宠物和流浪狗作为抗菌抗菌储层大肠杆菌

摘要

狗和人之间的密切接触为抗药性细菌的种间传播创造了最好的桥梁。对其耐药性的监测，包括检测细菌中的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌as指示菌是控制抗菌药物使用的重要工具。本研究旨在评估大肠杆菌从阿根廷拉普拉塔市的宠物和流浪狗中分离的菌株的表型方法的耐药性。采用直肠拭子法采集50只有主人犬(家犬= HD)和50只流浪犬(流浪犬= SD)的粪便样本。分别在添加和不添加抗生素(环丙沙星和头孢噻肟)的3个麦康凯琼脂平板上培养。共分离菌株197株，经生化鉴定仅95株大肠杆菌，46株来自HD，49株来自SD。通过Kirby–Bauer纸片扩散法评估抗菌药物敏感性。最常见的耐药性是四环素、链霉素和氨苄西林。在这两组中，对第三代头孢菌素的耐药性水平较高，存在多重耐药菌株。有与HD相比，SD菌株的耐药性水平更高。HD样本中有8%的菌株怀疑为ESBLs，SD样本中有36%的菌株怀疑为ESBLs。从HD分离的菌株中有1（2%）和从SD分离的菌株中有11（22%）被表型确认为ESBL。宠物和流浪狗是潜在的ESBLs来源大肠杆菌阿根廷的抗生素抗性;因此，必须保证其监视。

1.导言

长期以来，宠物作为抗药性细菌最重要的传播者之一的作用一直被低估，因为人们普遍关注的焦点是作为抗药性细菌主要来源的食品生产动物。然而，宠物和人类之间的密切接触为种间传播创造了最好的桥梁耐多药（MDR）细菌的分离[1.］.

与主人生活在同一屋内的猫狗接触到相同的表面和物体，这些习惯增加了抗药性传播的机会。此外，兽医实践的发展以及对宠物福利和健康的社会责任感的增强，提高了它们的生活体验tancy，这增加了经常需要抗菌治疗的老年患者的数量，因为他们经常患有慢性病或免疫损害[2.］.

抗微生物剂经常用于治疗和预防性目的，不仅在住在家庭中的狗，而且在流浪狗中。在阿根廷，由于不受限制的抗生素销售和保护动物的倾向，没有专业知识的人经常向流浪犬施放抗微生物犬，并越来越多的保护动物[3.］.抗生素使用不当和滥用处方、次治疗剂量的使用、抗菌素使用不规范、犬类社会角色的变化是影响犬类耐药选择和具有耐药基因决定因素的细菌转移的重要危险因素。几项研究已经证明，抗微生物细菌可以从狗身上传染给人，也可以从人身上传染给狗[4.–6.］.

近年来，阿根廷伴侣动物的数量有了重要的增长。根据布宜诺斯艾利斯政府市卫生和动物保护部门最近的一项研究，有80万到100万只狗和猫，有主人或没有主人。这意味着每3个人就有1只宠物[7.,8.］.

从健康和生病的宠物中分离出了几种耐药微生物，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、甲氧西林耐药性假狄氏葡萄球菌(MRSP)、多重耐药革兰氏阴性菌、广谱β -内酰胺酶(ESBL)/ ampc产生菌肠杆菌科[9,10］.人类、动物及其周围环境中ESBLs病毒株的大量增加是一个世界性的大问题。同伴动物可能会成为ESBLs的水库[11］.

ESBL基因大肠杆菌主要编码于质粒中;然而，有研究证实了染色体整合[12–14]这些酶对青霉素类、第三代头孢菌素类（头孢他啶或头孢噻肟）和氨曲南具有水解活性，但对头孢霉素类（头孢西丁）或碳青霉烯类无水解活性，并被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂抑制[15］.β-内酰胺可能是由于安全性，抗微生物谱，可用性和药代动力学和药物动力学和药物动力学和药物动力学和药物动力学和药物动力学特性，可能是最广泛使用的抗微生物。16］.第一代头孢菌素和阿莫西林与克拉维酸和青霉素与氨基糖苷是日常兽医诊所实践的常规处方。第三代头孢菌素是治疗难以解决的细菌感染的少数治疗选择之一;因此，它们是非常重要的药物。

肠杆菌科是ESBL的主要生产者，特别是肺炎克雷伯菌和大肠杆菌[17].在肠道微生物群中，大肠杆菌具有指示耐药性的作用，因为它是最广泛的肠道细菌群之一。监测其耐药性机制是控制不谨慎使用抗菌素的重要工具。它使我们知道因抗菌素耐药性而选择的抗菌素，避免公共卫生风险，减少治疗失败和生产者的经济损失[5.］.

此外，ESBL菌株通常携带其他抗生素的耐药性基因，如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺甲恶唑-甲氧苄氨嘧啶和氯霉素。因此，存在质粒介导的交叉耐药的潜在风险，而且随着不同耐药表型的日益出现，如多药耐药(MDR:当至少有一个代理在三个或更多家庭的抗生素不敏感),极端的阻力(XDR)不敏感时,至少有一个代理在所有类别的抗菌家庭除了一个或两个),和pan-resistance (PDR:当他们不敏感的任何代理所有的抗菌类)(18,19］.

本研究的目的是检测抗性模式和在体外产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌通过表型方法从阿根廷布宜诺斯艾利斯拉普拉塔市的有主人的狗和流浪狗中分离得到的菌株。

2.材料和方法

2．1．菌株

50只住在有主人的房子里的狗的粪便样本（家养狗 = 以及50只流浪狗样本(流浪狗) = （SD）于2016年10月至12月在阿根廷布宜诺斯艾利斯拉普拉塔市采集。有主人的狗是临床健康的成年狗，在家庭中饲养。它们在过去3个月内没有接受抗菌治疗。对于在兽医诊所采集的样本，只有那些来进行常规健康控制或加固的动物根据健康计划选择疫苗。采用螺旋抽样法在拉普拉塔市不同地区采集流浪狗粪便样本[20.]拉普拉塔市的特点是其独特的设计，因为它是一个网格，是一个完美的正方形，有两条对角线，从东到西和从北到南穿过整个城市。因此，从广场的外围区域到中心对流浪狗进行了抽样。只选择了不具攻击性的流浪狗进行抽样ce未使用镇静方法。动物由两名操作员约束，第三人使用无菌棉签采集直肠粪便样本。

该方案是根据《农业研究和教学中护理和使用农业动物指南》(动物科学学会联合会- fass -) [21]，并获得阿根廷UNLP兽医科学学院实验伦理委员会批准(47.3.15 J)。

在实验室中，每个棉棉签用于将每个样品接种到3琼脂板上：Mackey agar（Difco，Becton Dickinson，USA）补充有2 mg / L头孢噻肟（板A），加压0.05mg / L Ciprofloxacin的Macconkey琼脂（板B）选择样品中存在的可能的抗性菌株，以及没有抗微生物（板C）的第三板。Cefotaxime和Ciprofloxacin是从美国的Sigma-Aldrich获得的。在37℃下孵育过夜，2-3个菌落，表型特征大肠杆菌选择，革兰氏染色，并通过生化试验(脲酶生产，过氧化氢酶试验，运动性，Voges Proskauer，吲哚生产，碳水化合物发酵试验，甲基红，柠檬酸利用)进行分类。大肠杆菌写明ATCC 25922^®(美国类型培养库，美国)作为质量控制[22,23］.

2．2．敏感性测试

在A板和/或B板中生长的菌株经生化鉴定为大肠杆菌用标准的柯比-鲍尔纸片扩散法进行药敏试验。但当这些培养皿(A或B)中没有菌落，而在C培养皿中，没有抗生素的菌株被分离出来进行研究。选用20种抗菌药物(美国Becton Dickinson):阿莫西林/克拉维酸(20μ克/ 10μg） ，氨苄西林（10 μampicillin-sulbactam (10 g)μ克/ 10μg),头孢曲松(30μg） ，头孢他啶（30 μg） ，头孢噻肟（30 μcefazoline(30克)μg） ，头孢泊肟（10 μsulfamethoxazole-trimethoprim (23.75 g)μ1.25克/μ氯霉素(30克)μg)、环丙沙星(5μg） ，萘啶酸（30 μ四环素(30克)μg)、庆大霉素(10μg） ，链霉素（10 μg),卡那霉素(30μg)、阿米卡星(30μ呋喃妥英(30克)μg） ，氨曲南（30 μG)和亚胺培南(10μg） ，根据临床和实验室标准协会，CLSI[22,23］.

２．３．ESBL识别

采用Mueller Hinton琼脂(Britania, argentina)对头孢多肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟和头孢曲松的抗生素片进行首次ESBL盘筛选试验[18,19]。结果根据上述抗菌剂的CLSI筛选截止值进行解释。当提及的一个圆盘周围的直径为头孢泊肟时≤17 嗯，头孢他啶≤22 嗯，头孢噻肟≤27 嗯，头孢曲松≤25 嗯，氨曲南≤27 mm，分别，隔离被认为是怀疑ESBL表型[22,23］.

ESBL确认采用CLSI 2013双盘协同测试;含头孢他啶和头孢多肟的椎间盘放置在阿莫西林加克拉维酸的椎间盘旁边(从中间到中间20mm)。阳性结果表明，任何头孢菌素盘周围的抑制区沿含克拉维酸的盘方向增加。大肠杆菌写明ATCC 25922^®用于质量控制[22,23］.

2.4.统计分析

采用卡方检验确定流浪狗与宠物之间耐药性流行率差异的显著性。的值 被认为是重要的。

3.结果与讨论

从100份粪便样本中分离出197株（77株来自HD，120株来自SD），只有95株经生化鉴定为大肠杆菌（46个来自HD，49个来自SD）进行了研究；每个菌株都是单独的，并从上述3个平板（A、B或C）中的一个变成。从几个样本中，我们获得了经生化鉴定为大肠杆菌同时从A和B两个板块中提取，但我们分别研究了它们。从HD标本中筛选出3株大肠杆菌在平板A（含头孢噻肟）上生长，19在平板B（含环丙沙星）上生长，其余菌株(N= 24)仅在琼脂上发生，未使用抗微生物药物;另一方面，从SD样品中，有19株大肠杆菌在A板显影，在B板显影16;其余的(N = 14) grew in the plates without antimicrobials (plate C).

选择用头孢噻肟(A板)或环丙沙星(B板)在琼脂上生长的菌株进行抗生素图测定。菌株的大肠杆菌在A和B盘子中被抑制，但在C盘子中没有抗菌药物时被抑制，这是第三组研究，包括药敏试验。因此，共选取有主人犬46个品系和无主人犬49个品系进行研究。

观察到的最常见耐药性是SD衍生菌株对四环素（70%）和HD衍生菌株对萘啶酸（38.3%）的耐药性。对链霉素（46%）和氨苄西林（44%）的耐药性SD菌株的耐药率第二高。对于HD，对氨苄西林的耐药率为25.5%，对磺胺甲恶唑甲氧苄啶的耐药率为19.1%。在这两组中，对第三代头孢菌素的耐药率都很高（头孢曲松：30%SD–21.3%HD，头孢噻肟：28%SD）.与HD相比，SD菌株的耐药性水平更高。没有大肠杆菌两组均对亚胺培南或呋喃妥因有耐药性。在这两组中都存在多重耐药菌株，它们的耐药情况包括一、二、三和四种以上的抗菌素(见图)1.和表1.)．

HD标本中怀疑为ESBL的菌株占8%，SD标本中怀疑为ESBL的菌株占36%。其中1株疑似ESBL(2%)来自HD, 11株(22%)来自SD。

检测到的最普遍的抗性表型大肠杆菌从HD中回收的分离菌为萘啶酸(NAL = 5株)和萘啶酸与四环素(NAL + TET = 2株)。

SD菌株的多重耐药发生率要高得多，32.7%的耐多药菌株对4种以上的抗菌素产生耐多药。SD菌株检测到的最普遍的表型为四环素(TET = 8株)，HD菌株检测到的表型为萘啶酸与四环素(NAL + TET = 3株)。

两组中对4种或4种以上抗菌药物均表现出耐药性的所有菌株（HD和SD菌株）均属于先前在含有抗菌药物（环丙沙星和头孢噻肟）的平板中培养的菌株（见表）2.和3.)．

在我们的研究中，样本来自有主人和无主人的动物的粪便，但它们不是临床样本，因为我们工作的主要目的是了解动物体内抗菌药物耐药性的流行情况大肠杆菌作为拉普拉塔市的指示细菌，在没有最近的抗菌疗法的狗。大多数作者发表了从尿液、尿道、肠道和耳朵等临床样本中获得的结果[24–26］.这使得比较结果变得困难，因为在病犬和健康犬种群之间存在预期的耐药性流行率差异。

本研究中对抗微生物的抗性似乎高于用健康犬完成的其他研究中先前报道的那些。获得的最高耐受性是在SD衍生的菌株中用于四环素，但不含宠物 ．氨苄青霉素是第二常见的耐药(SD = 44%;高清= 25.5%);然而，这并不是很重要 ．两组动物均存在耐萘啶酸(HD = 38.3%;SD = 44%)，认为不显著 ．流浪狗分离株对链霉素也表现出很高的耐药性(46%)，但宠物分离株对链霉素的耐药性较低(17%) ．在不同国家对健康狗进行的大多数研究中，对氨苄青霉素和四环素的耐药性是最常见的报道[27–29.］.上述抗微生物药物在宠物菌株(HD)中获得的耐药百分比与Wedley等人的研究报告相似[27]，来自英国柴郡半农村社区的健康犬(氨苄青霉素占24%，四环素占19.7%)。在另一项对拜访英国兽医的狗进行的研究中，他们发现对这两种抗生素的耐药性水平更高;37.2%的菌株对氨苄西林耐药，30%对四环素耐药[28.］.然而，这些结果仍然低于我们工作中SD隔离物的据报道的结果。Costa等人报告的结果。[30.在葡萄牙分离的健康宠物中，对四环素和氨苄西林的耐药性分别为20.5%和7.7%。有趣的是，在一些临床分离的研究中大肠杆菌从尿感染，败血症和皮肤和软组织感染中分离出来，对氨苄青霉素和四环素的抵抗力低于我们的结果[24,31.］.

β -内酰胺类和四环素类抗生素更多地用于宠物;每项工作报告的不同耐药性水平与不同国家使用耐药性的频率和程度有关。此外，我们的结果令人不安，因为它们表明，在拉普拉塔，似乎是滥用和/或滥用广谱抗菌素，如四环素和-内酰胺。

产生菌株的ESBLs的鉴定对于引导足够的抗微生物治疗非常重要。有8％的菌株涉嫌在HD样品中的ESBL和来自SD的36％。通过表型试验证实了来自HD（2％）和11（22％）SD的ESBL菌株之一，但没有遗传确认，这是我们研究中的限制。同样，对HD菌株获得的结果类似于Wedley等人发表的结果。[27,28.]但SD菌株中ESBL的百分比相当高。

与其他作者发表的几项研究相比，SD菌株中多药耐药(对3种以上的抗菌素耐药)的流行率要高得多[27,28.,32.–34.］.在PET菌株（HD）中，MCRY等人报告的那些MDR类似的百分比（28％）。[34.在一项针对加拿大健康狗的研究中。再次强调，SD菌株的发现是一个大问题。在阿根廷，无需专业处方即可获得抗微生物药物。这可能是导致任何人使用它们的原因之一，即使不是兽医。垃圾是抗菌素耐药性传播的另一个可能来源;流浪狗打破垃圾袋并吃掉它们。这些袋子里的细菌可能携带着抗微生物的基因。另一方面，家庭抗生素垃圾污染了非家庭环境，选择了那里的细菌耐药性，然后感染流浪狗和其他人。在阿根廷，关于宠物和家庭附近环境中抗微生物菌的数量的数据非常有限。此外，虽然在进入正式市场的物品中监测抗菌素，但存在一个重要的非正式市场，而且环境中的抗菌素水平没有常规测量。 One potential response to the rising threat of antimicrobial resistance is regulation, and both international organizations—led by the WHO—and individual countries have sought to formulate, for example, new regulatory frameworks to address the use of antimicrobials, as well as the household waste management. The source of the resistance genes in those bacteria of stray dogs is still unknown, and further studies should be done to detect such environmental source(s).

SD和HD分离株检测到的最普遍的表型之一是萘啶酸和四环素(NAL + TET = 3个分离株)。这些菌株是NAL^RCIP^s; 这意味着它们对萘啶酸耐药，对环丙沙星敏感。这是日常兽医诊所实验室经常发现的。对喹诺酮类药物耐药的机制是靶点改变或外排泵过度表达。最相关的机制是编码喹诺酮类靶点（DNA回旋酶和拓扑异构酶IV）的基因突变。基因点上的突变Gyra.基因经常在大肠杆菌并与这种表型NAL有关^RCIP^s．有这种突变的细菌在喹诺酮类药物存在的情况下更频繁地产生更高水平的耐药性[35.］.

4.结论

通过对宠物和流浪狗的监测研究来了解抗菌素耐药性的流行情况是非常重要的。在阿根廷，不受限制的抗生素销售、对生活垃圾的管理不力，以及不断增加的保护动物的倾向，都是抗生素耐药性选择和来自宠物、无家可归的狗和人类的细菌中基因耐药性决定因素转移的重要风险因素。本研究的结果表明，在阿根廷其他城市进行的类似研究对于在国家一级监测抗菌素耐药性非常有用。

数据可用性

用于支持本研究调查结果的数据可从Laboratorio de EstudiosFarmacológicosy.coxicológicos-Lefyt-，Facultad de Ciencias Veterinarias，Universidad Nacional de La Plata（nmestorino@yahoo.com,noram@fcv.unlp.edu.ar,mlauramarchetti@yahoo.com.ar,mlmarchetti@fcv.unlp.edu.ar.)．

利益冲突

所有作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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