生产、优化和表征的丝状真菌固态发酵酸性蛋白酶

文摘

酸蛋白酶代表一群重要的酶,广泛应用于食品和饮料行业。有需求增加酸性蛋白酶适应工业极端环境,尤其是低博士因此,这就需要寻找一个更好的从真菌酸性蛋白酶,最好在工业条件下执行。真菌分离株的分离出葡萄和乳制品农场土壤使用马铃薯葡萄糖琼脂和进一步筛选蛋白酶生产基于明确区脱脂牛奶琼脂的水解。潜在的真菌被受到二次筛选下固态发酵(SSF)。二次筛选后,潜在的真菌鉴定到属级的宏观和微观的方法。潜在的真菌的生长条件和媒体组合在社保基金进一步优化。粗酶产生的潜在的部分纯化后分离为特征的丙酮和硫酸铵沉淀。总共9真菌分离株显示蛋白酶生产在初级和二级筛查;然而,一个潜在的隔离(Z1BL1)被选为进一步研究基于其蛋白酶活性。属的分离被确认曲霉属真菌基于形态学特征。获得了最大的酸性蛋白酶的分离Z1BL1使用发酵媒体含有麦麸作为固体基质,1毫升的3.210⁶接种体大小、含水量50%,pH值在120 - 4.5 h孵化30°C。acetone-precipitated酶表现出最大活动50°C和未来保持温度和酸度与稳定5 4 - 6°C。因此,从产生的酸性蛋白酶曲霉属真菌显示合适的酶特性要求在业界和可能是一个候选人进一步净化后在食品工业中的应用。

1。介绍

蛋白酶是最基本的酶从生物技术的角度,他们催化水解肽债券(1,2]。蛋白酶酶约占全球总数的65%销售,他们是由一组复杂的酶和底物特异性等一些属性的不同,催化机理、温度、pH值和最适条件和稳定配置文件(2]。

天冬氨酸的蛋白酶(EC 3.4.23),也被称为酸性蛋白酶,是肽链内切酶的亚科,孤立的从不同来源,包括病毒、细菌、真菌、植物和动物(1]。几个真菌天门冬氨酸蛋白酶纯化和表征rennin-like和pepsin-like酶(3]。rennin-like酶是由Endothia parasitica(EC 3.4.23.22 endothiapepsin),毛霉菌,Rhizomucor物种(mucorpepsin EC 3.4.23.23)。pepsin-like酶包括aspergillopepsin (EC 3.4.23.18 aspergillopepsin我)曲霉属真菌物种(4)和rhizopuspepsin (EC 3.4.23.21)根霉物种(1]。

大部分的天冬氨酸的蛋白酶(Aps)显示,最好的活动在低pH值(酸碱度3 - 4),等电点的pH值范围3 - 4.5 [5]。由hexapeptide抑制链霉菌属这包含两个他汀类药物残留物称为抑肽素。天冬氨酸的蛋白酶也敏感diazoacetyl-DL-norleucine甲酯(丹)和1,2-epoxy-3 - (p-nitrophenoxy)丙烷(EPNP)铜离子的存在。微生物酸性蛋白酶表现出特异性对芳香族或笨重的氨基酸残基两岸的肽键,这类似于胃蛋白酶,但他们的行动比胃蛋白酶(不太严格的5]。

酸性蛋白酶已经广泛的应用于各种行业,如食品工业、饮料工业,制药工业5]。增加这些酶的重要性及其众多不同行业的应用提高了努力研究酸性蛋白酶从真菌与增强的活动。短缺的植物和动物蛋白酶,以满足当今世界需求的工业酶已经指示微生物蛋白酶(增加兴趣5,6]。不同的生态位在埃塞俄比亚和很少报告真菌的存在酸性蛋白酶从埃塞俄比亚(7)需要寻找潜在的真菌分离株与改善酸性蛋白酶活性。因此,本研究旨在孤立和屏幕真菌从土壤样品生产,优化和酸性蛋白酶的特性。

2。材料和方法

2.1。研究区域的描述

共有21个土壤样本收集的奶制品和葡萄农场在三个地区的埃塞俄比亚,我。e, Amhara地区(Shewa Robit);Oromia地区(Ziway);和南部国家,民族,人民地区(Halaba)。Shewa Robit位于100年06′650年“-090”57′957 N, 0390 54′37“-0390”56′579 E,在北Shewa地带的阿姆哈拉地区国家,埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴以北225公里。这是一个低的土地(submoist温暖)地区海拔1120至海拔1350米不等。研究区域的气候数据记录在过去的十年年均最高和最低温度和降水量的32.1和16.1°C和968毫米,分别。最主要的土壤类型在Shewa Robit变性土,粘土的纹理的粘土含量为56%和10%,淤泥34%,pH值为8.02 (8]。

第二个研究区域Ziway位于7.58°N纬度和经度38.43°E Oromia地区的南部州位于东非大裂谷中期,亚的斯亚贝巴以南160公里。分类是根据半干旱,最低平均气温为12.7°C和最大平均温度为27.2°C的相对湿度为60%。该地区有一个高度海拔1500至2000米不等。平均年降雨量范围从650到750毫米,和之间的分布是高度可变,在年。变性土是主要的土壤类型与sand-silt-clay 33的部分:48:18日分别,pH值为7.88 (9]。

Halaba特区位于南部国家,民族和民族地区(SNNPR), 85公里的距离从亚的斯亚贝巴Hawassa镇和310公里,埃塞俄比亚的首都(图1)。研究网站是发现在一个高度从海拔1554到2149米,和一个天文位置38°7′0“E经度和7°18′0”N纬度。Halaba特区通常指的是干燥的气候条件与大约86%话(law-land Weinadega)和14%(可乐)区。研究的年平均降雨面积从857到1085毫米,而年平均温度变化从17到20°C的平均值18°C (10]。

2.2。样品收集

五百克的土壤表面(5 - 10厘米以下)收集葡萄农场和牧场的无菌区域位于昭和Robit, Ziway, Halaba,埃塞俄比亚,2019年9月。土壤样本已筛(3 - 4毫米的网),均质,并存储在4°C生物系的微生物实验室,德勃雷Berhan大学为进一步使用的协议被李et al。11]。

2.3。隔离的真菌

真菌被连续稀释分离技术被描述为Oyeleke et al。12]。因此,10克的土壤样本和90毫升蒸馏水混合和均质搅拌20分钟。他们准备适当的稀释0.1毫升的样品悬挂在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)镀(Microgen、印度)板块含有氯霉素(0.05 g / L)。板块在30°C 5 - 7天孵化隔离独特的殖民地。每个殖民地都那么多尝试在同一介质纯度和保存在4°C。

2.4。初级筛查Protease-Producing真菌

主要筛选蛋白酶生产测试使用脱脂牛奶琼脂(雀巢TM,法兰克福,德国)媒介生产的清除区(13]。检测介质(脱脂牛奶琼脂,SMA)准备使用20 g的脱脂牛奶,20 g的每个在200毫升蒸馏水溶解琼脂,和600毫升0.2磷酸盐缓冲剂(K₂HPO₄和KH₂阿宝₄,pH值5.0)。所有这三个媒体组件分别热压处理过的避免凝结和烧焦的牛奶由于缓冲盐的存在,后来在无菌条件下混合。盘子被随后接种菌丝5-day-old文化和孵化30°C 2天。板块进行清算的形成区域的洪水用10%三氯乙酸溶液(TCA)或10%的丹宁酸。相对酶活性是使用以下公式计算: 意图:相对酶活性,CZD:清除区直径,和CD:菌落直径(13,14]。

2.5。二级筛查酸性蛋白酶在固态发酵

2.5.1。剂制备

真菌分离株生长在PDA和孵化30°C 5天。他们取消了使用10毫升无菌蒸馏水孢子悬液做准备。0.5(10毫升的孢子的解决方案⁶孢子/毫升)是根据研究使用Sathya et al。15]。

2.5.2。媒介和文化条件对真菌固态发酵(M1)

固态发酵,0.5毫升的孢子悬液(10⁶孢子/毫升)转移到250毫升厄伦美厄烧瓶内含有麦麸(10克),脱脂奶粉(2.0 g),和10毫升的盐溶液(2.0 g / L:知道₃;0.5,MgSO₄h·7₂O;1.0,K2HPO₄;0.439,ZnSO₄h·7₂O;1.116,FeSO₄h·7₂O;0.203,MnSO₄h·7₂O, pH值5)[15]。烧瓶孵化在30°C在静态条件下6天。

2.5.3。媒介和文化条件对真菌固态发酵(M2)

固态基质也准备在250毫升厄伦美厄烧瓶内包含10 g的麦麸(硬质小麦麸皮)湿通过添加12毫升盐酸(0.2米)和混合。然后,烧瓶在121°C热压处理过的30分钟。然后,0.5毫升(10⁶孢子/毫升)孢子悬液接种到社保基金媒体和孵化在30°C 6天16]。

2.6。酶提取

酶提取根据问题描述的方法et al。17]。因此,发酵基质分散在100毫升蒸馏水(1:10 Bran-solvent比w / v)和大力摇晃旋转瓶(MaxQ 2000瓶露天平台;美国ThermoFisher科学)在室温下240 rpm 40分钟,使用棉布过滤。然后过滤离心机(NF200, 2009年,SN 02 - 4005,土耳其)在10000 x g, 4°C 10分钟。上层清液用作粗酶。

2.7。酸蛋白酶活动的分析

蛋白酶活性测定使用血红蛋白作为底物(18]。酶制剂(0.5毫升),适当稀释,混合1毫升的2% (w / v)血红蛋白在100毫米甘氨酸盐酸缓冲(pH值3.0),混合是孵化在50°C水浴10分钟。三氯乙酸反应终止通过添加2毫升5% (w / v)。混合物被允许站在室温下15分钟,然后离心机(NF200, 2009年,SN 02 - 4005,土耳其),享年10000岁×g 15分钟去除沉淀。可溶部分的吸光度测量在280海里。一个标准曲线使用酪氨酸生成解决方案。一个单位的蛋白酶活动被定义为所需的酶解放1μ在实验条件下每分钟克酪氨酸。酪氨酸酶的标准曲线和蛋白酶活动计算。

2.8。酪氨酸标准曲线

酶的蛋白酶活性决定使用酪氨酸标准曲线。吸光度标准酪氨酸的解决方案(酪氨酸在0 - 250的解决方案μg / mL)为280 nm (一个280)使用分光光度计(紫外- Liantrinsat, Model-CF728YW-UK)。然后,一个标准曲线绘制使用OD阅读和酪氨酸浓度(图1)。样品的OD阅读(试验进行了使用真菌蛋白酶)被转换为解放氨基酸(酪氨酸)使用公式产生的标准曲线。最后,在测定酪氨酸解放被转换为蛋白酶活动使用以下公式: PA:蛋白酶活动,µ试一试:µ克酪氨酸相当于释放,V_t在mL:总量的测定,V_年代:样品体积,T:反应时间在几分钟内,V_一个:用于吸光度测量体积的测定。

2.9。测定牛奶凝血活性

牛奶凝结活动决心根据Arima方法等。19),基于视觉评价第一凝血片的外观,并表示在索格利特单位(SU)。一个索格利特单元定义为血栓1毫升的底物的酶量在40分钟35°C。执行分析,0.1毫升的样本添加到一个玻璃试管中包含1毫升的重组脱脂牛奶的解决方案(10 g脱脂奶粉溶解在100毫升0.01 CaCl₂解决方案)在35°C pre-incubated 10分钟。混合物是混合好,凝血时间t(s)测量使用天文钟。凝血活性是使用以下公式计算: 在哪里D稀释因子和吗t凝血时间以秒为单位。

2.10。形态特征

文化特征(菌落生长速率、殖民地纹理、菌落颜色菌落大小、孢子形成和程度)的真菌分离株接种在Czapek研究了阿霉素琼脂(CDA),马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),麦芽提取琼脂(MEA)作为描述Zulkifli和扎卡里亚20.]。的微观结构隔离后在显微镜下观察准备幻灯片上文化和鉴定到属水平基于物种描述(21,22]。

2.11。优化文化环境和媒体组成的生产酸性蛋白酶在社保基金

2.11.1。实验装置的初步筛查生产酸性蛋白酶在社保基金

固态发酵的实验装置是根据Fernandez-Lahore研究et al。16)与轻微的修改。两种类型的发酵媒体被用于固态发酵。1日媒体包含10 g的麦麸(WB)和2 g的脱脂奶粉湿12毫升盐酸(0.2米)。第二媒体包含10 g的麦麸(WB)和2 g的脱脂奶粉湿10毫升矿物的解决方案。烧瓶被孵化30°C六天。

2.11.2。基质对酸性蛋白酶的影响生产

筛选媒体组成的酸性蛋白酶的生产是由one-variable-at-a-time方法(22,23]。因此,0.5毫升的孢子悬液(10⁶从潜在的真菌孢子/毫升)隔离被接种到含有10克的衬底(麦麸、米糠)于250年由12毫升盐酸厄伦美厄烧瓶内湿(0.2米)/盐溶液和孵化30°C 144 h。粗酶提取如前所述,化验酸性蛋白酶活性。测试后基质酶生产的影响,最高的酶底物被选为进一步优化和测试。

14。培养时间的影响

培养时间的影响对酸性蛋白酶生产研究了接种含有麦麸的烧瓶,最好的衬底,0.5毫升的孢子悬液(10⁶孢子在30°C /毫升)和孵化不同时期从24小时到144小时(23]。酸蛋白酶活动被确定为表示节2。7。

2.11.4。孵化温度的影响

真菌孢子接种到社保基金中250毫升厄伦美厄烧瓶内的温度孵化20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C 120 h来确定最适温度。然后,获得最佳温度是用于进一步的研究23]。

2.11.5。接种体大小的影响

接种体大小的影响对酸性蛋白酶生产研究了接种0.2毫升,0.5毫升,1毫升,1.5毫升,2毫升(3.2×10⁶孢子/毫升)孢子悬液进入社保基金媒体。然后,接种烧瓶孵化的最适温度为120 h (23]。

2.11.6。水分含量的影响

初始含水率的影响酶生产测试用蒸馏水湿润基质含水率不同的比例为45%,50%,55%,60%,65%,70%发现酶生产的最佳比例(24]。

2.11.7。最初的媒体pH值的影响

最初的媒体pH值的影响酸性蛋白酶生产优化通过调整社保基金中pH值2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,和7.0使用盐酸或稀释的氢氧化钠(23]。

2.12。局部净化

2.12.1。丙酮沉淀

粗酶提取与冷丙酮沉淀(丙酮或75%丙酮)。两卷的冷丙酮慢慢添加到提取,和沉淀被允许接受1 h−18°C允许完整的降水。沉淀蛋白质被隔开离心法在10000×g和4°C 10分钟。露天的颗粒是干30分钟去除微量的丙酮和溶解在0.02磷酸盐缓冲剂,pH值6.0 [26]。

2.12.2。硫酸铵沉淀

粗酶提取与硫酸铵沉淀根据Nouani研究et al。26]。因此,300毫升的粗提取液加入1200毫升饱和硫酸铵沉淀(100%)。然后,酶解提供了一个晚上在4°C和离心机10000 g×10分钟在4°C,和颗粒悬浮在磷酸缓冲(0.02 M;pH值6)。

2.13。酶的特性

2.13.1。确定最佳pH值和其稳定性

研究了酶制剂的最佳pH值在2.0 - -7.0的pH值范围50^oC使用2% (w / v)血红蛋白如前所述。为研究pH值稳定,粗酶在不同的pH值的缓冲区孵化的pH值3.0 - -7.0范围1 h在4°C。残余蛋白水解活性当时在标准试验条件下决定。以下使用缓冲系统:100毫米glycine-HCl缓冲pH值为3.0和3.5,100毫米醋酸钠缓冲pH值为4.0 - -6.0,和100毫米磷酸钾缓冲pH值为6.5和7.0 (22]。

2.13.2。确定最适温度及其稳定性

研究温度的影响,蛋白水解活性测试在不同的温度下(20、25、30、35岁,40岁,45岁,50岁,55岁,60岁,65°C)为5分钟使用血红蛋白作为衬底pH值5.0。孵化酶热稳定性是研究的30岁,40岁,50岁,60岁,70°C 60分钟。60分钟后,剩下的酶活性在最佳pH值和温度决定的。不作酶被认为是100%22]。

2.14。数据分析

数据分析使用SPSS软件,版本23(卡里数控USA Inc .)。所有的实验都进行了一式三份。方差分析(方差分析)和手段比较是通过SPSS和SigmaPlot,版本12。

3所示。结果

3.1。Protease-Producing真菌的主要筛选

总共32(32)真菌隔离孤立从土壤样本,其中12个分离株(38%)显示清除区水解脱脂牛奶琼脂媒体主要筛选。真菌分离株是显示显著的清除区直径和相对酶活性(REA)从6.7毫米和21.3毫米和0.4和0.74之间,分别(表1)。在隔离中,最高的意图被隔离H1W1记录(0.8)和Z1BL1(0.74)(表1)。所有12个隔离的孢子浓度确定使用纽鲍尔室和1.2×10之间的范围⁶和4.4×10⁸孢子/毫升(表1)。

3.2。二次筛选的酸性蛋白酶在固态发酵(SSF)

所有十二个隔离显示一个相对蛋白酶活动≥0.4受到进一步筛选固态发酵。十二个隔离,9隔离显示一个酸性蛋白酶活动下社保基金(表2)。蛋白酶活性最高(78.2 U /毫升)从孤立Z1BL1被记录,而蛋白酶活性最低(31.7 U /毫升)从孤立Z1Y2注意到社保基金。因此,孤立Z1BL1显示最高的酸性蛋白酶活动被选中作进一步研究。

3.3。形态特征的潜在真菌隔离

潜在的真菌隔离Z1BL1被确认和分类属曲霉属真菌基于微观和宏观特征(表3,数据2和3)。

3.4。优化媒体组合和生长条件对酸性蛋白酶生产Z1BL1隔离

3.4.1。基质效应对酸性蛋白酶生产类型

在目前的研究中,两个固体基质(麦麸和米糠)湿酸/矿物盐溶液用于酸性蛋白酶生产。所有的基板被酸和矿物质的解决方案产生显著蛋白酶活性。然而,最大的蛋白酶活动(107.4 U /毫升)获得潜在的隔离(Z1BL1)使用麦麸矿物处理解决方案,而至少蛋白酶活动记录(48.5 U /毫升)使用米糠矿物处理解决方案(图4)。

3.4.2。潜伏期的影响

培养时间的影响在生产酸性蛋白酶如表所示4。蛋白酶活性最高(95.2 U /毫升)被记录在120 h。进一步提高孵化时间减少了酶活性。

3.4.3。孵化温度的影响

在目前的研究中,蛋白酶活性最高(106.1 U /毫升)时获得社保基金进行的温度30°C,而蛋白酶活动达到最低45°C(图5)。

3.4.4。接种体大小的影响

剂的影响大小对酸性蛋白酶生产隔离Z1BL1如图6。最大蛋白酶活动获得一剂1毫升(3.2×10的大小⁶孢子/毫升),而最低的活动被记录为0.2毫升(3.2×10⁵孢子/毫升)。

3.4.5。媒体含水率的影响

含水率对酸性蛋白酶生产的效果如图7。因此,最大酶生产(87.4 U /毫升)获得水分含量50%,而最低(44.7 U /毫升)被记录在含水率为65%。

3.4.6。最初的媒体pH值的影响

最大生产酸性蛋白酶(92.6 U /毫升)的隔离Z1BL1记录初始媒体pH值4.5。蛋白酶活动大幅减少双方的pH值4.5(图8)。

3.5。酶的特性

原油由丙酮和硫酸铵沉淀酶部分纯化,以及部分纯化酶被用于表征。纯化酶的丙酮(NH)₄)₂所以₄MCA / PA的比例增加而降低了MCA和PA(表5)。从acetone-precipitated酶比例最高记录。因此,基于蛋白酶活性和比(MCA / PA)记录的酶,acetone-precipitated酶受到进一步酶特性。

3.5.1。温度对酶活性和稳定性的影响

如图9粗酶与冷丙酮沉淀显示重要蛋白酶活动在一个温度范围从40°C到60°C。然而,最高的活动被记录在一个温度50°C。酶活性逐渐增加而提高温度,其次是大幅减少在温度高于50°C(图9)。酶保持稳定(70 - 79%的活动)在其暴露在温度40°C和60°C之间(图10)1 h。

3.5.2。pH值对酶活性和稳定性的影响

在目前的研究中,acetone-precipitated酶的活性的最佳pH值(97.1 U /毫升)得到(图5.0 pH值11)。

pH稳定性测试acetone-precipitated酶从孤立Z1BL1稳定pH值4 - 6,如图12。酶保留重大活动(83 - 90%)在其暴露在pH值从4点到6点。

4所示。讨论

在最近的研究中,12例(38%)的水解真菌分离株表现出明显的区域脱脂牛奶琼脂媒体在初级筛选。脱脂牛奶琼脂板试验允许定性蛋白酶活动的决定,和水解区生产琼脂可能与蛋白酶产生菌的数量(13,28,29日]。明确区域产生的真菌分离株直径和相对酶活性之间的6.7毫米和21.3毫米和0.40和0.80在48小时内,分别。类似于目前的研究中,大量清除区水解被报道毛霉菌sp。30.),黑曲霉FFB1 [24分别在脱脂牛奶琼脂,琼脂媒体,而清除区直径(8毫米- 19.25毫米)和相对酶活性(1.07 - -2.09)记录不同丝状真菌使用脱脂牛奶琼脂媒体48小时高于本研究[14]。清除区直径及相关酶活性的变化可以归因于在这项研究中使用的媒体pH值较低。

12隔离进行二次筛选,9隔离显示重要蛋白酶活动(31.7 U /毫升之间和78.2 U /毫升)社保基金。这可能是由于这些丝状真菌首选社保基金的生产酶(23]。类似的也记录下各种蛋白酶活动曲霉属真菌种虫害在社保基金(24,31日- - - - - -33]。

潜在的真菌隔离Z1BL1表现出最高的蛋白酶活性在社保基金属下被识别和分类曲霉属真菌根据宏观和微观特征(表3,数据2和3)。与目前的研究相比,从八打灵再也地区收集的丝状真菌分离株(马来西亚)识别和划分为不同物种属曲霉属真菌(14]。在另一项研究中,阿夫扎尔et al。34]报道了丝状真菌鉴定到属曲霉属真菌基于形态学特征。

水分含量是一个重要的因素在固态发酵生产酶(35]因为微生物生长和产品形成发生在或靠近一个优化表面粒子的水位控制水的活动(一个_W)[15]。在这项研究中,从原油中观察到的蛋白酶活性最高的酶产生水分含量50%(图7)。类似于目前的研究,最大的凝乳酶曲霉属真菌种虫害产生55%含水率下社保基金(7,31日]。发酵媒体的高含水率降低孔隙率和氧转移可能影响酶的生产(36]。

最优初始pH值媒体生产酸性蛋白酶的分离Z1BL1被发现(图4.5 pH值8)。进一步增加了媒体pH值显著降低酶的生产,这意味着真菌(Z1BL1)喜欢酸性媒体诱导酸性蛋白酶的pH值。类似的观察报告Yegin et al。37天冬氨酸的蛋白酶的生产)毛霉菌mucedo。在其他的研究中,最大的酸性蛋白酶活动根霉oligosporusHIS13 [38),曲霉属真菌物种(33]在社保基金也获得最初的媒体pH值5。一般来说,pH值的变化在社保基金过程很少是控制,除了初始pH值的衬底调整前接种(24]。

蛋白酶活性测定144 h后24 h间隔,和最高产量在120年被发现(95.2 U /毫升)h(潜伏期(表4)。进一步孵化显著降低酶的生产。最佳潜伏期后酶产量的减少可能是由于消耗营养物质供微生物生长(15]。酶活性最高纪录m . circinelloides,答:oryzaeMTCC 5341,曲霉属真菌种虫害在120 - h发酵时间社保基金与目前的研究相当15,39,40]。

在这项研究中,酸性蛋白酶产量在30°C是最合适的孵化温度的隔离与蛋白酶活动Z1BL1 106.1 U /毫升(图5从这个最佳),任何波动温度显著降低酶活性。酶的生产与真菌的生物量直接相关,这意味着最佳生长温度为隔离Z₁提单₁在30°C。类似于当前的研究,最佳酸蛋白酶生产曲霉属真菌种虫害得到30°C (24,32,33,39]。在另一项研究中,Shieh et al。41)也报道最大的凝乳蛋白酶生产Amylomyces rouxii,毛霉菌pusillus,和毛霉菌J20 30°C。最大酸性蛋白酶活动也被记录答:oryzaeHG76 30°C和明显下降时,温度会更高或更低(42]。

最好的酶底物的选择在社保基金的生产过程是由几个因素,主要是相关成本和可用性的衬底材料,因此农业废物(可能涉及筛选43]。在目前的研究中,两个基板的适用性(麦麸和米糠)滋润酸/矿产解决方案验证了社保基金的蛋白酶生产。获得了最高的酶活性从麦麸滋润矿物的解决方案。固体基质之间的蛋白酶活性的变化可能是由于不同的生化组成和粒径,这在一定程度上是与孔隙度虽然每个基质的颗粒大小是不确定44]。在其他的研究中,麦麸被认为是最佳基质酸性蛋白酶的生产答:oryzaeMTCC 534139),其他曲霉属真菌物种(24,42),而毛霉菌物种(45]。

培养液的大小是一个重要的决定在发酵过程中生物质生产生物因素。高度浓缩剂可能产生过度生物质导致快速损耗的快速增长所需的营养物质文化和代谢物的生产,而较低的接种体密度可能会给足够的生物诱导低收益率的产品(24,46,47]。因此,确定一个适当的培养液在社保基金规模对最佳生物量增长至关重要,因此最大酶生产。在目前的研究中,蛋白酶活性最高(107.4 U /毫升)的原油生产酶Z1BL1获得使用一种培养液1毫升(3.2×10的大小⁶孢子/毫升)(图6)。不同,最大的蛋白酶的产量答:oryzaeNRRL 180846),毛霉菌circinelloides(15据报道在8×10⁸孢子/毫升和10⁸分别孢子/毫升。

额外增加培养液大小为6.4×10⁶孢子/毫升大幅减少酸性蛋白酶活性。酶活性的下降已经观察到更高的接种体大小可能是由于缺乏可用的营养物质文化的较大的生物量和更快的增长。因此,增殖生物量之间的平衡和可用的最大酶生产材料是至关重要的46]。

蛋白酶是一种重要的实践特征来确定酶的最适温度和pH值的应用程序。在这项研究中,使用丙酮粗酶沉淀是用于表征。部分纯化酶显示最高活动温度50°C和稳定温度在40°C和60°C之间。酶的耐热性显示在这项研究符合酶的潜在的应用在食品行业,如面包和啤酒4,33),和酸性蛋白酶的活性最高米曲霉MTCC 5341 55°C和其稳定性40到57°C也报道(30.]。酸蛋白酶是最活跃的pH值5.0,上面和下面的蛋白酶活性显著降低,这个值。酶活性从pH值4到6,如图12。这表明酶活性在酸性pH值和适合食品行业和饮料行业5]。同样,Oseni [48报道酸性蛋白酶的活性最高曲霉属真菌在pH值5种虫害。最佳pH值在3.0和5.5之间为蛋白酶活动已报告的其他真菌,如青霉菌camemberti(pH值3.5)(49),而根霉oryzae(pH值5.5)(50]。NRRL 1785蛋白酶的最适pH值,表现出一个最佳水平的pH值4.0,相当与当前研究[51]。因此,在本研究酶的稳定性与pH值用于食品加工的食品和饮料行业(33]。

5。结论

丝状真菌分离奶制品和葡萄农场土壤有可能产生酸性蛋白酶。从初级和二级筛选,分离Z1BL1被选为一个潜在的真菌生产酸性蛋白酶在社保基金。潜在的隔离下成功地识别和分类属曲霉属真菌使用宏观和微观特性。优化媒体组合和生长条件的隔离Z1BL1稍微增加了酸性蛋白酶生产。描述的部分纯化酶证实,在pH值5和50酶效果最好°c。因此,基于上述发现,隔离Z1BL1可能是一个潜在的候选人酸性蛋白酶的生产适用于食品行业。

数据可用性

使用的实验数据来支持本研究的结果包括在本文中。

同意

同意所提供的所有研究人员参与了这项研究,包括在出版物中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Abdilabar Usman导致采集和分析;解释数据;和起草工作。Jermen宫野真守了概念、采集和分析;解释数据;起草工作;和分析,实质上修改工作。说默罕默德的分析;解释数据;和修改后的草案的工作。 All authors agreed to publish this research article.

确认

作者承认生物学系,自然和计算科学学院提供资金、便利化的实验室空间,和其他设施。除此之外,作者承认研究广场的演讲手稿”生产、优化和表征固体发酵酸性蛋白酶从丝状真菌的“预印本。这项工作是支持的生物学系,自然和计算科学学院德勃雷Berhan大学。

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