筛选和鉴定的耐热性的Amylase-Producing细菌隔绝Afdera土壤样本,遥远地区,Amylase-Coding基因和分子检测gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

研究热稳定的amylase-producing细菌在极端环境中有至关重要的作用克服不同工业的挑战。远方地区是最热的和咸的地区之一,使其成为极端微生物的家。本研究旨在筛选和描述amylase-producing细菌隔绝Afdera土壤样本,遥远地区,amylase-coding基因的检测。因此,共有49个细菌分离得到收集土壤样本。这些三个分离株(M2、M8和M13)选择的基础上平均直径明显区形成和时间使脱色碘溶液。根据他们的形态和生化特征,隔离标识为属gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba。amylase-coding基因的PCR扩增和检测证实淀粉酶基因的存在的三个细菌隔离。优化这些分离淀粉酶的生产时间是48小时(M13和M8)和72小时(M2)对应的淀粉酶活性为0.67 U /毫升M13, 0.74 U /毫升M8和0.73 U /毫升M2的最适温度55°C。研究温度的影响表明,粗酶的最大活动和稳定在75°C, 70°C, 65°C,隔离M13, M8,分别和M2。此外,淀粉酶产生所有隔离保留66.41%以上的原始活动孵化后在一个温度范围从55到80°C 50分钟。最佳pH值对所有原油淀粉酶的活动范围从5到9在pH值峰值活动8。他们的活动明显减少锌的存在gydF4y2Ba^{+ 2gydF4y2Ba}和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba};然而,他们的活动增加了Ca的存在gydF4y2Ba^{+ 2gydF4y2Ba}。此外,三个原油淀粉酶稳定与氯化钠浓度(0 - 3米)。淀粉酶的这一发现嗜热、嗜盐的特点提供了一个广泛的应用在食品、酿造、纺织、淀粉、纸,威慑产业。因此,识别这些gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba分离和净化以及在分子水平的详细描述类型的淀粉酶推荐为不同行业的有效利用。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

酶是生物催化剂,启动和加速成千上万的活细胞的生化反应。酶是特定分子由于选择性结合位点的每种类型的酶具有各自的衬底。他们在各领域的应用等在食品制造、发酵、动物营养、洗涤剂、化妆品、酿造、纺织造纸行业,制药(药物),和作为研究和开发工具gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在酶、淀粉酶中起着重要的催化作用分解淀粉的单体化合物,最小的是葡萄糖(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。虽然淀粉酶可以产生生理上的植物、动物、人类和微生物、酶来源于微生物目前使用的大多数行业(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

微生物淀粉酶而不选择其他种类的淀粉酶从植物和动物由于其生化多才多艺,更高的产量,稳定,容易获得大量的微生物菌株的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。此外,批量生产的能力和易用性,可以改造获得所需特性的酶是(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

目前,淀粉酶生产已经达到了世界上30%的酶市场和不断增加gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。许多微生物已确定和选择的淀粉酶生产因为他们的可用性,他们的快速增长,导致发酵周期短,他们的简单,他们的能力会分泌到细胞外蛋白质中,他们所提供的最高产量,和一般处理安全(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。然而,从细菌和真菌中提取淀粉酶主要生物技术的各种应用程序(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),包括gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp。gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Basp。gydF4y2Ba普罗透斯gydF4y2Basp。gydF4y2Ba大肠杆菌、假单胞菌gydF4y2Basp。gydF4y2Ba链霉菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Basp。(例如,gydF4y2Ba曲霉属真菌ficuumgydF4y2Ba),gydF4y2BaTalaromyces emersoniigydF4y2Ba,gydF4y2BaThermomyces lanuginosusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。淀粉酶热稳定性是一个理想的特性用于各种工业应用(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。嗜热生物因此特殊利益的新型耐热性的酶(来源gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。嗜热细菌(通常许多物种的gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba)已报告经济良好的耐高温淀粉酶(来源gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

极端微生物是微生物,可以在极端环境中成长壮大,在各种工业过程的主要条件(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。许多hyperthermophilic微生物拥有starch-hydrolyzing酶在基因组,即使他们住在环境中淀粉是罕见的gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。使用耐高温淀粉酶在工业过程的优点包括降低污染和扩散速度的增加风险(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。最常见的栖息地的嗜热生物地热和火山热液加热系统,潜艇盐水热喷口,和温泉水土gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。相信微生物发现在这些领域有能力生产酶可以在严酷的函数(极端)条件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。他们是在分子水平上适应承受这些恶劣的条件,而这些生物催化剂称为extremozymes。在这其中,耐高温淀粉酶是一种最重要的工业酶(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

使用淀粉酶不时增加全球包括埃塞俄比亚。尽管如此,有巨大的兴趣探索酶具有更好的特性,如耐热性的生淀粉降解淀粉酶适合工业应用和有成本效益的生产方法。在这一行业在温和条件下,污染和产品批次不一致是一个重大的挑战,需要我们在极端条件下进行发酵活动污染几乎是零(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。出于这个原因,大多数starch-processing工业设计在高温操作,但是温和的酶从微生物生存环境条件在工业条件下容易变性温度,pH值等参数是高或低(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。研究仍在进行,找出产生更稳定的淀粉酶的菌株在低成本酶产率较高。因此,starch-degrading酶的存在有明显的高温稳定性是至关重要的。的一个重要选择是研究微生物种群,可以在极端环境中生存和繁殖。gydF4y2Ba

埃塞俄比亚是赋予一系列的自然和热水温泉地热网站。远方地区是埃塞俄比亚最热的地区之一。细菌可以适应并产生淀粉酶可以出现在这个地区。因此,有必要对评估的潜在地热的网站作为一个潜在的细菌物种来源的生产活动,耐热,可重用的淀粉酶对淀粉的水解行业。因此,本研究旨在孤立和筛选耐热性的gydF4y2BaαgydF4y2Ba-amylase-producing amylase-coding基因的细菌和检测。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。研究区域的描述gydF4y2Ba

在目前的研究中,从Afdera收集土壤样本,埃塞俄比亚阿法尔区。Afdera是遥远的地区之一是最热的,干燥的地方在一年的大多数时间在季风与平均气温> 27.5°C到45°C在旱季。这个地区包含在炎热的热带和沙漠气候。它的海拔范围从114低于海平面到海拔1300米。年降雨量每年不同,但大多是低于400毫米(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.2。土壤收集和孤立的细菌gydF4y2Ba

收集土壤样本随机从Afdera埃塞俄比亚。从这些土壤样本,耐热性的amylase-producing细菌被连续稀释法从土壤分离(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。总之,1克土壤溶解在9毫升无菌蒸馏水在不同的容器和热休克在90°C 15分钟紧随其后的是冷却到室温。然后,适合连续稀释(10gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}-10年gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba})进行gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。0.1毫升样品在营养琼脂扩散板其次是孵化50°C的24 - 48小时,直到得到了典型的细菌菌落。殖民地表现出明显的形态学差异被接种进一步纯化,在营养琼脂裸奔。纯分离获得的选择和转移到刚做好的淀粉琼脂板和孵化50°C 48小时(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。然后,他们被储存在4°C到需要进一步分析和研究。gydF4y2Ba

2.3。筛选和选择Amylase-Producing细菌gydF4y2Ba

净化高温隔离,在淀粉琼脂淀粉酶生产测试(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。殖民地的一部分是刚做好的亚文化淀粉琼脂板点方法和孵化50°C 2天。孵化后,盘子充斥着1%碘溶液(克碘:250毫克碘晶体2.5添加到通用碘化钾溶液和125毫升的水,储存在室温下)。板块5 - 10分钟,然后保持原状,丢弃了碘溶液减压从每个盘子。任何形成菌落周围明确区观察,和直径测量。周围的最大表现出明显的隔离区域选择(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。殖民地被接种到试管检查有类似的媒体,在同一温度、孵化和洪水两滴碘溶液,使脱色碘的解决方案和时间记录(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.4。识别和描述细菌隔离gydF4y2Ba

2.4.1。宏观和微观特征的隔离gydF4y2Ba

隔离进一步的特点是它们的形态和生化特性根据Bergey限定的细菌学手册(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。菌落形态,如大小、形状、颜色和纹理。革兰氏染色、芽孢染色和运动性测试协议后进行伊斯兰教(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),哈雷和普雷斯科特(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),而穆雷et al。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

2.4.2。生化特性gydF4y2Ba

特征的细菌分离,各种生化测试。过氧化氢酶和酪蛋白水解测试方法后进行Bennani et al。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。柠檬酸利用率、尿素水解和增长在厌氧条件下也进行(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。氧化酶和三糖铁测试执行协议后Tarrand和GroschelgydF4y2Ba27gydF4y2Ba]和Priyadarshini [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

2.5。Amylase-Coding基因的扩增和检测细菌隔离gydF4y2Ba

放大的amylase-coding进一步进行了细菌分离株的基因。总基因组DNA提取使用GenElute™细菌基因组DNA工具包(美国Sigma-Aldrich)。gydF4y2Ba

细菌隔离最初生长在Luria Bertani媒体24小时在一个孵化器。孵化后,2毫升细菌细胞悬浮生长和离心机在15000转10分钟在4°C的温度。然后,resuspended细胞被用来提取细胞DNA根据提供的协议GenElute™细菌基因组DNA工具包。中提取DNA是储存在4°C进行进一步的工作。gydF4y2Ba

2.5.1。测量的DNA浓度和纯度gydF4y2Ba

DNA浓度使用NanoDrop分光光度计测量。nanodrop, 1.5gydF4y2BaµgydF4y2BaL nuclease-free水作为空白。空白被通过使用纸巾,和1.5gydF4y2BaµgydF4y2BaL的样本加载gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。在ng / DNA浓度测量gydF4y2BaµgydF4y2Bal .琼脂糖凝胶电泳也进行定性判断孤立的DNA的纯度。gydF4y2Ba

2.5.2。使用聚合酶链反应扩增DNA的提取gydF4y2Ba

从提取DNA, amylase-coding基因放大使用PCR(聚合酶链反应)。这样做是使用以下具体primer-forward: 5′AGTGCTGAA ACGGCGAACAAATCGAA3′和反向:5′CTCAATGGGGA AGA棉酚CCGCTTAAG 3”。使用的引物是普拉萨德(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba与一些修改)。PCR混合物准备使用索利斯生物因素5 x FIREPolgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba主人准备混合负载。1gydF4y2BaµgydF4y2BaL模板DNA和1gydF4y2BaµgydF4y2Ba每个引物被添加在装货前对L PCR的样品机。PCR反应设置为40gydF4y2BaµgydF4y2BaL反应体积0.2毫升薄壁PCR管。gydF4y2Ba

热循环是程序如下:最初在94°C 2分钟变性;30个周期为30秒94°C的变性,退火在50°C,持续30秒,扩展为2分钟在72°C,和最后一个扩展在72°C 5分钟。PCR进行30周期。后来,扩增子是储存在−20°C进行进一步的工作gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.5.3。用琼脂糖凝胶电泳检测DNAgydF4y2Ba

检查后PCR,扩增水平在1.0%琼脂糖平板电泳凝胶在Tris-Borate-EDTA(乙二胺四乙酸)或此种缓冲为伊斯兰教所使用的方法gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。琼脂糖溶解在1 x Tris-Borate-EDTA缓冲给最后一个1.0%琼脂糖的浓度和在微波炉加热溶解大约30秒。然后,它被允许冷却大约50°C。为了DNA染色乐队,2gydF4y2BaµgydF4y2BaL(溴化乙锭染色剂添加到琼脂糖和混合冷却。琼脂糖就涌上托盘先前设定的梳理和巩固。一个5gydF4y2BaµgydF4y2BaL整除的PCR产品是加载到单个井的凝胶。梯子的尺寸1 kb +被用来确保所需的基因的扩增和测量准确的产品尺寸。紫外线照明器的DNA乐队拍摄系统,和细菌隔离被评为淀粉降解nonstarch有辱人格的基础上是否有放大的结果。gydF4y2Ba

2.6。淀粉酶的生产gydF4y2Ba

淀粉酶的生产之前,培养液是由转移铂环量amylase-producing细菌培养在厄伦美厄烧瓶(250毫升)含淀粉酶筛查肉汤(淀粉汤)(50毫升)和50°C的一个孵化器孵化瓶24小时的250 rpm。gydF4y2Ba

淀粉酶的生产进行了使用可溶性淀粉作为底物(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。选择隔离分别培养在50°C温度,pH值7,250 rpm 48小时在100毫升淀粉汤(淀粉1%、0.5%蛋白胨和酵母提取物1.5%)接种后4毫升的通宵细菌培养。6毫升的样品后退出烧瓶48和72小时的潜伏期。使离心后得到的上层清液游离文化肉汤在10000 rpm 10分钟是用作粗酶来源。粗提取液是用来描述在不同条件下的酶活性和稳定性。gydF4y2Ba

2.7。酶测定和表征gydF4y2Ba

2.7.1。淀粉酶活性测定gydF4y2Ba

淀粉酶活性决定通过测量可溶性淀粉的释放还原糖。反应混合物中含有0.5毫升的粗酶,和4.5毫升0.1磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)加入2毫升的可溶性淀粉(1%)。孵化后的10分钟30°C水浴颤抖,反应是停止的2毫升3,5-dinitrosalicylic酸(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。管是在煮15分钟开发颜色,然后冷却到室温。光密度(OD)产生的有色溶液为540 nm空白。酶测定一式三份,执行在所有情况下,结果是平均的三个决定。麦芽糖制备标准曲线的方法进行计算的麦芽糖解放了。OD数据被用来找出麦芽糖的未知的麦芽糖浓度标准曲线。淀粉酶活性测定。一个单位的酶活性被定义为所需的酶中解放出来gydF4y2BaμgydF4y2Ba每分钟在试验条件下摩尔麦芽糖。gydF4y2Ba

2.7.2。酶的生产和表征gydF4y2Ba

酶生产、活动、和稳定性特征测定底物浓度(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,3.0%,和4.0%淀粉解决方案)、温度(40岁,45岁,50岁,55岁,60岁,65年,70年和75°C),潜伏期(12、24、48、72、96和120小时),最佳pH值使用不同的缓冲区(醋酸缓冲,pH值:3到5;钾钠缓冲,pH值:6到8,Tris-hydrochloride缓冲区,pH值:9 - 11),氯化钠浓度(主/ M氯化钠),和不同的金属离子浓度(1.0、5、10毫米CaCl的盐gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。此外,粗酶的稳定性是衡量孵化原油淀粉酶(60分钟)在不同反应温度(55 - 105°C)。酶生产、活动、和稳定增长耐热性的细菌分离后测定淀粉汤(淀粉1%、0.5%蛋白胨和酵母提取物1.5%)除了底物浓度的测试。一个参数进行了测试。在试验条件下剩余淀粉酶活性测定。剩余淀粉酶活性计算使用以下方程:gydF4y2Ba

最高的酶活性。gydF4y2Ba

2.7.3。数据分析gydF4y2Ba

酶活性的测定与三个独立复制一式三份,执行和数据呈现在图和表的平均三个平行实验。执行统计评价平均值之间的显著差异在95%的水平(使用单向方差分析gydF4y2Ba )gydF4y2Ba借助社会科学统计软件包(版本22)。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。分离和筛选Amylase-Producing从土壤细菌gydF4y2Ba

在这项研究中,收集土壤样本的隔离细菌从热温度区域,Afdera,埃塞俄比亚。根据菌落形态,共有49个不同的殖民地独立。从这些,使用碘溶液,15(31%)隔离观察给带间隙在他们的殖民地。从表可以看出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba隔离显示一个伟大的变化清晰的区域的大小在淀粉水解产生的琼脂板从最大至少1.1毫米到5.9毫米。gydF4y2Ba

3.2。选择最好的Amylase-Producing细菌gydF4y2Ba

15的总积极的隔离,三个隔离被选作进一步调查。强有力的细菌的选择是由比较方面的相互隔离的直径明显的水解和时间使脱色碘溶液(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。结果表明,较高的隔离清除区也给更高的淀粉酶水解的活动。这一步选择了三个有效的隔离。gydF4y2Ba

三个隔离,即M13, M8, M2,产生最大的光环直径比(5.96±0.057,4.96±0.057,4.73±0.115毫米)和短时间使脱色碘溶液(6.67±0.577,9.67±0.577,12.33±0.577秒)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),分别比其他筛选分离和选择深造。表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba演示了结果从淀粉琼脂培养基和比较平均清除区amylase-producing细菌的比例淀粉琼脂板上。清除区平均直径比和时间使脱色碘溶液在不同生产隔离显示显著差异(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

3.3。识别和描述所选的细菌隔离gydF4y2Ba

细菌分离株的形态和生化特征总结如下(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。数据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba也显示革兰氏染色的结果和执行的一些生化测试三个隔离。根据假定的识别结果,假设隔离平方米,M8, M13可能属于属”gydF4y2Ba芽孢杆菌。gydF4y2Ba”gydF4y2Ba

3.4。Amylase-Coding基因的扩增和检测gydF4y2Ba

3.4.1。测量的DNA浓度和纯度gydF4y2Ba

DNA浓度和纯度被nanodrop检查(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和琼脂糖凝胶电泳(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。量化(DNA的浓度)的结果为选定的隔离是2654.56,4528.55,1702.56,和422.346 ng /gydF4y2BaµgydF4y2BaL质量为1.9,1.91,1.86和1.9gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}/一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}比率为平方米,M8, M13,gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba(分别为积极控制)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

定性评估的孤立的DNA是由运行在琼脂糖凝胶来确定用琼脂糖凝胶电泳纯DNA的存在。可以看出,分离株的基因组DNA乐队平方米,M8, M13,gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)迁移的车道井1,2,3,4,各自的。“L”表明DNA梯。gydF4y2Ba

3.4.2。Amylase-Coding基因的扩增和检测gydF4y2Ba

可以看出amylase-coding基因群隔离M13, M8, M2(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba沿着车道井2)迁移,3和4,分别是略低于2000个碱基对(bp)或1855年英国石油公司相比,梯子,沿着车道的“L迁移。“巷1表明DNA带的积极控制(gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba),巷5显示,没有乐队可以看到消极的控制。gydF4y2Ba

3.5。淀粉酶的生产gydF4y2Ba

3.5.1。课程的时间对淀粉酶的影响生产gydF4y2Ba

时间进程的影响后发现细胞生长12小时的孵化。除了平方米,其余两个隔离(M13和M8),最大观察细胞生长(最佳时间)在孵化后的48小时,但在M2,最大观察细胞生长在72小时的潜伏期(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。隔离,扩展的时间进程之外的最佳时间进程导致了细胞生物量的减少。在研究隔离,有意义gydF4y2Ba )gydF4y2Ba不同生物质在不同发酵时间。gydF4y2Ba

时间进程的影响对淀粉酶生产观察孵化12小时后,最大的最佳时间内淀粉酶的生产三个隔离观察48 - 72小时,而最大淀粉酶产量从72年到96年之间隔离观察M2小时(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。有降低淀粉酶的活性隔离后72小时预计随着微生物生物量后72小时(数字开始下降gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。从不同的隔离产生的淀粉酶活性在不同潜伏期显示显著差异(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

3.5.2。培养温度对淀粉酶的影响生产gydF4y2Ba

生产淀粉酶的最佳温度隔离M13, M8,和M2被发现55°C,导致淀粉酶活动0.84 U / mL, 0.82 U / mL,分别为0.79 U /毫升(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),超出该酶活性逐渐降低。从不同的隔离产生的淀粉酶活性在同一温度没有显示显著差异(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

3.5.3。酶的特性gydF4y2Ba

(我)gydF4y2Ba底物浓度对淀粉酶活性的影响gydF4y2Ba。如图gydF4y2Ba10gydF4y2Ba、淀粉酶活性与淀粉浓度的增加从0.5升高到4%,它拒绝后。在这项研究中,最高的淀粉酶活性观察淀粉浓度2%。有显著性差异(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba淀粉在淀粉酶活性在不同浓度。gydF4y2Ba

(2)gydF4y2Ba温度对酶活性和稳定性的影响gydF4y2Ba。温度对淀粉酶的活性的影响,研究了通过孵化培养滤液衬底的温度从50到100°C。淀粉酶活性最高的隔离M13和M8被记录在75和70°C,分别,而对于平方米,65°C(图10分钟孵化时间gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。淀粉酶活性的酶中相同的隔离在不同的温度下表现出显著差异(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

粗酶的特点在不同的温度下(55 - 105°C)在每个温度60分钟的孵化。淀粉酶产生所有隔离保留66.41%以上的原始活动后孵化温度范围从55到80°C 50分钟。此外,淀粉酶产生隔离M13保留原来的活动的80.94%在80°C的温度孵化后60分钟。进一步孵化淀粉酶产生M13, M8和M2在75°C 50分钟保留原来的活动85.94%,76.49%,和70.54%,分别为(图gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。结果还表明,原油淀粉酶的三个隔离失去他们所有的原始活动20分钟后潜伏期超过100°C。从不同产生的淀粉酶酶的稳定性隔离在不同的温度显示显著差异(潜伏期gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

(3)gydF4y2BapH值对酶活性的影响gydF4y2Ba。pH值对淀粉酶的活性的影响是研究孵化文化pH值从4到11。与pH值的增加,酶是观察到的活动增加。最佳pH值的活动三个分离株与高峰活动的范围在5 - 9在pH值8。然而,酶活性下降后pH值9。淀粉酶从隔离M13, M8和M2留存85年86.85,和89.59%的活动分别为9,pH值(图gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。淀粉酶活性的酶不同分离株表现出显著差异(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba在不同pH值gydF4y2Ba

(iv)gydF4y2Ba氯化钠浓度对淀粉酶的稳定性的影响gydF4y2Ba。盐对酶活性的影响呈现在图gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。盐公差评估每一个酶的孵化酶的不同氯化钠浓度(0到8 M氯化钠)。除了隔离M13,其余两个隔离的剩余活动从0到100% 3 M氯化钠溶液,但隔离M13保留99.98%的原始活动3 M氯化钠浓度。所有的剩余活动隔离4 M氯化钠浓度大幅下降后,即,52.96,45.44,62.96%,M13, M8, M2,分别在8 M氯化钠浓度。gydF4y2Ba

(v)gydF4y2Ba金属离子的影响gydF4y2Ba。额外的金属离子对淀粉酶活性的影响决定的各种金属离子的浓度为1毫米,5毫米,10毫米(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。二价阳离子的测试中,淀粉酶的活动三个隔离所有的三个浓度显著降低(1毫米,5毫米,10毫米)的锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},但酶的活性在所有隔离高5毫米的存在(M8和M2)和10毫米(M13) CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}。10毫米毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}抑制了23.1%、21.7%、和22.4%的淀粉酶活性M13, M8,分别和M2。淀粉酶活性的酶产生不同分离株在不同金属二价阳离子的孵化显示显著差异(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

在全球范围内,淀粉酶是经常用于食品、纺织、洗涤剂、纸和行业。此外,制药和化工行业使用淀粉酶定期屈服他们的产品(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。从嗜热酶的生产主机嗜中温主机相比有几个优点,包括降低污染的风险,增加底物和产品溶解性,温度和最适条件的匹配这些细菌的酶用于同步糖化和发酵gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。由于有这个属性,蛋白质或酶等生物通常显示高温热稳定性/活动(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。出于这个原因,高温amylase-producing细菌是必要的。目前,enzyme-based使用耐高温淀粉酶水解是广泛用于淀粉液化(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。自工业淀粉酶通常从细菌和真菌中提取,是强制隔离本地高amylase-producing应变。Amylase-producing微生物可以分离不同的栖息地,但土壤是Amylase-producing微生物的最佳来源。由于土壤中各种类型的细菌的可用性,它被选为细菌的来源隔离和有时被认为是仓库的淀粉分解的微生物(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。土壤为本研究收集从Afdera遥远地区,埃塞俄比亚。在这项研究中,所有隔离15淀粉酶生产商。根据starch-degrading效率和很短的时间内使脱色碘淀粉汤,只有三个隔离选择和设计为平方米,M8, M13。他们是由淀粉水解试验和检测任何明确区生产通过添加碘溶液在殖民地。明确区域产生是由于缺乏淀粉水解的淀粉酶酶分泌的细菌。这表明可能的隔离产生潜在的淀粉酶的能力,可用于不同的工业应用。此外,这个结果隐含研究区域的土壤富含嗜热细菌可以产生淀粉酶和其他重要的工业酶。gydF4y2Ba

下一步的研究鉴定细菌种类的形态和生化特征。这样做是为确认隔离属于属。光显微镜下观察细菌细胞后,革兰氏染色和内芽孢染色。Bergey手册的基础上决定的细菌学,隔离平方米,M8,和M13分为革兰氏阳性,杆状排列成链,和孢子形成细菌可能属于属的物种gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。据估计,gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp.酶由全球酶市场约占总数的50% (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。尽管属的成员gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba孢子形成的细菌,本研究的三个隔离不属于这个属过氧化氢酶阳性和有氧和厌氧条件下生长的能力。此外,这些隔离已确定作为能动的。各种生化测试进行验证的细菌分离株的生化特性决定,除了淀粉酶,这些细菌隔离也可以产生酶过氧化氢酶、脲酶和氧化酶(M8除外)。gydF4y2Ba

这些被处理通过PCR amylase-coding基因的DNA隔离和放大。DNA提取方法适用性是由描述中提取DNA的数量和质量。DNA量是一个信号,提取效率和质量参数(纯度和完整无缺)表明DNA PCR抑制剂是免费的。DNA分离出的细菌分离株显示最大淀粉酶生产。量化的DNA是由nanodrop确定DNA的纯度。这个结果表明与纯度1.8 - -2.0的比率在接受范围内gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}/一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}比率。类似的结果是由奥尔森和明天gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}/一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}比率是PCR的更好的指标,比率在1.8和2.0之间gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}/一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}接受为纯粹的DNA(指示gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。(ng / DNA的浓度gydF4y2BaµgydF4y2BaL)为每个样本也决定从NanoDrop分光光度计,给了PCR的浓度。剪切是评估使用DNA琼脂糖凝胶电泳。DNA定性估计的1%琼脂糖凝胶给单身,夏普,和不同的乐队没有任何污迹。因此,DNA的质量没有任何退化成功隔绝所有选定的隔离。gydF4y2Ba

特定的引物,即AmyF和AmyR用于放大淀粉酶基因的DNA序列的孤立的细菌物种。这些引物设计基础序列互补的序列amylase-coding基因,因此附着在基因所在区域进行复制。使用相同的引物与一些修改研究普拉萨德(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]amylase-coding基因的检测。用PCR方法进行放大。之后,乐队的放大基因序列后可见PCR产品运行在1%琼脂糖凝胶和紫外线透照器查看。正如预期的那样,获得淀粉酶基因的DNA带三个隔离观察的大小小于2000个基点(1855个基点)(平等大小与积极的控制(gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba)amylase-coding基因)。淀粉酶是有益的微生物生产经济,给了高收益,可以设计生产酶的特色。淀粉酶生产可能会进一步的基因被克隆到其他生物,和淀粉酶生产可以优化的过程。gydF4y2Ba

淀粉酶的生产从微生物在深层发酵极大地影响许多物理化学参数(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。淀粉被淀粉酶分解的速率取决于各种参数。描述一种酶导致测定酶的最适发酵条件。此外,抑制金属离子和盐的浓度对这个特定酶可以检查。淀粉酶的性质应该满足其应用,因此,必须检查其最佳条件,可以通过描述(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

课程的时间达到最高的酶水平与选定的隔离的特点和增长率。淀粉酶的最佳时间生产的三个隔离被发现48小时M13和M8。类似的结果也被观察到gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp。DLB9 [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。相比之下,72小时的时间增长的最佳时间隔离M2淀粉酶生产然后拒绝。这可能是由于减少微生物生长与可用养分的消耗,生产有毒代谢物和自我分解造成的淀粉酶产生了其他的研究报道,哈克et al。gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。不同的潜伏期有被其他研究报告最大淀粉酶生产:24小时gydF4y2Ba蜡样芽胞杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba),48小时gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaJS2004 [gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),72小时gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaNCTC10400,gydF4y2Ba蜡样芽胞杆菌gydF4y2BaATCC14579,gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),和120小时gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp。gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。相应的实验结果表明酶生产的时间进程随隔离的来源,类型的应变,应变的基因组成,和培养条件。测定细菌生长和淀粉酶的时期生产力的显著优化产品复苏的时间以及有益的生产成本管理与培养时间有关。gydF4y2Ba

温度对淀粉酶生产深远的影响。隔离种植,揭示了高淀粉酶生产50 - 60°C的温度范围和最大淀粉酶生产55°C。这个结果是类似于Mrudula和Kokila[结果报告gydF4y2Ba44gydF4y2Ba从gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种,但淀粉酶报道一位et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]和Gebreselema [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)表明,最大的淀粉酶生产gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba分别从家禽sp.来源和土壤,范围从35 - 40°C。我们的报告和以前的研究方法之间的变化可能是由于不同来源的细菌隔离以及类型的应变。我们的结果显示的孤立的细菌的高温性质的潜在的适用性选择隔离生产耐高温淀粉酶可能在高温starch-processing不同行业的工作。gydF4y2Ba

底物浓度的影响进行了研究结果,观察淀粉酶活性在2%淀粉浓度最高。这个结果是在协议与Alli et al。gydF4y2Ba49gydF4y2Ba],Oboh [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba],Sahoo et al。gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。淀粉浓度超过4%导致拒绝淀粉酶活性。这可能是由于代谢能力的隔离在短的时间内当淀粉浓度增加。目前的调查结果与早期的发现的报告证实淀粉酶活动获得gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。根据这一发现,淀粉的浓度不得超过4%以上。研究也表明,高碳水化合物浓度抑制酶的生产。出于这个原因,可以连续或添加碳水化合物能整除(美联储批)在整个发酵补充精疲力竭的组件(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。这些数据是重要优化发酵过程在这个范围的底物浓度。gydF4y2Ba

活性淀粉酶的存在范围广泛的温度是一个重要的特性,使得淀粉酶在工业应用上很有用。在这项研究中,原油酶被发现是活跃在广泛的温度。尽管酶是活跃在所有温度,M2是更积极的在温度55和65°C之间达到65°C,而M8活跃在65至75°C的峰值温度为70°C。本研究报告是完全同意的发现亚et al。gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)产生的最大淀粉酶的活性gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba分别达到65和70°C,但最佳淀粉酶活动中观察到的两个隔离低于淀粉酶隔绝gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种,在75年和95°C (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。此外,隔离M13是活跃的75和85°C之间大幅下降85°C以上高活动在75°C;这是高温而活跃的两个隔离温度(M8和M2)。也报告了相似的结果gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2Ba从木薯孤立陡峭的水(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。然而,淀粉酶在这项研究中报道的最适温度是降低相比,淀粉酶报道Aynadis et al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)的物种gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba。此外,产生的酶的分离显示高耐热性,这是超过66.41%的原始活动在广泛的温度孵化后(55 - 80°C) 50分钟。这种潜在的酶活性,特别是在80 C,意味着它的实用性在各种工业应用。此外,淀粉酶产生隔离M13保留80.94%的活动在80°C的温度孵化后60分钟。这个分离比淀粉酶产生更稳定的M8和M2。进一步孵化淀粉酶产生M13, M8和M2在75°C 50分钟保留他们的活动85.94%,76.49%,和70.54%,分别。这些酶比α淀粉酶产生不稳定gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种,保留超过90%的原始活动在90°C孵化后据萨阿德(gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。此外,酶失去了原来的活动后孵化100°C以上20分钟。这可能是因为高于最适温度、酶的结构开始分解或破坏活性部位的形状,这将减少或阻止其活动工作。因此,使用各种应用程序中,带着明显的稳定的酶是酶的重要考虑合适的温度。gydF4y2Ba

pH值是另一个因素,显著影响淀粉酶的活性(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)和酶的应用具有重要意义。酶特征来识别最佳pH值时,从三个隔离观察到淀粉酶是活动从5到9。最高的活动在pH值8。土壤本身在遥远地区主要是碱性,这可能是为什么从这些隔离效果最好在碱性淀粉酶博士这表明酶是有用的在这个过程中,需要从微酸性碱性介质pH值范围宽。这一发现的研究报告或多或少类似的调查报告Aynadis et al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)和Mrudula et al。gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。相反,人员Dipali和特gydF4y2Ba3gydF4y2Ba表明,菌株gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp。WA21淀粉酶的最佳pH值获得6小于被发现在这项研究中。淀粉酶的最佳pH值获得更高的pH值范围内9日至10日报道Simair et al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba曾在gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba应变,GM890。此外,从隔离M13淀粉酶、M8和M2还保留了85年,86.85,在pH值和89.59%的原始活动9,分别。这个结果符合Sahoo et al。gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)从事gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp, MRS6隔绝市政固体废物。同时,隔离透露的所有酶相对更好的活动在酸碱10比4。这表明酶可以在碱性条件下,洗涤剂行业的巨大潜力。众所周知,酶在洗涤剂去污渍艰难的潜在能力没有任何环境影响(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。目前,这种类型的酶制剂被广泛用于洗衣和自动洗碗为了消除淀粉类食品物质来自肉汁土豆,巧克力,奶油,和其他较小的低聚糖(gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

原油盐耐受淀粉酶在这项研究表明,添加0 - 3 M氯化钠的浓度并不影响三个原油淀粉酶的活性。然而,当氯化钠浓度增加3米之外,活动减少,但保留直到5米盐浓度在89.45%以上。这清楚地表明,这种酶是halotolerant可比一些嗜盐的淀粉酶的文献报道(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。Halotolerant细菌gydF4y2BaChromohalobactergydF4y2Basp。TVSP 101gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]gydF4y2BaαgydF4y2Ba淀粉酶是展览展示相关活动的90%到2.5。此外,Kiran和钱德拉(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba)报道gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp.应变TSCVKK保留100%活动1.7 M氯化钠。然而,伯哈努(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)观察到的最高halotolerant amylase-producinggydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种是活跃在0 - 5 M氯化钠浓度。因此,这个的halothermophilic株嗜盐的稳定性和适应能力产生淀粉酶表明这些菌株生物技术的一些应用程序可能是不错的选择。gydF4y2Ba

外部因素,如阳离子和添加剂会影响酶的活性。需要一些微量元素不同微生物的增长以及许多酶催化反应(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。商业耐热性的淀粉酶目前所使用的淀粉行业需要CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}活性和稳定性,可以作为辅助因子(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba]。因此,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}通常是添加到反应混合物稳定酶。这份报告支持我们的结果。在我们的研究中,在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}百分比,剩余三个酶活性大于100%。这表明5毫米和10毫米的浓度gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}略激活酶催化。原油从M13是激活淀粉酶在10毫米的CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba};相反,M8产生的酶和M2只需要5毫米gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}。类似的结果被报道Aynadis et al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。然而,我们的报告是对观察Atsbha et al。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),表明酶的两个活动gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种在远处,埃塞俄比亚,减少钙的存在gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}、锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子的浓度(1、5、10毫米)。两个锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},通过所有的三个浓度(1毫米,5毫米,和10毫米),显著降低粗酶的活动。大多数gydF4y2BaαgydF4y2Ba-amylases来自不同来源的抑制了金属阳离子如毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}、锰gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}、铜gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}这与我们的结果匹配。也观察到类似报道Aynadis et al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)和Atsbha et al。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外,Yaseer et al。gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)报道,锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和铜gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}对淀粉酶活性的抑制作用。Ahmad et al。gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba还报道,酶活性gydF4y2BaαgydF4y2Ba淀粉酶的gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种是由锌抑制的gydF4y2Ba^{+ 2gydF4y2Ba}和EDTA。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

整个发现目前的研究表明,它可以隔离的潜在从土壤中嗜热细菌amylase-producing Afdera,远处的地区。所有的隔离是革兰氏阳性,孢子形成的棒。此外,通过使用形态学和生物化学特征,他们可能属于gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp。gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Basp.被称为强有力的生产商与有效的深层发酵过程中产生淀粉酶。此外,amylase-coding基因的PCR证实产品存在的三个选定的隔离。这种酶的基因编码也可以克隆获得重组thermoalkaliphilic酶。gydF4y2Ba

测定细菌生长时期和淀粉酶生产率优化产品复苏的时间很重要。这一研究获得的结果表明有明显的高淀粉酶的产量优化条件下三个隔离。在广泛的温度下原油淀粉酶显示稳定(55 - 80°C), pH值(5 - 9),和氯化钠浓度(0 - 3米)。本研究表明酶的耐热性的和halotolerant这些隔离。淀粉酶细菌这样的孤立研究淀粉液化和洗涤剂行业潜力巨大,因为它拥有巨大的温度和pH值稳定。所选择的隔离在当前的研究中只有三个;增加隔离的数量也会增加与有趣的特性获得细菌的机会。确定的最大潜在水解酶,淀粉酶应该做进一步净化。嗜热酶微生物需要做进一步搜索来获取重要的工业酶。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

数据集用于支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

SN执行实验,作为她的硕士论文工作的一部分。所有这些作品都是颞下颌关节和MI的监督下进行的,他们还帮助编辑稿件。所有作者阅读和批准最终的手稿。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

Semira Nureddin要感谢Woldia大学。所有作者要感谢研究所生物技术、贡德尔大学。gydF4y2Ba

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