文摘
的出现AmpC(pAmpC)β-lactamases赋予第三代头孢菌素耐药性已成为全球主要的临床问题。在这项研究中,我们旨在评估的表达AmpCβ内酰胺酶编码基因在抗致病性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌筛选临床样本的埃及病人登记到El-Qasr El-Ainy三级医院在开罗,埃及。总共153个细菌分离株的物种铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌,和肠球菌都有效隔离病人被诊断为尿路感染(UTI)、呼吸道感染(RTI)和伤口感染。的总数大肠都有效隔离是53,包括29尿液分离,5痰隔离,和19个伤口拭子隔离,而的总数铜绿假单胞菌隔离是49,包括27尿液分离,7痰隔离,和15个伤口拭子的分离,k .肺炎隔离是51,包括20尿液分离,25例痰隔离,以及6伤口拭子隔离。我们的研究结果表明,没有显著差异的表达AmpCβ内酰胺酶基因测试中细菌种类对感染的类型和/或临床标本。然而,的表达模式AmpCβ根据抗菌内酰胺酶基因明显不同电阻测试隔离的特性。
1。介绍
抗生素的临床实践的引入在20世纪对抗传染病和微生物无疑是人类文明的福音,挽救了数以十亿计的人们。然而,抗菌素耐药性稳步增长在过去的几十年,已成为全球诱发威胁人类发病率和死亡率(1]。在美国,每年超过63000名患者死于因为院内细菌感染。同样的,估计每年有25000患者死于在欧洲,由于细菌感染耐多药(MDR)。抗生素的广泛和轻率的使用大大导致耐药微生物菌株的出现(2]。抵抗抗菌素如第三代头孢菌素、喹诺酮类、碳青霉烯持续,特别是革兰氏阴性细菌病原体中急剧增加(3]。
据世界卫生组织(WHO)的全球优先级列表antimicrobial-resistant细菌出版于2017年,铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌,和肠球菌都有效是最常见的批评或罹患卫生保健相关病原体病高优先级(4]。铜绿假单胞菌是一种需氧革兰氏阴性细菌,可引起感染的住院患者,以及免疫功能不全的主机和囊性纤维化患者。因此,它是一个全球领先的医院病原体会导致严重的院内感染如肺炎、尿路感染(UTI),血液感染(BSI),手术部位感染。和皮肤感染5]。它也可以引起社区获得性感染包括溃疡性角膜炎、外耳炎、皮肤和软组织感染(6]。一般是在越来越多的报道和确定耐多药甚至pan-drug-resistant细菌(5]。肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性细菌与广泛的感染有关,如泌尿道感染、肺炎、腹腔感染、BSI、脑膜炎、化脓性肝脓肿(PLA) (7),而肠球菌都有效是一种革兰氏阳性细菌开始成为医院感染耐多药的主要原因在1980年代和1970年代,它目前跻身血液的院内感染的主要原因,尿道手术伤口,和其他网站。也发现伴随的专性厌氧菌混合感染导致腹腔脓肿(8]。
AmpC类型的酶是β-lactamases调解耐头孢菌素,头孢唑啉,头孢西丁,大多数盘尼西林,β内酰胺酶抑制剂,β内酰胺组合(9]。染色体上编码这些酶可以是不同的微生物包括肠杆菌科家族的许多成员或传染性港基因的质粒编码AmpC酶在细菌缺乏或不表达染色体的10]。碳青霉烯通常可以用于治疗感染所致AmpC第细菌。然而,碳青霉烯抵抗可能出现在某些微生物突变,减少流入(外膜孔蛋白损失)或提高射流(射流泵激活)10]。AmpCβ-lactamases几乎不能降低碳青霉烯,但他们可以共价结合到周质,防止他们访问他们的目标11]。在埃及,第三代头孢菌素抗生素耐药性是在上升,导致医院暴发。然而,一些当地的研究分析这些增加背后的潜在基因抗性。因此,在我们的研究中,我们旨在通过评估解决抗生素耐药性的困境的表达的作用AmpCβ内酰胺酶编码基因中选择通常导致感染的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌MDR-resistant病人登记到El-Qasr El-Ainy三级医院在开罗,埃及。MDR细菌病原体我们选择铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效。他们是世卫组织全球优先级列表的分类antimicrobial-resistant细菌病原体与关键的优先级(铜绿假单胞菌和k .肺炎)或优先级(高大肠都有效)[4]。此外,之间的相关性AmpCβ内酰胺酶表达和类型不同的菌株(革兰氏阳性或革兰氏阴性)和隔离的来源,以及之间的相关性AmpCβ内酰胺酶表达基因型和AmpCβ内酰胺酶酶表型研究。
2。材料和方法
当前的研究的实验设计是总结在图1。
(一)
(b)
(c)
(d)
2.1。细菌分离和临床样本
本研究遵循赫尔辛基宣言和大学的伦理委员会批准,El-Qasr El-Ainy医院。从所有参与者获得书面知情同意。样本收集从2016年12月到2018年1月住院病人的El-Qasr El-Ainy医院。总共153个细菌分离获得的临床样本识别的物种铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效。细菌分离鉴定物种水平使用传统的微生物学方法(文化特征)和识别确认用Vitek - 2系统(bioMerieux;马西l 'Etoile、法国)。
这些隔离恢复来自不同临床样本包括尿液、唾液、和伤口拭子从病人患有尿路感染(尿)、呼吸道感染(rti),分别和伤口感染。的总数大肠都有效隔离是53,包括29尿液分离,5痰隔离,和19个伤口拭子隔离,而的总数铜绿假单胞菌隔离是49,包括27尿液分离,7痰隔离,15伤口拭子隔离。的总数k .肺炎隔离是51,包括20尿液分离,25例痰隔离,以及6伤口拭子隔离。
2.2。抗菌药物敏感性试验
抗菌药物敏感性测试和最低抑制浓度(MIC)确定使用不同的抗菌类进行根据标准协议,指南和解释标准所描述的临床和实验室标准协会(12]。标准菌株铜绿假单胞菌写明ATCC 27853,k .肺炎写明ATCC 70060,肠球菌都有效写明ATCC 19434(美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)被用作生产积极的控制AmpCβ内酰胺酶。大肠杆菌写明ATCC 25922年作为消极的控制生产AmpCβ内酰胺酶。
2.3。检测AmpCβ内酰胺酶酶表型
2.3.1。Cefoxitin-Cloxacillin双圆盘协同测试(CC-DDS)
这个测试用于确定的生产AmpCβ内酰胺酶酶111年隔离。短暂,0.5麦克法兰测试分离的悬浮液在一夜之间文化背景的准备。然后,调整悬浮液用于接种Muller-Hinton琼脂板用无菌棉签。光盘包含30µ克头孢西丁+ 200µ邻氯青霉素g(抑制剂AmpC酶)被添加到Muller-Hinton琼脂表面。盘子终于孵化35°C 16小时。改变cefoxitin-cloxacillin抑制区域减去≥4毫米的头孢西丁单独区域被认为是象征AmpC生产(13- - - - - -15]。
2.4。量化的AmpCβ内酰胺酶编码基因表达
2.4.1。总RNA提取
细菌分离株接种到5毫升整除的磅(Luria-Bertani)肉汤培养基和孵化一夜之间用颤抖(200 rpm) 37°C。接下来,隔离亚文化在50毫升整除的磅肉汤中,让它生长,直到他们到达一个光学密度(OD600海里)0.6 - -0.8;然后,细胞颗粒被离心收获14000 rpm。每个孤立使用的总RNA提取GeneElute细菌总RNA净化设备(西格玛奥德里奇,美国)和筛选了RNase-free水后制造的协议。DNA污染物被使用2 U DNase我消除,RNase-free酶(Puregene、印度)。使用NanoDrop RNA浓度和纯度测定仪器(英国nano - 100)。最后提取RNA浓度铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效10µ15克,µg, 12µ分别g和纯度测量了OD 260/280比率在1.7和1.9之间(16]。
2.4.2。互补脱氧核糖核酸合成和定量Real-Time-PCR (RT-qPCR)实验
互补DNA合成(互补)使用细菌分离提取RNA模板如下。首先,30 ng纯化RNA受到反转录成cDNA使用HisenscriptTmRH(−)互补脱氧核糖核酸合成装备(生物技术基因内区、韩国)使用PCR thermocycler(英国& E实验室)。然后,5µl的cDNA用于实时PCR扩增使用Maxima SYBR绿色/火箭qPCR大师混合(2 x)(美国ThermoFisher科学)StepOne +实时PCR系统(美国应用生物系统)17]。所有pcr进行复制。特定基因的引物设计的引物设计工具在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),合成了HVD生命科学、埃及开罗。的基因组序列k .肺炎(加入基因库。EF125013.1)和大肠都有效(加入基因库。NC_017960.1)被用作模板设计PCR引物。中使用的寡核苷酸引物PCR扩增表中列出1。细菌分离被认为是积极的AmpC第细菌的mRNA水平铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效至少15倍、12倍和10倍过表达与控制压力。
2.5。统计分析
GraphPad棱镜软件(版本6.01)被用来执行统计分析。定量统计分析使用单向方差分析,以确定是否有显著差异AmpC表达水平在三个耐药菌株或样品来源(尿里,痰里,伤口)。斯皮尔曼相关测试,一个尾巴 ,执行测试之间的相关性AmpC表达水平和抗菌素耐药性。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。药敏资料
抗菌药物敏感性的研究表明,有一个整体的高阻细菌隔离包括在这项研究β内酰胺抗生素(包括氨苄青霉素、阿莫西林和哌拉西林是否单独或结合β内酰胺酶抑制剂),以及头孢菌素。隔离的抗菌素耐药性的概要文件中列出的表2。恢复细菌分离株显示高水平的多药耐药性测试抗菌药物,在93年的153个分离株(60.8%)对三个或更多的类抗菌药物和描述为耐多药。此外,23日的153个分离株(15%)被发现是容易只有一个或两个类别的抗菌素和归类为广泛耐药(XDR)细菌隔离。的检测AmpC酶的生产、CC-DDS表型测试显示,81% (43/53)大肠都有效隔离,86% (44/51)k .肺炎隔离,48.9% (24/49)铜绿假单胞菌隔离是AmpC第表型。的评价AmpCβ内酰胺酶编码基因的表达,通过实时PCR检测AmpC记录显示,81%(43/53)的基因表达大肠都有效隔离和86%(44/51)和48.9% (24/49)铜绿假单胞菌隔离(图2和表3)。
(一)
(b)
(c)
3.2。量化的AmpCβ内酰胺酶编码基因表达
基于表达式的褶皱变化,AmpCβ内酰胺酶基因表达共有54(48.65%)组成的隔离13 (54.17%)铜绿假单胞菌隔离,19 (43.18%)k .肺炎隔离,22 (51.16%)大肠都有效隔离(表2和4)。
褶皱变化的表达式AmpCβ内酰胺酶基因的分离铜绿假单胞菌,k .肺炎或大肠都有效没有任何明显的差异表达水平无论是从尿液、唾液,或伤口拭子的起源, ,如图2和表3。折中的差异表达的变化AmpCβ内酰胺酶编码基因在每个菌种的分离AmpC表达和AmpC未表达的是显示统计学意义由三个星号表示值0.0001(图3和表3)。然而,人们发现表达的水平AmpCβ内酰胺酶基因在三个不同的物种显示无意义的差异 。
4所示。讨论
抗菌耐(ABR)是细菌对抗菌药物的不敏感,因此治疗传染病和造成困难,因此,高死亡率。AmpCβ内酰胺酶,产生的AmpC基因,是第一个驱逐舰的决定β内酰胺环β内酰胺抗生素,导致显著的挑战上。因此,表型和基因型的方面AmpC基因对ABR有趣的研究(19,20.]。它已被证明AmpCβ内酰胺酶有可能抑制活动范围广泛的抗菌药物。事实上,据报道,如头孢菌素耐药,头孢唑啉,头孢西丁,大多数青霉素是流行病学和基因的表达有关AmpC基因的细菌物种铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效(21- - - - - -26]。越来越多的证据表明,对第三代头孢菌素抗生素耐药性日益发作有社区医院,在某些情况下,特别是在Enterobacteriace感染,会导致死亡率(27]。然而,有限的研究调查了原因。因此,在当前的研究中,我们旨在评估的影响AmpC表情的阻力不同抗菌药物在临床分离的三个罹患卫生保健相关病原体来自病三级医院在开罗,埃及,即两个革兰氏阴性(铜绿假单胞菌和k .肺炎)和一个革兰氏阳性(大肠都有效)细菌与关键或高优先级分类,分别,世卫组织全球优先级列表antimicrobial-resistant细菌(4),根据菌株的感染源;三种不同的感染来源被用来恢复细菌隔离。这些来源是细菌尿,rti和伤口感染。上下文,在世界范围内流行的细菌尿是11% (28)和rti的5 - 15%,二次流感病毒感染(29日]。
至于underinvestigated的全球流行菌株相关的感染源,研究涉及3193例患者在54个国家确认的社区获得性肺炎(CAP)的诊断报告铜绿假单胞菌分别负责4.2%和2.0%的吗铜绿假单胞菌和耐药铜绿假单胞菌帽的感染。关键的铜绿假单胞菌导致rti达到67%的病人患有气管造口术,支气管扩张,和/或非常严重的慢性阻塞性肺疾病(30.]。在尿路/伤口感染,铜绿假单胞菌提出了在尿路第三诱发因素和12%的伤口感染29.6% (31日]。为k .肺炎,它是普遍地负责15 - 40% / 32.6%的肺炎/尿路情况下,分别为(30.]。据报道,大肠都有效普遍地负责15%的感染常引起enterococci如尿,rti,伤口感染32- - - - - -34]。
在目前的研究中,表达的AmpCβ内酰胺酶基因表达模式的调查AmpCβ内酰胺酶基因,分析了耐药和不抵抗的隔离,使用153年临床分离株RT-qPCR实验铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效(表4)。结果显示,没有显著差异AmpC过度的测试细菌物种,不管他们的克±表型,类型的感染,或临床标本。
这是一个确认以前报道的11),在基因库中,AmpC1680年基因是包含在齿轮,齿轮代表一组同源组。齿轮1680包括其他penicillin-binding蛋白质以及C类β-lactamases,包括蛋白质从古生菌和细菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
我们的研究表明,的表达AmpC基因检测54(48.65%)隔离铜绿假单胞菌,k .肺炎和大肠都有效与无显著差异AmpC表达水平有关的感染或类型的标本来源,尿液(AmpC表达式的50.45%n= 56),痰液(AmpC表达式的25.23%n= 28),或伤口拭子(AmpC表达式的24.32%n= 27)。这些发现符合另一项研究的结果从埃及的表达AmpCβ内酰胺酶的微生物从埃及Ain Shams大学医院,获得指示,34.8%(22/46)的隔离k .肺炎显示超表达的AmpC基因(35,36]。我们在这项研究中发现,60%的隔离测试MDR,沿着这条线的在埃及进行的另一项研究,并发现87.5%的临床分离株耐多药(37]。事实上,隔离记录AmpC积极使用头孢西丁盘测试显示阻力不同抗菌类包括头孢菌素、环丙沙星、阿米卡星、左氧氟沙星,cefoperazone-sulbactam,哌拉西林/ tazobactam meropenem, imipenem [38]。此外,没有显著差异AmpC表达水平相比,抗菌抗上述抗生素使用斯皮尔曼相关 。这意味着可能会有其他基因可以一起发挥重要作用AmpC抗生素抗性基因。
上的k .肺炎努力把发现颞季节性其ABR和滥用之间的相关性β内酰胺/β内酰胺酶抑制剂(BLBLIs),所以统计分析已由另一组关联每年在三级医院抗生素检测ABR韩国健康保险的情况。他们发现取代碳青霉烯BLBLIs不是理想的解决方案,为ABR可能迅速传播对哌拉西林/ tazobactam组合(39]。同时,它是表示β-arrestin招聘基因是一个重要的诱导物β内酰胺酶信号通路,ABR的增加k .肺炎对克林霉素、红霉素、linezolid和青霉素(40]。
为铜绿假单胞菌,我们的研究结果是一致的与另一项研究显示AmpC艾滋病患者铜绿假单胞菌隔离从烧伤病人表现出耐头孢菌素及碳青霉烯(41]。底层的分子因素AmpC积极的铜绿假单胞菌是说明基因突变的发生基因blaAmpC合成一个以前C类β内酰胺酶和AmpR-activating突变(G154R),导致一个extended-spectrumAmpC年代抗羟基噻吩青霉素、哌拉西林monobactams (aztreonam)和第三代(头孢他啶)和第四代头孢菌素(头孢吡肟)42,43]。一个扩展的筛查研究在中国东北报道,MDR的流行率很高铜绿假单胞菌菌株表现出抗羟基噻吩青霉素/克拉维酸、哌拉西林/ tazobactam,头孢哌酮/ sulbactam,哌拉西林,imipenem, meropenem、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星住院后感染的发生显著相关(44]。此外,一个回顾性研究,调查抵抗抗菌素的发展铜绿假单胞菌表明imipenem或环丙沙星治疗产生耐药菌株的一个关键因素铜绿假单胞菌(45]。同样,这是表明,ABR的大肠都有效来β-lactams与具有blaZ-blaI-blaR1操纵子(46]。
许多基因推测参与复杂的抗生素耐药性微生物的特点,但可用的数据是有限的。遗传的hyperproduction澄清AmpC增加了抗β-lactams diarrheagenic的确证大肠杆菌(12月)的研究。基于转录组分析AmpCβ-lactamases孤立从12月,据报道,突变发生的变化AmpCβ内酰胺酶基因导致其增加转录(47]。此外,它表明的突变β-N-acetylglucosaminidase和PG回收酶发挥着至关重要的作用在增强AmpC通过与ampR互动,调节基因的表达式AmpC此外,plasmid-carryingAmpC基因的来源AmpC超表达(43,48]。据报道,在非隔离的情况下,发现的信使rna表达水平大多是表达下调,除了几个隔离他们与控制菌株,表明其不致病的性质。敏感菌株可能差别不过,对这些基因的遗传增益或发展过程的结果。组成型表达的AmpC发生在一个较低的水平大肠杆菌(49,50];然而,各种突变可能导致本构的过度β-lactamase-producing基因(51- - - - - -53]。
发现的危机的程度AmpC抗菌素耐药性的影响上,我们调查了筛选分离的模式和相关的表型超表达AmpC。我们的研究结果表明,不同的隔离细菌种类包括在这项研究中,不管他们的感染源,100%抗氨苄青霉素、阿莫西林、无,ampicillin-sulbactam,哌拉西林,piperacillin-tazobactam,氯氨苄青霉素。总的来说,细菌分离显示多药耐药性的60.8%和延长15%的耐药性。一致,这些发现欠积极表型相关性CC-DDS测试的结果AmpC81% (43/53)大肠都有效隔离,86% (44/51)k .肺炎隔离,48.9% (24/49)铜绿假单胞菌隔离。从这些发现,很明显,100%的测试隔离上展示给广泛的抗菌素。此外,我们发现只有48.65%的隔离显示表达AmpC基因,这表明AmpC不是唯一负责ABR和非凡的ABR的因素是一个复杂的过程,涉及multigenetic因素。
制定一个有效的解决方案上的困境,建议有全面了解的生物原因上β-lactams,设计新的治疗方法基于我们的理解的微生物表现出ABR的潜在因素,并阐明广泛的抗生素滥用。上的已知原因可以总结如下:(i)显示抗细菌细胞壁等的活性成分β-lactams(如氨苄青霉素,青霉素)产生抑制细胞壁肽聚糖合成的活动,如大肠都有效。这个电阻属性可能被突变中呈现pbp5 (Met485⟶Ala)和LDTfm,导致降低的亲和力β-lactams细菌细胞壁,从而使肽聚糖合成(54,55]。(2)药物失活:β内酰胺环直接容易裂β内酰胺酶酶的编码基因blaZ抗生素(灭活56]。(3)细胞信号/电阻突变:获得内在基因的突变大肠都有效导致ABR是至关重要的因素。突变CroRS [57,58)、IreP IreK导致耐头孢菌素(39]。在这方面,这是显示β-arrestin是大师级的球员k .肺炎产生耐药性β-lactams [59]。为铜绿假单胞菌,缺乏oprD孔蛋白发展中耐碳青霉烯的结果。此外,抵抗铜绿假单胞菌来β-lactams是由于内在的突变基因(mexR nalB,支持,或nalD) / nfxB MexAB-OprM / MexCD-OprJ作为超表达的关键因素,分别是(39,53,60,61年]。根据药敏资料在目前的研究中,强烈的假设k .肺炎,铜绿假单胞菌,和大肠都有效隔离multicausative因素上。因此,这些分离株显示出类似的阻力模式测试抗菌素。
值得一提的是,关键问题“如何将这些上述resistance-related基因在序列或表达,导致上吗?“没有完全回答,底层的机制并不清楚。提出的答案是基于击倒化验发现表型的遗传功能的细菌对抗生素的敏感性62年- - - - - -64年]。此外,抗生素滥用的全球健康问题是一个重要的理由上,随着抗生素滥用的演化hypermutable细菌通过自然选择授权对抗生素,由传播电阻(R)的转移质粒(65年通过细菌细胞壁不同微生物作为载体的基因编码β内酰胺酶酶(63年]。
此外,值得说的是,抗菌疫苗,基于细菌发病机理和抗病毒疫苗,病毒引起的继发性细菌感染是一种祝福,结果在减少抗生素66年,67年]。作为上潜在的解决方法,(i)与噬菌体代替抗生素治疗(68年),(2)噬菌体疗法显著特异性归功于细菌比抗生素和可控的生物设计对细菌谱宽,(3)CRISPR-Cas9那样是一个有前途的生物技术工具废除细菌基因导致其ABR,尤其是对儿童和老人(69年,70年),(iv)进一步研究全面理解背后的分子生物学AmpC超表达需要开发新的抗感染药物。
我们的工作是一种细菌感染治疗领域,旨在反对抗生素滥用的共同习惯(65年]的健康个体,避免耐药微生物的出现。我们建议进一步研究发现新的治疗方案的性能除了antibiotic-monotherapy不同的细菌感染。
数据可用性
数据用于支持这项研究可以获得。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢Mohamed Tarek先生,女士Esraa Effat, Esraa女士作为礼尚往来,和穆罕默德·苏莱曼先生的药店,太阳神大学埃及、可持续发展和他们的帮助实施这项工作的准备和收集的隔离。