鉴定贝氏柯克斯体伊朗家畜原料奶中

摘要

贝氏柯克斯体是人类和动物Q热的病原体。本研究旨在确定贝纳特氏立克次c .在伊朗一些选定地区的奶用动物（山羊、绵羊和牛）的牛奶样本中，没有关于这种疾病流行的信息贝纳特氏立克次c .．在这项研究中，从三个省(德黑兰、哈马丹和马赞达兰)的43个农场收集了162个单独的牛奶样本。采用实时荧光定量PCR方法检测猪血清中IS1111a元素贝纳特氏立克次c .．162个样本中有23个(14.2%，95%可信区间(CI): 9.65 ~ 20.2%)为阳性贝纳特氏立克次c .通过实时PCR。贝纳特氏立克次c .检出率为10.17% (95% CI: 4.74 ~ 20.46)。在羊奶样品中，18.6% (95% CI: 9.74-32.62)阳性贝纳特氏立克次c .在15% (95% CI: 8.1-26.11)的牛牛奶样品中检测出。分子存在的证据贝纳特氏立克次c .在所有研究区域的奶类动物的牛奶样本中都能看到。这些发现表明贝纳特氏立克次c .感染，特别是在生牛奶样本中，值得伊朗卫生保健系统和兽医组织给予更多关注。

1.介绍

贝氏柯克斯体是一种挑剔的专性细胞内细菌，是人类和动物Q热的病原体。贝纳特氏立克次c .是一种传染性很强的生物体，对严酷的环境条件(如物理和化学压力)具有高度的抵抗力[1]．

Q热是一种全球分布的人畜共患疾病，其临床症状从急性Q热(自限性疾病)的流感样症状到人类慢性Q热的严重心内膜炎不等[2]．吸入的贝纳特氏立克次c .-受感染的气溶胶是传播给人类最常见的途径[1]．农场动物，包括牛，绵羊和山羊是主要的水库贝纳特氏立克次c .［2]．家畜关节病通常无症状，但临床表现如流产、死产、不孕症、乳腺炎和子宫内膜炎等也有报道[3.，4]．受感染的家畜大量脱落贝纳特氏立克次c .在分娩产品、牛奶、粪便、阴道粘液和尿液中[1]．脱落的贝纳特氏立克次c .在初次感染后，可在阴道黏液、粪便和牛奶中持续数月至1-2年[5]．

鉴于这种细菌在农场动物中的高患病率，有必要评估是否存在贝纳特氏立克次c .在动物源性食品中，牛奶是重要的营养来源贝纳特氏立克次c .在动物性食物中[6]．受感染的牲畜棚贝纳特氏立克次c .在不同时期加入牛奶。它们的乳汁可以通过粪便、阴道粘液或尿液被这种细菌污染[7]。因此，摄入受污染的牛奶或乳制品可能是人类感染的一个来源。这种细菌在牛奶中的显著流行导致人们越来越担心乳制品可能是人类Q热疾病的感染源[6]．

根据目前的数据，伊朗被认为是Q热的地方病，这种疾病在动物和人类人群中具有显著的血清流行率[8]．然而，伊朗卫生保健系统很少诊断和报告人类临床Q热病例。基于伊朗的一项系统综述和荟萃分析研究，汇集了估计的患病率贝纳特氏立克次c .在牛奶中的比例分别为15.1%、7.8%和3.8% [7].尽管有几项研究表明贝纳特氏立克次c .在伊朗的牛奶样本中，仍然没有关于感染在该国大部分地区传播的信息。本研究旨在检测贝纳特氏立克次c .在伊朗调查较少的地区，包括德黑兰、哈马丹和马赞达兰省，牛奶样品中存在的。

2.材料和方法

2．1．抽样

2017年6月至8月在德黑兰、马赞达兰和哈马丹省进行了抽样(图)1)。从饲养山羊、绵羊和牛的奶牛场进行取样。从每只奶牛中，50只 在无菌管中收集1毫升生牛奶，并根据塔比亚特·莫达雷斯大学生物医学研究伦理委员会批准的协议（伦理规范：IR.TMU.REC.1395.510）进行。

2．2．牛奶加工和DNA提取

根据先前公布的方案，在实验室对所有牛奶样品进行处理，以去除奶油和沉淀细胞（包括细菌）[9]．最终沉淀溶解在1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，在−20℃保存直到DNA提取。沉淀物溶液(200μL)进行DNA提取。采用罗氏高纯PCR模板制备试剂盒(Roche High Pure PCR Template Preparation Kit, Germany)进行基因组DNA分离。所有的提取步骤都按照制造商的说明进行。

2.3.蛋白质的分子鉴定贝纳特氏立克次c .

利用引物进行实时PCR (TaqMan Real-time PCR)。AAAACGGATAAAAAGAGTCTGTGGTT反向;CCACACAAGCGCGATTCAT)和靶向IS1111a元素的探针(6-FAM-AAAGCACTCATTGAGCGCCGCG-TAMRA)贝纳特氏立克次c .［10]．每个实时PCR反应(最终体积20μ五十） 包括900 每个正向和反向引物的nM，200 纳米探针，10 μL of 2x RealQ Plus Master Mix for Probe (Ampliqon, Denmark)μ提取DNA的L。实时PCR程序在Corbett 6000转子基因系统（澳大利亚维多利亚州Corbett）中为95°C持续10分钟，随后为94°C持续15秒，60°C持续60秒（45个周期）。九英里菌株（九英里I期/RSA 493）的DNA用作阳性对照，双蒸馏水用作阴性对照。使用Rotor Gene®分析结果问2.3.5软件(试剂盒)。如果周期阈值(Ct)小于或等于38，则实时荧光定量PCR检测为阳性。

２.４.数据分析

数据分析使用SPSS软件(版本24,SPSS Inc, Chicago, IL)。值低于0.05被认为是显著的。

3.结果

总共从三个省(德黑兰、哈马丹和马赞达兰)的43个农场采集了162份牛奶样本。从德黑兰和马赞达兰省采集了59个样本(来自14个奶山羊群)(见表)1）.此外，分别从13个和16个奶牛场采集了43份羊乳样品和60份牛乳样品(见表)2和3.）.

162个样本中有23个(14.2%，95%可信区间(CI): 9.65 ~ 20.2%)为阳性贝纳特氏立克次c .通过实时PCR。贝纳特氏立克次c .检出率为10.17% (95% CI: 4.74 ~ 20.46)。的患病率贝纳特氏立克次c .在马赞达兰省和德黑兰省，分别为11.11%和10%1）.

贝纳特氏立克次c .在18.6%（95%可信区间：9.74–32.62）的羊奶样本中检测到。最低和最高的贝纳特氏立克次c .分别在哈马丹(10.53%)和德黑兰(33.33%)省(表2）.

最后,贝纳特氏立克次c .在15%（95%置信区间：8.1–26.11）的牛乳样本中检测到。最高的失业率贝纳特氏立克次c .分别在德黑兰(23.08%)和哈马丹(15%)省出现。马赞达兰省牛奶样品中未发现阳性样品(见表)3.）.

4.讨论

这项研究是在伊朗调查较少的地区进行的，之前没有关于这方面的数据贝纳特氏立克次c .在动物和生奶中感染。根据我们的结果，分子证据贝纳特氏立克次c .在所有研究地区的奶类动物的牛奶样品中检测到。伊朗的各种研究表明Q热在伊朗是一个挑战。在我们的研究中，14.2%的生奶样品呈阳性贝纳特氏立克次c .通过实时PCR。这些发现表明贝纳特氏立克次c .伊朗的兽医机构和卫生保健系统应将其作为一个检测目标。

根据本研究的结果，贝纳特氏立克次c .在10.17%的羊奶样品中检测到。的患病率贝纳特氏立克次c .在马赞达兰省和德黑兰省分别为11.11%和10%。不同的流行率贝纳特氏立克次c .据报道，来自伊朗的羊奶中有16.6%来自西阿塞拜疆省(伊朗西北部)[11]，在克尔曼省(伊朗东南部)占16.1% [12]， 1.8%在查哈马哈-瓦-巴克蒂亚里省(伊朗西南部)[13]， 4.5%在伊斯法罕省(伊朗中部)[14]．此外，发病率较高(35.7%)贝纳特氏立克次c .在库姆省（伊朗中部）有流产史的山羊的牛奶样本中报告[9]．在其他国家，存在贝纳特氏立克次c .在比利时为6.3-12.1% [15，美国占14.3% [16，黎巴嫩为17.2% [17]．在一些国家，山羊奶通常是非巴氏消毒的。此外，从山羊奶生产奶制品不需要温度和巴氏杀菌过程。因此，必须认真注意存在的问题贝纳特氏立克次c .羊奶。

在目前的研究中，18.6%的羊奶样本对Q热的病原体呈阳性。在德黑兰、马赞达拉和哈马丹省，羊奶中这种细菌的流行率也分别为33.3%、20%和10.5%。在其他研究中贝纳特氏立克次c .据报道，西阿塞拜疆省的羊奶中有7.6%的比例[11]，伊斯法罕省占5.7% [14，伊朗西部洛雷斯坦省占20.8% [18]，在赞詹省(伊朗西北部)占3.3% [19]，库姆省为35.7% [9]．在其他国家，黎巴嫩的患病率为10% [17，匈牙利4% [20.]土耳其为6.5%[21]，西班牙占22% [22].根据这项研究以及伊朗和其他国家的其他研究结果，似乎贝纳特氏立克次c .在羊奶中很常见。和山羊奶一样，伊朗人对食用生羊奶及其产品有着浓厚的兴趣，尤其是在农村和游牧人口中，他们食用这些未经巴氏消毒的产品。因此，关注这些社区的乳源性病原体非常重要，兽医组织必须优先考虑家畜的控制和预防策略。卫生保健系统还应该为高危人群提供培训。

幸运的是，在伊朗，牛奶主要以巴氏杀菌的形式消费，人们对未经巴氏杀菌的牛奶及其产品的兴趣较少。然而，在一些农村和欠发达地区，仍有消费未经巴氏杀菌的牛奶及其产品的趋势。贝纳特氏立克次c .在本研究的牛乳样品中检测出15%。的患病率贝纳特氏立克次c .在德黑兰为23.1%，在哈马丹为15%，在马赞达兰省为0%。根据最近的研究，贝纳特氏立克次c .据报伊斯法罕省为8.6% [23，库姆省33.3% [9，占赞詹省的8.3% [19]，伊朗南部法尔斯省占11% [24]．不同的流行率贝纳特氏立克次c .在其他国家的牛乳中有报道：匈牙利为8.7%[20.，黎巴嫩15.1% [17，荷兰为18.8% [25]，意大利为27%[26]因此，在所有被调查国家，牛在牛奶中的排泄是这种细菌在环境中传播的最重要途径。

本研究的局限性之一是部分地区样本数量少，难以判断患病率比较。因此，建议在今后的研究中，在研究区域大量收集样本。

根据我们的结果，分子证据贝纳特氏立克次c .在所有研究地区的奶类动物的牛奶样品中检测到。这些发现表明贝纳特氏立克次c .感染，特别是在生牛奶样品中，可能对伊朗的农民和消费者构成严重的Q热风险。

数据可用性

支持本研究发现的数据可由通讯作者在合理的要求下提供。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了塔尔比亚特-莫达雷斯大学（伊朗德黑兰）、伊朗巴斯德研究所和卫生部传染病控制中心（授予810）以及伊朗国家科学基金会（InSF；第91004716号合同）的资助。.资助者在研究设计、数据收集、分析和解释、手稿撰写以及提交手稿出版的决定中不起任何作用。

工具书类

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