双氯芬酸可能诱发PIA-Independent生物膜的形成gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba菌株gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba是一种病原体对抗生素普遍耐药。生物膜的形成是其毒性相关的重要因素之一。Non-antibiotics药物,如非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),研究了抗多种抗菌素的另一种治疗感染的病原体和biofilm-associated感染。在这项研究中,非甾体抗炎药双氯芬酸钠的影响对经济增长的抑制作用和生物膜的形成gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba进行了评估。双氯芬酸的最低抑制浓度(MIC)五十隔离从200年到400年不等gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。双氯芬酸sub-MICs诱导生物膜在biofilm-negative菌株的32.3%胰蛋白酶的酱油汤。所有药物引发的生物膜显示PIA(多糖细胞间粘附)独立成分,扫描电镜显示,诱导生物膜提供了一个非常离散矩阵。双氯芬酸的组合与利福平sub-MICs诱导强烈的PIA-dependent生产三四个种族的生物膜,而非甾体抗炎药的组合与生理盐水诱导部分多糖生物膜的形成两个菌株和PIA-independent生物膜在另一个压力。非甾体抗炎药与葡萄糖的结合导致PIA-independent四个菌株的生物膜进行测试。结果表明,双氯芬酸能通常由PIA-independent通路诱导生物膜的生产。然而,当这个非甾体抗炎药是结合其他类型的诱导代理人,生物膜的组成产生可能会有所不同。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

一些药物或多或少的抗菌活性,尽管这种影响并不是他们的主要治疗目标。等这些属性都包含在医药类化合物抗组胺药,他汀类药物,抗精神病药物,局部麻醉剂,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)、抗惊厥药物和阻滞交感神经的代理(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和被称为non-antibioticsgydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

non-antibiotics之一,许多研究把重点放在了非甾体抗炎药。非甾体抗炎药化合物,除了抗炎作用,有止痛和退热的属性。这些药物是世界上使用最广泛的药物之一。其主要的作用机制包括抑制环氧酶,导致减少前列腺素的合成gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

最规定非甾体抗炎药在临床实践等药物双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、阿司匹林。抗菌行动包括细菌隔离的不同物种,以及真菌(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。双氯芬酸(2 - [2 - ((2,6-dichlorophenyl)氨基)苯乙酸)是一个非甾体抗炎药,对各种致病菌的体外抗菌活性(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。广谱的抗菌效果的研究表明,这种药物还可以获得体内(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

双氯芬酸的抗菌作用机制似乎主要居住在抑制DNA合成(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。除此之外,溴化乙锭的吸收增加gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba细胞暴露于双氯芬酸钠也提供了证据表明,非甾体抗炎药可能通过影响细胞膜的完整性(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。这种药物也引起广泛的耐甲氧西林的转录组变化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(MRSA)通过改变数百个基因的表达,包括那些与抗菌素耐药性相关(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

除了调查他们潜在的抗菌活性,研究人员分析了双氯芬酸对生物膜的影响。生物膜是复杂的多细胞微生物群落,非晶态聚合物基体扩散。他们在微生物致病性发挥重要作用,防止宿主免疫防御机制和赋予生存能力,抗菌药物(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,一个重要的医院和社区病原体,生物膜的形成是由gydF4y2BaicaADBCgydF4y2Ba端依赖和独立的途径gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。的基因gydF4y2BaicagydF4y2Ba操纵子编码酶参与的生产多糖细胞间adhesin (PIA)介导的细胞间粘附细菌和多层生物膜的积累。然而,特定的蛋白质可以在信息替代PIA PIA-independent生物膜附着,有时,细胞外DNA(埃德娜)矩阵的主要成分(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

许多研究已经表明,双氯芬酸antibiofilm属性在不同的细菌病原体(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。然而,是否还没有被调查,相比之下,subinhibitory浓度的非甾体抗炎药可以诱导生物膜的生产。因此,本研究的目的是探讨双氯芬酸的抗菌效果gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba菌株及其对生物膜的动作感应,单独或结合其他潜在诱导代理人。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。细菌的分离gydF4y2Ba

25的临床分离株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(株)获得不同感染病人去医院在里约热内卢(HSE / RJ),和25个临床前压力得到健康个体的鼻拭子(菌株B)。只有一个细菌被认为是为每个单独的隔离。隔离是提交给革兰氏染色法,过氧化氢酶,管凝固酶试验。识别和对抗菌药物的敏感性进行了使用微扫描徒步逃犯- 96系统(戴德Behring Inc .)。此外,隔离进行了苯唑西林耐药检测,证实了头孢西丁磁盘屏幕测试。物种的确认是由PCR试验(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。细菌股市保持在大豆胰蛋白胨培养基中−80°C (TSB HiMedia)包含甘油(50% v / v)。伦理委员会对研究与人类的HSE / RJ批准了这项研究在参考号000.41。gydF4y2Ba

2.2。确定最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)双氯芬酸gydF4y2Ba

双氯芬酸的麦克风肉汤稀释法测定根据临床和实验室标准协会(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)使用96 -平底的聚苯乙烯微量滴定板(Kasvi)。简而言之,一个双氯芬酸(σ)在甲醇溶液制备工作,由过滤消毒,在TSB稀释。药物浓度从1.600到1.5不等gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL系列稀释了1/2 TSB,和一百毫升的每种药物稀释被添加到井。gydF4y2Ba

在盐溶液的细菌悬液制备,浊度调整到0.5麦克法兰标准,相当于1.5×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba集落形成单位(cfu) /毫升。5毫升水中的细菌培养液包括稀释文化获得大约5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Bacfu /。TSB没有药物与细菌培养液TSB只被用作控制。板块在35°C孵化24 h和视觉阅读建立浊度的存在与否。麦克风被定义为最低浓度的药物,抑制细菌生长可见。此外,光密度(ODgydF4y2Ba_{620海里gydF4y2Ba})测量使用板读者(热板RT6000)。MBC是由亚文化,Triptyc大豆琼脂(TSA HiMedia) 10gydF4y2BaμgydF4y2Bal介质从井没有出现明显增长。板块在37°C 24 h,孵化和MBC被定义为最低的药物浓度,导致细菌生长的缺失或只有一个殖民地的存在。gydF4y2Ba

2.3。Subinhibitory效果(Sub-MICs)的双氯芬酸钠浓度对生物膜的形成gydF4y2Ba

sub-MICs双氯芬酸的生物膜形成的影响,研究了使用微量滴定板gydF4y2Ba(gydF4y2BaMTP)试验gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),做了一些调整。二十临床菌株和二十航母菌株进行了测试。短暂,双重的连续稀释的双氯芬酸的解决方案准备TSB和添加(1:100)在一夜之间文化隔离和参考菌株(最终浓度相当于1/2麦克风话筒1/16)。菌株引起的生物膜生产双氯芬酸浓度相当于1/16的麦克风是检测药物浓度较低。控制在TSB没有药物。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba写明ATCC 43300和gydF4y2Ba美国epidermidisgydF4y2Ba写明ATCC 12228年,积极的和消极的生物膜生产,分别被用作参考菌株。gydF4y2Ba

均质化后,细菌悬浮液被播种在96 -平底聚苯乙烯微量滴定板(200gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)和孵化24小时35°C。文化被移除,井与蒸馏水清洗三次,和附加的细菌被固定为200gydF4y2BaμgydF4y2BaL甲醇15分钟。盘子清空,风干,染了15分钟了。200gydF4y2BaμgydF4y2BaL 2%的哈克结晶紫溶液。后的染料,盘子洗下运行蒸馏水和空气干燥。染料结合贴壁细胞中提取了200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL 95%的乙醇为30分钟,光密度(ODgydF4y2Ba_{570海里gydF4y2Ba}生物膜的提取测定。gydF4y2Ba

所有的实验进行了一式三份,至少重复三次。在每个板块、四井被用作空格只包含TSB媒介。截止OD值(ODc)用于区分生物膜生产商和nonproducer隔离被定义为三个标准差(SD)的平均OD -控制:ODc =平均OD -控制+ (3×SD -控制)(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。隔离与OD≤ODc视为nonproducers。OD的平均生物膜提取的结果被用来分类隔离的弱势生产者(ODc < OD≤2 xodc),温和的生产商(2 xodc < OD≤4 xodc),和强大的生物膜(4 xodc < OD) (gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.4。生物膜分离试验gydF4y2Ba

PIA-independent或PIA-dependent双氯芬酸诱导生物膜的性质矩阵评估使用降解测试metaperiodate钠(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。方法是基于MTP化验,如被Izano et al。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),做了一些调整。一夜之间隔离种植在TSB 35°C和稀释1:100年在TSB和药物(1/2麦克风话筒1/8)。然后,微量滴定板与200年被播种gydF4y2BaμgydF4y2BaL /细菌悬浮液和孵化24小时35°C。gydF4y2Ba

随后,文化被移除,井用蒸馏水洗净,和200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL 50 mM metaperiodate钠溶液(σ)在蒸馏水被添加到威尔斯一式三份。同等体积的蒸馏水没有退化代理添加作为一个控制。板块在35°C,孕育了两个小时,然后,井与蒸馏水洗两次。接下来的步骤之后的MTP测定生物膜中所描述的那些原则。gydF4y2Ba

PIA-independent或PIA-dependent组合矩阵的确定是基于生物膜降解水平metaperiodate和比较的OD值的存在有辱人格的代理人未经处理的控制。在这项研究中,生物膜与PIA-dependent成分被认为是遭受了解散的钠metaperiodate大于50%。一个类似的过程描述为metaperiodate用于蛋白酶K(σ)(1毫克/毫升0.1 PBS-pH 7.0);胰蛋白酶(Inlab)(1毫克/毫升em三20毫米,pH值7.5)(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),脱氧核糖核酸酶II型(σ)(100gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml 150毫米CaCl氯化钠和1毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.5。生物膜的组成矩阵的菌株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba与双氯芬酸结合其他潜在的生物膜生长在培养基诱导物gydF4y2Ba

四个阳性菌株的生物膜的形成是由双氯芬酸检测其他物质诱导生物膜生产的潜力。以前,的存在gydF4y2BaicagydF4y2Ba操纵子基因gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba被多重聚合酶链反应(PCR)检测,根据程序报告•德利马e Silva et al。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

测试的物质选择利福平,sub-MICs浓度、葡萄糖(1%)和生理盐水(3%)。sub-MICs下定了决心在浓度相当于以前的测试后1/2和1/4的麦克风(0.004gydF4y2BaμgydF4y2Ba和0.002克/毫升gydF4y2BaμgydF4y2Ba分别为g / mL)。利福平sub-MICs测定浓度相当于以前的测试后1/2和1/4的麦克风(0.004gydF4y2BaμgydF4y2Ba和0.002克/毫升gydF4y2BaμgydF4y2Ba分别为g / mL)。药敏测试之前执行表明这些菌株被利福平敏感。gydF4y2Ba

菌株生长的TSB包含每一个代理商,孤独和结合双氯芬酸(50或100年gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL)。此外,该菌株在TSB没有代理研究和TSB只有双氯芬酸。测试研究生产和生物膜的组成是由MTP化验,如上所述。gydF4y2Ba

2.6。实时定量PCR(存在)gydF4y2Ba

一个临床菌株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(SA139)选择评价的相对表达水平gydF4y2Ba莎拉gydF4y2Ba,gydF4y2BasigBgydF4y2Ba,gydF4y2BaicaA,gydF4y2Ba和gydF4y2BaicaRgydF4y2Ba基因。以前,的存在gydF4y2BaicaADBCgydF4y2Ba操纵子进行了研究,发现在这种应变,根据Ninin描述的技术et al。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。从基因库获得基因序列的网站(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)。在这项研究中使用的基因的引物设计的引物表达软件(应用生物系统公司©)。gydF4y2Ba

文化是生长在TSB介质在指数期之前的双氯芬酸溶液(50和80gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml,最终浓度)或同等体积的无菌甲醇(控制)和孵化20分钟。总RNA提取了基于phenol-chloroform方法在70°C (gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。然后,提取的RNA resuspended在15gydF4y2BaμgydF4y2Bal DEPC水,管涡三分钟。RNA纯度是评估spectrophotometrically NanoDrop2000系统(热费希尔科学)和RNA完整性验证了通过加载5gydF4y2BaμgydF4y2Bal的总RNA在1.4%琼脂糖凝胶含有1.0×此种缓冲区。此外,使用量子位RNA浓度测量gydF4y2Ba^®gydF4y2BaRNA BR检测设备(热费希尔科学)阅读使用量子位的反应gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba2.0荧光计(生活技术,热费希尔科学)。gydF4y2Ba

反转录的RNA提取进行了使用LifePro™梯度热循环(骏科技有限公司)和工具包TaqMangydF4y2Ba^®gydF4y2Ba逆转录试剂(应用生物系统公司),根据制造商的协议。存在是准备在96 - rt - pcr包含GoTaq板块gydF4y2Ba^®gydF4y2BaqPCR大师混合(Promega),根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是稀释(1:4),然后,10gydF4y2BaμgydF4y2BaL的GoTaqgydF4y2Ba^®gydF4y2BaqPCR大师,4gydF4y2BaμgydF4y2Ba(0.8 L的寡核苷酸引物组合gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),2gydF4y2BaμgydF4y2BaL DNAse-free水被添加。gydF4y2Ba

反应进行了一式三份,负控制准备每个底漆使用5寡核苷酸gydF4y2BaμgydF4y2BaL Milli-Q HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO DEPC而不是第一个互补脱氧核糖核酸链。在所有的实验中,gydF4y2BagyrBgydF4y2Ba基因作为内生反应的控制。生成的数据的分析中存在的反应是使用应用生物系统公司7500执行快速实时PCR系统(生命技术公司)和相对量化的方法内源性基因表达规范化的控制水平(2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba})。gydF4y2Ba

2.7。扫描电子显微镜(SEM)gydF4y2Ba

选择三个diclofenac-induced biofilm-producing菌株在盖玻片培养在没有双氯芬酸的TSB(控制)和双氯芬酸(50gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL)。一夜之间文化的简要,1:100稀释接种到24-well聚苯乙烯微量滴定板(2毫升/)。随后,无菌Thermanox塑料盖玻片(13毫米)(Nalgene-USA)放置在底部的每个。24小时后的孵化35°C,盖玻片从井用无菌钳,用PBS冲洗几次,然后用2%的戊二醛固定0.1甲次砷酸盐缓冲,pH值7.2,一个小时在4°C。额外的洗涤后,样本脱水与一系列的乙醇浓度增加,30%,50%,70%,80%,95%,30分钟,和纯乙醇一小时。最后,标本被涂上一层黄金(050年Baltec SCD)和检查使用扫描电镜设备(蔡司EVO 40)在20 kV。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。抗菌活性和双氯芬酸Sub-MICs对生物膜形成的影响gydF4y2Ba

双氯芬酸的抗菌活性测试50株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba。25个临床菌株中,7个被描述为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,虽然运营商菌株中,只有一个应变被确认为community-associated耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)。gydF4y2Ba

双氯芬酸的麦克风从200年到400年不等gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。为800的浓度gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL,药物抑菌的作用,而MBC是1600年gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。对生物膜生产四十隔离进行了测试。34 -生物膜生产菌株中TSB介质没有药物,补充与双氯芬酸促进生物膜生产的感应11人(6个临床菌株和5个航母隔离)。所有这些11隔离引起的sub-MIC 50gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL, 9也在100年被诱导gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。这些浓度相当于1/2麦克风或1/4麦克风或1/8麦克风取决于应变。gydF4y2Ba

图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了生物膜引起的生产水平不同浓度双氯芬酸的三个临床和三个菌株。A150应变,双氯芬酸诱导生物膜的生产在浓度低至3.1和1.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。这些浓度相当于麦克风和麦克风1/128,1/64。六株被认为是生物膜生产商TSB没有药物,和一个应变(A116) TSB双氯芬酸的加入,提高了生物膜的形成甚至只有3.1的浓度gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL的药物。在这个浓度,增加约32%(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.2。Diclofenac-Induced生物膜类型gydF4y2Ba

双氯芬酸诱导生物膜的类型特征基于退化的程度与metaperiodate治疗后,胰蛋白酶,蛋白酶K, DNAse。Metaperiodate是一种氧化剂,劈开氨基葡萄糖聚合物,如PIA的债券,然后有效地分散多糖生物膜与生物膜nonpolysaccharide对这样的待遇(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。胰蛋白酶酶和蛋白酶K降解生物膜与一个矩阵的蛋白质成分,而DNAse分散生物膜主要包括细胞外的DNA (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

两组的gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba菌株从运营商和分离的临床起源,所有生物膜sub-MICs诱导的非甾体抗炎药是nonpolysaccharides (PIA-independent)成分:蛋白质(6),protein-DNA(3),和DNA(1),在一个孤立的诱导生物膜分散的没有任何测试代理。A116应变,产生生物膜在TSB没有双氯芬酸和增加产量在药物的存在,metaperiodate分散生产的生物膜。因此,这种应变多糖成分的生物膜生长条件(PIA-dependent)。gydF4y2Ba

3.3。构成生物膜引起的双氯芬酸当结合其他诱导代理人gydF4y2Ba

四个菌株所产生的生物膜(A112, A139、A150 B103)进行评估后的增长diclofenac-supplemented媒体结合利福平sub-MICs,生理盐水(3%)和葡萄糖(1%)。这些菌株表明对利福平的药敏试验和拥有的gydF4y2BaicaAgydF4y2Ba和gydF4y2BaicaDgydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

利福平sub-MICs没有隔离A139诱导生物膜的生产,同时观察到高感应PIA-dependent生物膜(多糖)的其他三个隔离。均值(ODgydF4y2Ba_{570海里gydF4y2Ba})1/2麦克风的生物膜中提取利福平范围从1.263到1.659,双氯芬酸从0.368到0.515。gydF4y2Ba

多糖组成的生物膜引起的利福平与利福平+双氯芬酸,保持文化的生物膜控制隔离种植只与双氯芬酸保持原来PIA-independent组成(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。利福平的1/4麦克风+双氯芬酸,结果是相似的在1/2麦克风+双氯芬酸利福平,除了B103应变,结合药物导致的生产部分多糖生物膜(metaperiodate降解只有45%)。诱导的生物膜和利福平联合利福平+双氯芬酸是归类为强,与弱者只有双氯芬酸生物膜引起的。gydF4y2Ba

生理盐水没有诱导生物膜只有四分之一的隔离(SA112)。最初这一毒株,生物膜引起的双氯芬酸是由生理盐水+双氯芬酸抑制的。在两个菌株(A150和B103),生理盐水诱导PIA-dependent生物膜的形成。然而,在增长与生理盐水+双氯芬酸诱导生物膜显示部分多糖成分,生物膜分散的约30%和36%,分别在治疗后与metaperiodate(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。相反我们观察B103 A150隔离,氯化钠,结合双氯芬酸诱导只有PIA-independent A139生物膜的生产压力。gydF4y2Ba

对于血糖的影响,诱导产生PIA-independent四个分离株的生物膜进行了研究。这个结果是维护当菌株生长在中含有葡萄糖+双氯芬酸(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.4。实时定量PCR(存在)gydF4y2Ba

的相对表达水平gydF4y2Ba莎拉gydF4y2Ba,gydF4y2BasigBgydF4y2Ba,gydF4y2BaicaA,gydF4y2Ba和gydF4y2BaicaRgydF4y2Ba基因的菌株A139进行评估与双氯芬酸治疗后(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。的表达gydF4y2BaicaAgydF4y2Ba被压制在86%和54%浓度的50和80gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL,分别与控制表达式。相比之下,gydF4y2BaicaRgydF4y2Ba分别活动增加约5倍和3倍。双氯芬酸诱导的活动增加两个全球监管机构研究(gydF4y2Ba莎拉gydF4y2Ba和gydF4y2BasigBgydF4y2Ba)。浓度的50和80gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL的活动增加gydF4y2Ba莎拉gydF4y2Ba通过三次,两次,分别与控制,而增加了5.6和3倍,分别gydF4y2BasigBgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.5。扫描电子显微镜(SEM)gydF4y2Ba

B103, A139, A150菌株选择形态评价(SEM) diclofenac-induced生物膜(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在菌株生长Thermanox塑料薄膜表面的TSB中没有双氯芬酸(控制),图像显示很少粘细胞。相反,在培养中有50gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升的非甾体抗炎药,有大量的细胞聚集。放大的图像文化显示细胞聚集和少量的细胞外基质材料,主要在B03压力。无显著变化的形态学观察细菌细胞生长在中与非甾体抗炎药gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

细菌多药耐药性是一个日益增长的全球现象。新耐药机制已被描述为不同的细菌病原体。很难有效治疗常见的传染病与传统抗生素可用刺激了药物的抗菌作用的研究被称为“non-antibiotics”[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。这组药物包括双氯芬酸,一种非甾体抗炎药,已被证明有广谱抗菌活性在体外和体内gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。另一方面,它还没有被调查是否sub-MICs这种药物可以引起生物膜的形成,如对某些抗生素(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在目前的研究中,双氯芬酸的麦克风从200年到400年不等gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL,轻微的差异对于隔离(临床或载体)的起源。这些浓度远高于治疗血浆水平通常达到[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。然而,它应该考虑,在本地有外用制剂的非甾体抗炎药可以确定存在的浓度远远高于那些在等离子体系统使用的药物gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。因此,在这些条件下对微生物影响的可能性不能排除药物的相互作用。gydF4y2Ba

文献报道双氯芬酸的麦克风gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba值从50到1000 >gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL,这可能是由于内在的生理特征分离研究,以及方法论的程序,如为药物增溶、培养基、技术(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。MBC是只在1600年发现的gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升,因为电镀包含≤800整除TSA的井gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升与细菌生长导致斑点。这个结果与早期的发现相比,指出双氯芬酸的杀菌作用浓度低于1600gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

积极和消极分离生物膜生产的TSB介质进行测试来评估生产双氯芬酸sub-MICs对生物膜的影响。双氯芬酸诱导生物膜生产11 TSB 34 biofilm-negative隔离种植,和所有诱导生物膜显示nonpolysaccharide组成。这些结果添加新数据在药物可能引起生产nonpolysaccharide生物膜gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,因为这对双氯芬酸现象尚未报道。虽然双氯芬酸的浓度等于实现了对人类血清有限强有力的临床分离株的生物膜的形成gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba聚丙烯网状表面生长,Reśliński et al。gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)表明,菌株产生弱生物膜从(控制)的1.4%上升到10.0%(双氯芬酸)。然而,这种生物膜的化学性质并不是作者的特征。gydF4y2Ba

很大程度上决定这种效果的浓度相当于1/2麦克风,1/4麦克风,麦克风1/8,根据压力。在nonbiofilm生产菌株(SA150),诱导生物膜生产双氯芬酸浓度低至1.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。除此之外,在一个生产菌株(SA116),增加生物膜生产浓度从3.1gydF4y2BaμgydF4y2Ba观察药物的g / mL。重要的是要注意,这些等离子体中浓度水平,药物可以达到gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

nonpolysaccharide组成的生物膜矩阵双氯芬酸引起的,间接的决定在这个研究程度的退化与metaperiodate钠溶液处理后,表明药物激活PIA-independent通路产生生物膜。事实上,补充测试使用胰蛋白酶和蛋白酶K,除了DNAse,表明,诱导生物膜蛋白成分在大多数隔离,而其他人,eDNA-protein矩阵组成,埃德娜,或者不受所使用的分散剂。另一方面,自然产生的应变(SA116)生物膜在TSB没有药物,双氯芬酸决定增加多糖生物膜的生产。它表明,根据应变,非甾体抗炎药可能刺激gydF4y2Baica -gydF4y2Ba(PIA)依赖途径为了增加生物膜的生产。gydF4y2Ba

生物膜与PIA-independent细胞外基质与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株相关(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。在检测的临床分离株中,七是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,但双氯芬酸没有诱导生物膜生产这些菌株。没有其他研究diclofenac-induced生物膜的化学性质;然而,重要的是要注意,Dotto et al。gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)报道,非甾体抗炎药水杨酸的主要biometabolite乙酰水杨酸,促进了生物膜的形成gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaPIA-dependent。gydF4y2Ba

尚不完全了解生物膜矩阵如何应对不同的诱导不同代理。更好地了解生物膜的化学成分不同的条件可能是有用的策略引起的治疗与生物膜相关的感染,因为,例如,细胞生物膜蛋白矩阵有不同组织PIA-dependent生物膜的增长相比。gydF4y2Ba

四个隔离阳性生物膜诱导的双氯芬酸的效果进行评估将非甾体抗炎药与其他潜在biofilm-inducing物质(利福平、葡萄糖和氯化钠)。这些测试的目的是评估双氯芬酸的组合是否与这些物质可以诱导生物膜的组成变化矩阵和通路主导,是否PIA-dependent PIA-independent。gydF4y2Ba

结果表明,利福平刺激高多糖生物膜生产、孤独和结合双氯芬酸,表明激活的gydF4y2BaicagydF4y2Ba端依赖途径促进抗生素是强大到足以重叠gydF4y2BaicagydF4y2Ba由双氯芬酸实现独立的刺激。重要的是要注意,这种效应可以剂量依赖性,菌株的研究以来,低浓度的利福平的组合(1/4麦克风)与双氯芬酸导致生物膜的形成,只有部分多糖。gydF4y2Ba

与利福平,葡萄糖,葡萄糖的组合与双氯芬酸诱导nonpolysaccharide生物膜的形成。这个结果并不奇怪,因为这糖被认为是一个常见的催化剂通过PIA-independent途径[生物膜的生产gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。然而,有趣的是,双氯芬酸的组合+葡萄糖没有导致添加剂增加生物膜生产的刺激效应,而孤立地这些物质的影响。gydF4y2Ba

至于生理盐水,盐被认为是催化剂gydF4y2BaicagydF4y2Ba操纵子在non-MRSA菌株gydF4y2Ba41gydF4y2Ba与获得的结果),在协议的两个4隔离测试。然而,这两个产生的生物膜隔离在中补充生理盐水+双氯芬酸被metaperiodate分散不良(只有29%和36%),这表明,在这种情况下,更大的刺激激活的非甾体抗炎药gydF4y2BaicagydF4y2Ba独立的途径已经成为主流,而gydF4y2BaicagydF4y2Ba端依赖途径刺激生理盐水没有完全抑制,导致低PIA生产。另一方面,第三个隔离(A139)产生一个PIA-independent生物膜在氯化钠的存在和在中都含有这种盐和双氯芬酸,虽然这株之前显示的存在gydF4y2BaicagydF4y2Ba操纵子基因(gydF4y2BaicaAgydF4y2Ba和gydF4y2BaicaDgydF4y2Ba)。这个结果暗示的生物膜的规定生产的复杂性gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,因为它也可以包括特定于每个应变特征。gydF4y2Ba

获得的结果与存在某种程度上的表型结果证实生产diclofenac-induced PIA-independent SA139生物膜在压力。的相对表达gydF4y2BaicaAgydF4y2Ba表达下调了双氯芬酸治疗,而活动的gydF4y2BaicaRgydF4y2Ba大大增加。gydF4y2BaicaRgydF4y2Ba是一个消极的监管机构gydF4y2BaicaADBCgydF4y2Ba因为它结合了gydF4y2BaicaAgydF4y2Ba启动子区域(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。也观察到双氯芬酸增加全球监管机构的活动gydF4y2BasigBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba莎拉gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

sigBgydF4y2Ba,另一个σ因子的RNA聚合酶活性在应激反应,可以调节许多基因参与毒性,包括基因在生物膜的形成gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。虽然这个监管机构的影响gydF4y2BaicagydF4y2Ba转录可能取决于研究,劳德黛尔et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)表明,这是必不可少的gydF4y2BaicagydF4y2Ba独立的生物膜形成gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

莎拉,另一方面,是一种全球监管蛋白影响许多基因的表达gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,包括发病的基因多样性。这个监管机构似乎影响gydF4y2BaicagydF4y2Ba端依赖和gydF4y2BaicagydF4y2Ba独立的生物膜的形成(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。一个萨拉生产的作用机制gydF4y2BaicagydF4y2Ba似乎独立的生物膜相关的主要抑制细菌蛋白酶的能力,允许protein-dependent生物膜的形成(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

放大扫描电镜图像证实了感应SA139应变PIA-independent生物膜生产的双氯芬酸。小细胞外物质的存在。根据Vergara-Irigaray et al。gydF4y2Ba51gydF4y2Ba),细胞的形态可视化通过SEM PIA-rich生物膜矩阵是不同于蛋白质的生物膜。作者表明,在PIA-dependent生物膜的情况下,细胞是嵌入在一个丰富的细胞外基质网互联的细菌。然而,细胞生长蛋白质的生物膜形成的FnBP显示致密细菌总量与细胞之间的密切接触,没有明显的细胞外的非晶态矩阵。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

双氯芬酸表现出相对较高的MIC值(200 - 400gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL)的压力测试,和杀菌活动只有在发生浓度大于800gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升。此外,本研究首次表明,双氯芬酸sub-MICs可以诱导nonpolysaccharide生物膜的生产菌株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaTSB不利于生物膜生产,表明这种药物激活PIA-independent通路gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba。然而,在自然菌株生产PIA-dependent生物膜在TSB双氯芬酸以外的添加剂,药物可以刺激生产的增加这种类型的生物膜。gydF4y2Ba

尽管有限数量的压力研究,结果表明,如果加上其他潜在的生物膜诱导双氯芬酸,如利福平sub-MICs或生理盐水,生物膜的组成矩阵可能显示变化可能取决于类型的诱导刺激或菌株的特性。这种刺激可能导致PIA-dependent或只是部分多糖生物膜的形成。相比之下,当双氯芬酸与葡萄糖结合,生成的生物膜保持PIA-independent成分观察双氯芬酸,也许是因为物质激活一个途径生物膜的形成。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢UNIRIO学生奖学金。作者也非常感谢埃内斯托博士而阅读手稿和有价值的贡献。gydF4y2Ba

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