文摘

氟喹诺酮类原料药(fq)抗生素用于治疗耐药结核病,但FQ-resistant突变体可以选择迅速。虽然在DNA促旋酶突变的主要原因是这种阻力,五肽蛋白被发现提供低级FQ耐药性革兰氏阴性细菌。MfpA五肽重复蛋白守恒在分枝杆菌染色体,在邻近的一组四个高度保守的基因称为conservon。我们想描述的转录调控mfp一个基因及其表达与环丙沙星抗性m . smegmatis。反转录PCR显示mfp一个包含的基因操纵子的一部分conservon基因。使用一个转录融合,我们表明,位于5′的启动子mfpEA操纵子。我们确定启动子活性在不同生长条件下,发现操纵子的表达增加略有增长阶段末在subinhibitory基本pH值和环丙沙星的含量。最后,通过克隆mfp基因的诱导向量,我们表明,诱导表达mfp环丙沙星最小抑制浓度的增加。这些结果证实的表达增加mfp一个基因的一部分mfpEA操纵子,增加耐环丙沙星m . smegmatis。

1。介绍

氟喹诺酮类原料药(fq)是最重要的抗生素药物疗法用于治疗耐多药结核病(mdr - tb) (1]。他们施加强大的杀菌活性,能够穿透巨噬细胞,tuberculosis-causing结核分枝杆菌杆菌居住(2]。然而,关于FQ预订使用,因为耐药突变体可以选择在一个非常短的时间内(1]。fq的目标是DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶IV。分枝杆菌只包含旋转酶,它催化作用消极成为超螺旋的细菌DNA (2],大多数FQ阻力是由在几个关键的氨基酸替换位于喹诺酮Resistance-Determining地区(QRDR) GyrA GyrB子单元,虽然射流泵也被卷入的发展阻力(3- - - - - -5]。

FQ阻力的另一个新颖的机制涉及到蛋白质属于五肽重复家庭(脉冲)。革兰氏阴性细菌的基因qnr家庭五肽编码蛋白质,通常发现传染性质粒并赋予低级FQ电阻(6- - - - - -9]。五肽的蛋白质家族几乎完全是由重复五个氨基酸基序,其中每一个第五个氨基酸是亮氨酸或苯丙氨酸(10]。五肽最初与FQ阻力时发现一个包含的质粒mfp(分枝杆菌耐氟喹诺酮类蛋白质)的基因分枝杆菌smegmatis增加中等收入国家对环丙沙星和sparfloxacin细菌。这个基因编码192个氨基酸的蛋白质32五肽在串联重复11]。在结核分枝杆菌,基因房车3361 c编码五肽蛋白(称为MtMfpA)的183个氨基酸,氨基酸的身份与67%m . smegmatisMfpA。MtMfpA蛋白质的结构是一个右手螺旋的大小、形状、电荷分布让人想起b形式的DNA,有人建议MfpA可能与DNA结合的DNA促旋酶。只因为FQ时促旋酶与DNA结合,绑定的MfpA促旋酶可以防止促旋酶DNA的形成复杂,或取代DNA FQ-inhibited复杂,从而释放FQ促旋酶的抑制,从而产生抗性(12]。

非常保守mfp一个基因被发现在所有已知的分枝杆菌基因组的染色体(10]。他们的生物学功能尚不清楚,但他们有在他们的5′端由一群四个高度保守的基因,称为conservon,还发现了其他一些放线菌、细菌分枝杆菌所属的类。Conservons似乎监管单位,应对未知的信号,在单位和第五个基因,mfp发现,不同其他放线菌(13]。

因为fq的重要药物治疗耐多药结核病患者(14,15),我们试图阐明五肽的作用蛋白质FQ抗性的遗传特性mfp一个基因在m . smegmatis。我们发现mfp一个基因是一个转录单位的一部分与四个上游conservon基因。此外,我们表明,该操纵子启动子区域,称为mfpEA的5′端mfpE基因。最后,mfp基因克隆到一个诱导向量增加其表达式,从而确认增加表达导致FQ阻力增加。结果显示MfpA和FQ阻力之间的可能联系米。smegmatisFQ耐药性,这可能有重要意义米。肺结核。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株和质粒

埃希氏杆菌属杆菌XL1-Blue,用于克隆,生长在Luria-Bertani 37°C(磅)肉汤或磅琼脂(Difco™,猫。美国244520号)。分枝杆菌smegmatis麦德布鲁克7株生长在37°C h9肉汤(Difco™,猫。美国271310号)或7 h10琼脂(Difco™,猫。美国262710号)补充了渐变(0.05%)、甘油(0.2%),和外形尺寸(10%)。在这项研究中使用的质粒和菌株中描述表1。

2.2。DNA操纵

基因组DNA的米。smegmatis被孤立被范Soolingen et al。19]。大肠杆菌是根据Hanahan electroporated et al。20.),而米。smegmatis雅各布斯是electroporated协议后et al。21]。

2.3。克隆

一个转录的假定的启动子区域之间的融合mfpEA操纵子和虫胶pJEM15 Z基因是由PCR扩增片段的5′端326个基点mfpE基因引物mfp5和mfp11(图1、表1和2),并将它插入到Kpn我在质粒pJEM15限制网站。的mfp一个基因被插入到表达载体宫与引物mfp16和mfp17(图放大1、表1和2)和消化Bam你好,班即产生的结构被测序验证(Macrogen、韩国)使用相应的引物(表2)。

2.4。启动子活性测定

启动子活性的转录融合评估的活动在媒体7 h9渐变检测β-半乳糖(0.05%)、甘油(0.2%),和外形尺寸(10%)。分枝杆菌smegmatismc²155年与质粒electroporated pJEM15 - 5.11和向量pJEM15(表1)。启动子活动是由相对荧光检测单位(RFU)由水解C2FDG (5-acetylamino di-beta-D-galactopyranoside)衬底(美国或分子探针)。试验是由每个菌株接种到5毫升的7 h9补充与卡那霉素(25μg / ml)和孵化37°C 3天的风潮。随后,0.1毫升的这些文化被接种到10毫升的7 h9与卡那霉素(25μg / ml)和孵化与搅拌直到达到OD 37°C_600海里0.5。荧光化验进行96 - 90微量滴定板使用μl(∼0.5×104个细胞/)的文化(以前1:10稀释⁴)和10μl的C2FDG荧光团(33μ米)。细菌潜伏在该衬底在37°C为96小时,在此期间β牛乳糖活动检测到激动人心的波长在530±485±20 nm和测量发射25日使用SpectraMax®双子座XS仪器(分子器件、钙、美国)22]。同时,分枝杆菌增长之后测量OD_600海里作为时间的函数。这些分析都是一式三份,结果显示每个测量的标准偏差。

2.5。在不同的生长条件评价的推广活动

启动子的活性mfpEA操纵子在不同条件下评估如上所述,做了一些调整。分枝杆菌smegmatismc²155年与质粒转化pJEM15 - 5.11和向量pJEM15(表1)和种植在不同的条件:96小时7 h9 7 h9补充与环丙沙星(0.125μg / ml)和7 h9调整pH值8.0的集中氢氧化钠,然后通过一次性polyethersulfone过滤消毒过滤孔径0.45毫米(23]。这些分析都是一式三份,结果显示每个测量的标准偏差。

2.6。诱导表达MfpA

MfpA表达诱导据他说et al。18]。在短暂的,米。smegmatis菌株用于测定(mc²155年和mc²155年gyr,见表1)与宫殿或electroporated -mfp(表2),生长在7 h9补充1%的葡萄糖。然后他们被洗一次7 h9汤没有葡萄糖和resuspended OD_600海里1.0在7 h9培养基缺乏葡萄糖。感应是通过添加乙酰胺的最终浓度0.02%和孵化一夜之间不断搅拌。控制没有乙酰胺在平行设置(18]。随后,20μl (10⁻⁴和10⁻⁵稀释是镀h10 7日补充了潮霉素(50μg / ml),乙酰胺(0.02%)和环丙沙星浓度增加(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 64 yμg / ml)。这些化验是一式三份完成。我们作为积极的和消极的控制抗生素潮霉素(50μg / ml)和卡那霉素(25μ分别g / ml)。

2.7。RNA提取和逆转录PCR

总RNA从米。smegmatis是孤立的如前所述24从细菌生长OD)_600海里0.5。残余DNA的分枝杆菌总RNA准备被使用DNase我根据制造商的指示(Sigma-Aldrich, Inc .,达姆施塔特,德国)。控制没有逆转录酶(NRT)是用于与引物PCR反应16 s rRNA (25)(表2)确认完成DNA切除。M-MuLV逆转录酶(美国新英格兰生物学实验室,MA)和随机引物9(美国新英格兰生物学实验室,MA)(表2)被用来产生cDNA根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是用来放大mfp基因,一式三份,使用ThermoPol®(美国新英格兰生物学实验室,MA)和特定的引物(见图1和表1:mfp艾德,mfp直流,mfpCB,mfp英国航空公司,mfpA)。PCR扩增后,碎片与扩增引物测序在正向和反向方向(Macrogen、韩国)。

3所示。结果

3.1。识别的mfpEA的操纵子分枝杆菌smegmatis

我们第一次用rt - pcr确定mfp是一个转录单位的一部分,四个上游conservon基因(mfpE,mfpD,mfpC,mfpb .参见图1和表2)。放大了221 bp的片段mfp一个基因(图2(一)),以及相应片段之间的区域mfpE和mfp(4712个基点,见图2(b)),mfpE和mfpD(312个基点),mfpD和mfpC (341 pb),mfpC和mfpB(311个基点),mfpB和mfp(375个基点)(图2(一)),这表明五个基因属于同一转录单位,我们的术语mfpEA操纵子。

3.2。启动子活性的mfpEA操纵子

326个基点片段包括的5′端mfpE基因克隆在promoterless面前虫胶Z基因向量pJEM15获得转录融合质粒pJEM5-11(图1、表1)。随后,米。smegmatismc²155株含pJEM15(控制)或pJEM-5-11(表1)是生长在7 h9肉汤C2FDG衬底(0.33μ米),启动子活性测定的水解产生的荧光C2FDG苷。与质粒产生的荧光pJEM-5-11(灰色圆点)表明,克隆片段包含启动子的活性与细菌生长(黑点)(图3)。

启动子活性也评估在不同的生长条件(见材料与方法)。7 h9增长略有增加表达式被媒体(图8.0 pH值4(一)与subinhibitory)和环丙沙星浓度(0.125μg / ml)(图4 (b)),但是只有在96小时的增长。

3.3。确定之间的关系mfp和环丙沙星耐药

确定之间的关系mfp和环丙沙星阻力,mfp一个基因被克隆到宫殿向量建立质粒-mfp一个(图1、表1和2),的mfp一个表示从乙酰胺诱导启动子。中等收入国家的两个菌株之间的环丙沙星进行了比较米。smegmatis包含空向量或宫殿-mfp答:野生型(mc²155)和mc²155年gyr一个D94G(表2)。的感应mfp表达与乙酰胺产生耐环丙沙星在增加米。smegmatis菌株。野生型菌株的耐药性抗生素增加了四倍,而在突变的菌株gyr一个基因,它增加了两个(表3)。

麦克风的相对变化表示通过(2)/(1)的关系。

4所示。讨论

我们已经证明了五肽基因编码mfp是第五个基因的转录单元还包含的四个基因conservon,mfpEDCB。我们把这种现象称为mfpEA操纵子。我们还证实,转录的增加mfpFQ阻力增加,即使在一个包含FQ resistance-conferring应变gyr一个突变。虽然conservons也发现在其他几个放线菌,只有在它们位于分枝杆菌5′五肽编码基因(10]。从域确定的四个conservon编码蛋白质,单位似乎监管功能:mfpB是类似于一个信号识别颗粒GTPase受体β亚基;mfpC包含helix-turn螺旋图案;mfpD是类似于监管机构与Ras-like GTPase活性;和mfpE是类似于信号转导组氨酸激酶(13,26,27]。

氟喹诺酮类原料药法案通过抑制促旋酶的活动,冻结DNA促旋酶与DNA双链断裂复杂,不能降级。acetamide-induced启动子,我们表明,增加mfp表达增加了FQ麦克风,也许,已经提出,通过模仿和替代染色体DNA,从而释放DNA被困在gyrase-FQ复杂(10,28,29日]。mfp一个已被证明与DNA促旋酶相互作用,一个重要的atp酶酶介绍负超螺旋DNA分子。因为第四分枝杆菌不包含拓扑异构酶,促旋酶可能还执行其功能decatenating两个联锁循环产生的染色体DNA复制。因为它必须执行这两个函数,其中一个是与DNA复制、表达或可能MfpA及其与促旋酶的交互活动的监管conservon单位,但是没有一个条件我们测试似乎大大增加的转录mfpEA操纵子。我们认为,用环丙沙星促旋酶的抑制可能导致增加的转录mfpEA操纵子减轻药物的影响,但我们发现启动子活动只是一个轻微的增加后96小时的文化。其他研究已经表明,的表达qnr基因随SOS反应(30.),和FQ已被证明引起SOS反应(31日),但子活动增加96小时后没有出现典型的SOS反应。我们初步得出这样的结论:如果conservon在某种程度上调节mfp活动,监管不是在转录水平。这是可能的mfpEA操纵子有额外的内部监管的推动者,或conservon行为在转录后的水平通过某种方式调制MfpA函数通过GTPase或atp酶活动的变更建议的保守域conservon假定的蛋白质编码的基因mfpB和mfpD,分别。

与虫胶Z融合,我们发现有一个启动子上游的mfpE表达整个操纵子,包括mfp,但子主题在分枝杆菌是异构的,我们不能确定假定的启动子的序列(32]。然而,任何突变,增加推广活动将提高mfpFQ表达式,从而增加阻力。在结核分枝杆菌的安排mfpEDCBA基因是一样的m . smegmatis,mfp被证明能增加FQ阻力米。肺结核家庭成员米。宝波士顿咨询公司(11]。mfp可能因此导致内在的抵抗fq水平米。肺结核(3),和任何的突变mfpEA发起人,增加其表达会增加FQ阻力。如果出现这些突变与FQ抵抗旋转酶的突变株,他们可能会在一种添加剂的方式增加麦克风。我们发现,诱导表达mfp翻了一倍了环丙沙星在应变包含麦克风gyrD94G突变,一个高级FQ耐药菌株的耐药性突变经常发现结核分枝杆菌。另外,如果突变扩充的表达mfpQRDR之前发生突变,这可能增加fq的耐低水平,从而增加高层抵抗旋转酶突变的频率。然而,据我们所知,突变mfpEA操纵子没有耐药中描述米。肺结核,尽管尚不清楚这种操纵子一直被视为一个网站值得仔细检查。

5。结论

的mfp一个基因,编码五肽MfpA,第五的基因mfpEA包含的四个基因操纵子conservon,mfpEDCB,表示从一个启动子位于5′mfp大肠的过度mfp一个基因增加耐环丙沙星米。smegmatis,甚至在与高层FQ-resistance菌株gyr一个突变。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章,可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者想表达他们的感谢卡洛斯博士Sanz检查英文的手稿。这项研究是由Direccion一般de Investigaciones大学圣地亚哥卡利在电话没有。01 - 2021,Potts纪念基金会,西班牙Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC)。