基因(MBL)铜绿假单胞菌

PCR筛选的基因编码ESBL和MBL的放大bla_SHV,bla_CTX-M,bla_TEM在一些铜绿假单胞菌隔离。结果的分子检测ESBL MBL基因型和环境的压力铜绿假单胞菌由rPCR展示在表5。在15P。绿脓杆菌隔离分析14隔离(93.3%)存在bla_SHV,六个分离株(40%)存在bla_TEM和三个分离株(20%)存在bla_CTX-M。只有一个隔离(6.7%)存在bla_VIM基因虽然没有发现窝藏MBL隔离,bla_小鬼。

4所示。讨论

在这项研究中,36个隔离的铜绿假单胞菌从屠宰场污水和地表水中恢复过来。与本研究协议,Igbinosa et al。27- - - - - -29日)所有报告的发生铜绿假单胞菌从医院排水、环境和污水网络从世界的各个部分。这种微生物的出现是一个引起人们的关注,因为它是一个投机取巧的人类病原体,能感染人的免疫力被破坏30.]。尼日利亚的一项类似研究发现,直接从屠宰场废水进入水体的排放未经处理引发了严重的健康风险之后的污染细菌(14]。

的流行率铜绿假单胞菌(70.6%)认为在当前的研究与先前的报道从尼日利亚鱼塘的水样本网站和牛浪费,铜绿假单胞菌被发现的最普遍的出现率最高的62.8%和71.5%,分别在其他物种(31日,32]。这可能是由于生理上的多功能性和有限的营养需求,使其适应在不利条件下33]。同样,在同意这项研究中,进行的一项研究麦非肯南非西北省的孤立铜绿假单胞菌从饮用水和地表水(34]。然而,我们的研究结果相反,一项研究在爱丽丝,东开普省,南非,废水样品发现更低的出现率为11.1% (35]。这种差异很可能是由于不同的治疗过程用于水的净化,也可以认为污水处理厂(WWTP)不完全消除细菌尤其是耐多药菌株由于这些生物体是有弹性的治疗过程和最终发挥作用在抗菌素耐药性的传播和蔓延。

隔离的阻力资料显示63.9%和55.6%抵抗第二代和第三代头孢菌素,分别(头孢他啶和头孢吡肟)和低耐氨基糖甙类。观察到在头孢菌素耐药模式在当前的研究中观察到与以前的报告的平价Ejikeugwu et al。28),但低于Tapela et al。(29日,36电阻率为100%。然而,从科特迪瓦Benie等人37]报道低电阻率的6.9%和17%,头孢他啶和头孢吡肟,分别。引起关注的是高电阻显示头孢菌素,是前线antipseudomonal药物治疗铜绿假单胞菌感染;增加抵抗这类抗生素不会有利,将导致有限的治疗方案。目前的研究显示,16.7%的隔离是对氨基糖苷类耐药,阿米卡星、庆大霉素。类似低电阻率阿米卡星(19%),但略高于利率庆大霉素(28.5%)是由一个研究报道在埃及(36]。然而,电阻率升高79%,庆大霉素在尼日利亚被进行的一项研究报告(28]。这种变化可能是由于不同的氨基糖苷类抗生素的处方模式(38]。

耐碳青霉烯包括imipenem(50%)和meropenem(41.7%)也被观察到在当前的研究中。这很出乎意料,因为碳青霉烯代表一个最有效的和最好的选择治疗革兰氏阴性感染尤其是MDR感染。特拉铜绿假单胞菌隔离经常伴随着更高的死亡率由于酶"调停的阻力和广泛传播的可能性更大阻力通过移动遗传元素(39]。抗菌素的滥用人类和兽医经常导致抗药性细菌的增殖(ARB)和耐抗生素基因(ARGs)可以转移到人类致病细菌。这最终转移,或者说当前和即将到来的抗生素的效力,从而导致治疗失败对于一些危及生命的疾病(40]。

在最近的研究中,MDR的患病率55.6%铜绿假单胞菌(MDRPA)临床前设置高,令人担忧。因此,这项研究证明了MDR的存在铜绿假单胞菌在临床前在南非的东开普省环境。这一发现与报告一致Algammal et al。41有55.5%的耐多药菌株铜绿假单胞菌从淡水鱼类样本。然而,奥尔加et al。42]报道32%的低利率的MDRPA从水生环境。抗生素的不合理和不必要的使用快速耐多药菌株的增加,因此呈现经验性抗生素治疗无效的(43]。

MAR索引方法是一种简单快速的方法区分来自不同来源生物从高风险的污染来源,经常使用抗生素或低风险的来源44)作为一个指标的污染对人类潜在的不安全的水平(45]。3月指数> 0.2表明,隔离来自高风险污染的来源(46]。在最近的研究中,3月指数的分析铜绿假单胞菌压力显示,所有人都3月指数高于0.2(图2)。Odjajare et al。47)和Gufe et al。23)报告了类似的结果。研究结果反映了过度使用抗生素在动物生产和突出这些病原体的来源,最终把进水体,对人类构成健康风险。

MDR的释放细菌包括ESBL和MBL生产商进入水体是一个引起人们的关注。这些生物可以作为机会致病菌,当他们在环境中持续存在,因为他们携带移动遗传物质,可以作为抵抗池可以快速抗菌素耐药性的传播(48]。在最近的研究中,bla_SHV是最普遍的ESBL通过PCR检测。这是发现在14个分离株(93.3%)。bla_TEM中检测出40%的隔离而至少检测ESBL吗bla_CTX-M(20%)。本研究是在协议与其他作者(49,50]。在一起,这些统计数据表明成功传播ESBL-encoding基因普遍。

4.1。限制

这项研究的局限性是,这项研究是基于小样本的大小。

5。结论

本研究的结果显示相当大的负担,抵抗重要抗生素如头孢他啶、头孢吡肟、imipenem,和meropenem包括哌拉西林和哌拉西林/ tazobactam,抗生素治疗MDR的首选铜绿假单胞菌。这造成人类感染的成功治疗并发症。由于公共卫生的相关性,研究结果揭示协同监测的重要性和必要性的抗菌素耐药性和抗性基因在临床前环境在地方和区域两个层面,一个健康的方法的实现。此外,ESBL-producing的发生铜绿假单胞菌提出了一个潜在的公共卫生威胁由于遗传元素负责这种阻力存在移动遗传元素(毫克),可以转移到其他革兰氏阴性细菌通过水平基因转移。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

伦理批准

本研究是人类研究伦理委员会批准的瓦尔特·西苏卢大学健康科学学院批准这项研究(参考号:024/2016)。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集、分析和解释数据,写的手稿,决定发表。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Apalata T。,Vasaikar S., and Hosu M. C. conceived and designed the experiment. Hosu M. C. and Okuthe G. E. were involved in the field and experimental studies. Hosu M. C., Okuthe G. E., and Apalata T. collected the data, analyzed the data, and drafted the manuscript. Apalata T., Vasaikar S., Hosu M. C., and Okuthe G. E. revised the manuscript critically for intellectual content. All authors read and approved the final manuscript.

确认

作者感谢纳尔逊·曼德拉是学术医院(NMAH)和微生物实验室在国家卫生实验室服务(科)NMAH支持在样本收集。国家传染病研究所是感激的供应参考菌株。Hosu m . C接到国家研究基金会的博士奖学金(NRF)在这项研究。内的研究Thuthuka评级跟踪(Ref。没有。TTK150625121238;UID: 99307)项目由联盟(南非)。

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