文摘

微生物粘附表面被认为涉及物理化学基质之间的相互作用和微生物细胞。理解所涉及的物理化学方面的粘连现象,作为一个关键的步骤,生物膜的形成,必须想办法阻止它们的形成和控制biocontamination风险。本研究的目的是调查12的粘附行为之间的关系大肠杆菌菌株分离出食物和表面疏水性使用定性( )和定量(ΔG艾维)方法。细菌细胞的表面物理化学性质和玻璃材料估计通过接触角测量。的粘附行为大肠杆菌菌株在玻璃表面进行评估。结果显示良好的对数关系粘附细胞的百分比Δ和表面疏水性的定量方法G艾维;然而,定性的疏水性( )似乎证明关于粘附行为没有影响。这对未来的研究工作奠定了基础并打开一个重要辩论机制的粘附行为大肠杆菌利用热力学方法(Δ菌株G艾维)作为一个重要的模型能更好地解释和预测的疏水性细菌粘附能力。

1。介绍

在自然环境中,以及在食品工业、微生物通常附着在固体表面,通常提供足够的营养,以确保他们的生存和发展。这种细菌表面的粘附能力是许多行业关注的原因,尤其是食品行业。事实上,微生物粘附表面可以作为污染源,这可能会影响卫生和食品质量1]。大肠杆菌是一种重要的食源性病原体导致成千上万的世界各地每年食源性疾病病例(2,3]。几项研究已经开展,因此,确定因素和机制导致微生物对食品接触表面(4- - - - - -10]。

微生物粘附涉及几个参数和能量的相互作用是一个复杂的现象,其中最引人注目的是细菌的物理化学性质和支持表面(4,7- - - - - -14]。参与这个过程的相互作用主要是Lifshitz-van范德华,静电(15),刘易斯(酸碱)的16]。这些物理化学相互作用依赖于下层的物理化学性质和细菌表面疏水性(包括4,9,15,17)和电子donor-electron受体(酸碱)特点10,18]。

细菌疏水性一般指一个细菌细胞与细胞相互作用的趋势相似的疏水性与水( )(19]。大多数以前的作品使用定性疏水性( )测量直接与水接触角来解释许多细菌的粘附行为(15,20.- - - - - -22]。然而,一些研究报道,定性的疏水性表示为润湿性与水( )不能完全解释许多细菌的粘附行为(4,7,20.,21,23]。因此,交互(Δ的自由能G艾维)提出了范Oss et al。24)作为一个定量方法评估细胞疏水性。这个参数直接相关的界面张力和认为不仅与水接触角测量( )而且Lifshitz-van范德华和酸碱相互作用(电子供体和电子受体属性)。据我们所知,没有以前的工作讨论了疏水性的方法可以更好地解释微生物粘附的行为大肠杆菌菌株。

控制biocontamination在食品环境中,重要的是要理解所涉及的物理化学方面的初始沉积附着在物体表面的细菌。因此,本研究调查了12的粘附行为之间的关系大肠杆菌菌株分离出食物和表面疏水性使用定性( )和定量(ΔG艾维)方法。

2。材料和方法

2.1。菌株的选择

十二个大肠杆菌菌株从食物和分离鉴定微生物实验室的环境和卫生的食品和巴斯德研究所的摩洛哥被用于这项研究。一百个样本收到了一个月从不同食物来源(餐饮、食品行业、酒店、超市)进行了分析。隔离的过程大肠杆菌来自不同样本在这个协议遵循iso - 9308 - 1:2014标准(25]。

在检查样品,12的100个样本阳性大肠杆菌隔离。正样本显示典型的粉红色殖民地MacConkey琼脂和伊红美蓝琼脂上的绿色金属光泽显示特征。生化柠檬酸字符显示利用测试负,TSI硫化氢生产琼脂负,吲哚生产积极,脲酶活性负,甲基红试验阳性,Voges-Proskauer负数,赖氨酸脱羧酶阳性。隔离也被证实使用生化测试(Api 20 e、BioMerieux法国)。

打字的大肠杆菌隔离的实验室进行微生物学和环境卫生的食品和巴斯德研究所的摩洛哥根据考夫曼和Das考夫曼(26]。的大肠杆菌菌株类型(13;19;38岁;64;76;65;EI1;EI2;EI3;EI4; EM3; and EM4) as a function of the samples’ codes and then stored at −20°C in glycerol stocks before analysis.

2.2。细菌的生长条件和制备细菌悬浮液

每个菌株孵化一夜之间在液体Luria-Bertani 37°C(法学学士)中,胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠。孵化24小时后,细菌细胞被离心收获8400 g×15分钟,洗两次,和resuspended KNO3溶液离子强度为0.1 M。细菌光密度(ODs)调整使用分光光度计大约0.7和0.8对应于108为后续实验(CFU /毫升9]。使用0.45细菌悬液的过滤μ醋酸纤维素滤(缝匠肌)。一本厚厚的草坪上的细胞通过负压过滤后得到。潮湿的过滤器被小心翼翼地放在一个玻璃支持与双面胶带,让它风干,直到所谓的稳定高原接触角可以度量(9]。

2.3。清洁和固体表面的准备

使用的基质粘附实验是玻璃。玻璃样本显微镜载玻片(RS、法国)。在每个实验之前,基板在95%乙醇浸泡15分钟,然后用蒸馏水冲洗6次。最后,基质是热压处理过的15分钟在120◦C (9]。

2.4。细胞表面和下层表征

细菌表面的物理化学性质和基础决定使用一个测角器(GBX仪器)由液滴方法根据Busscher [27]。细菌和下层表面的表面能决定通过测量接触角和三种液体:水、甲酰胺99%,二碘甲烷99%。三到六滴液体被放置在每个固体物质和细菌滤器(前面描述)。

表达的定性的疏水性 直接通过测量分析与水的接触角。定量疏水性决定使用范Oss方法(24),这就解释了疏水性相互作用自由能的两种材料浸在水里的时候,∆表示G艾维。表面是疏水或亲水是负的(∆如果自由能G艾维< 0的人)或者正面的评论(∆G艾维分别> 0)。自由能可以从实体交互的表面张力估计根据以下公式:

此外,电子供体(γ−)和接受者(γ+)特点和Lifshitz-van范德华(γLW)相互作用被提出的方法估计Van Oss (24];接触角可以表示如下: 在哪里年代和l分别表示固体表面和液体阶段。

最后,路易斯酸碱组件可以确定如下:

表面自由能成分的水,甲酰胺、二碘甲烷(表1实体),但相应的值我必须确定。

表1
表面接触角的能量液体根据范Oss (21]。
2.5。附着力试验

细菌悬液是放置在皮氏培养皿中消毒材料(玻璃)。3 h的孵化后25°C,不依从细胞消除由三个连续与无菌蒸馏水冲洗28,29日]。玻璃样品在室温下干燥,然后进行革兰氏染色评估细菌粘附。粘附在玻璃表面被使用光学显微镜检查(×400)(奥林巴斯CH30)。估计的百分比被附着的细胞表面,通过显微镜观察后获得的图像处理使用一种算法在MATLAB软件开发程序(8]。

2.6。统计分析

所有理化分析和附着力进行了化验,有三个重复。三到六接触角测量每个细菌滤器和玻璃表面进行。之间的相关性研究进行了水接触角测量 ),交互(Δ的自由能G艾维),被粘附细胞表面的比例使用SPSS 20.0软件。

3所示。结果

3.1。细胞表面和下层表征

微生物细胞与材料表面的物理化学特性起着关键作用的微生物粘附现象。控制和抑制粘附机制的理解微生物细胞和基质之间的相互作用是必需的。因此,的表面物理化学性质大肠杆菌菌株和玻璃表面接触角的测定(表2)。

表2
接触角,表面张力参数,和自由能量的交互大肠杆菌菌株和玻璃表面。

疏水性通常是用接触角来表示由固着滴水 。在目前的工作中,我们使用这个参数来表达菌株和下层的定性的疏水性。根据Vogler [30.),疏水表面表现出的水接触角值高于65°,而亲水表面水接触角值低于65°。

表2说明了细菌理化特性的接触角的方法。基于对水的接触角值 ,结果表明,大肠杆菌现年38岁的菌株编纂EI1 EM3, 64年,19岁的EM4,和EI4显示疏水值从69.44°到99.8°;然而,大肠杆菌76年菌株13日,EI3 EI2, 65人亲水(33.22 - -56.5°)。

用热力学方法Van Oss (20.,21,24),与Δ疏水性的绝对程度决定G艾维方程表达公式(方程(1))。在此基础上定量方法,结果在表2表明,大肠杆菌菌株编纂EM4,13日,76年,EI3 EI2 65和EI4也亲水(ΔG艾维> 0),而大肠杆菌现年38岁的菌株EI1 EM3、64和19是疏水性(ΔG艾维< 0)。Δ交互的自由能G艾维范围从亲水(48.6 mJ / m2)疏水(−70.7 mJ / m2)的值。

指表中的结果2,它的出现大肠杆菌菌株76,EI3 EI2, 65人亲水根据定性和定量方法。此外,玻璃表面是定性( = 36.14°)和定量(ΔG艾维= 38.61 mJ / m2)亲水。

3.2。附着力测试

的粘附能力大肠杆菌菌株分离食品起源(玻璃)是一种惰性表面检查。光学显微镜下的图片大肠杆菌菌株3 h后的接触玻璃提供了图1。占据的比例由细胞表面的玻璃呈现在图2。


图1
微观的图片大肠杆菌菌株粘附在玻璃表面×400放大。黑色的斑点是细菌粘附在玻璃表面。

图2
粘附细胞的百分比大肠杆菌菌株在玻璃基质上。误差线代表标准偏差的百分比由细菌表面。附着力进行了化验,有三个重复。

观察到的数据1和2的粘附能力大肠杆菌菌株在玻璃支持不同菌株之一。事实上,大肠杆菌菌株64,19日EM3 EM4 13,和EI3显示高能力坚持玻璃材料(粘附细胞的13.5%,20%,33%,62%,25%,和11%,分别)。然而,大肠杆菌76年38岁的菌株EI1 EI4 EI2, 65没有明显遵守玻璃基质(0.08%,0.10%,8%,6%,2%,和0.3%,分别)。此外,大肠杆菌EM4显示较强的粘附能力到玻璃表面样品(62%)。

一个全面的了解大肠杆菌粘附依赖建立细菌表面的物理化学性质。因此,我们调查的粘附行为之间的关系大肠杆菌菌株及其表面疏水性与定性( )和定量(ΔG艾维)方法。

使用SPSS软件,我们分析了几个相关模型(线性、对数、指数)之间的粘附细胞的百分比大肠杆菌菌株及其表面疏水性与这两种方法( ;ΔG艾维)确定最佳关联模型揭示菌株的粘附能力之间的关系及其表面性质。

相关分析显示细胞的定性的疏水性(相关性不显著 )及其附着强度;然而,相关结果显示一个高度显著的对数关系我们的菌株的粘附行为及其定量疏水性ΔG艾维(图3)。系数测定R2表明一个好的相关性粘附细胞的百分比大肠杆菌和他们的疏水表面疏水性(R2= 0.9989)和亲水性(R2= 0.7914)分别特征。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
对数相关性细菌表面疏水性ΔG 艾维和粘附细胞的百分比大肠杆菌菌株。(一)疏水性细菌∆G 艾维< 0。(b)亲水∆细菌G 艾维> 0。

更好的理解这个的粘附行为之间的关系大肠杆菌菌株及其疏水性,图4说明了分配的比例大肠杆菌坚持细胞作为定量疏水性(Δ函数G艾维)。结果表明增加和减少负(Δ粘附细胞的百分比G艾维< 0)和积极的(ΔG艾维> 0)相互作用自由能值,分别。此外,的附着力大肠杆菌菌株在玻璃衬底时更明显从极端的正面和负面的价值量化疏水性(ΔG艾维)为中心的价值观(接近0);然而,这种行为定性的疏水性(没有被观察到 )(图4)。


图4
的示意图大肠杆菌菌株粘附行为根据其表面疏水性(Δ玻璃G 我wi)。

4所示。讨论

表面附着的微生物是生物膜的形成的第一步。这个附着力阶段在很大程度上是由物理化学相互作用,主要是Lifshitz-van范德华,路易斯酸碱和静电的。这些交互依赖于物理化学性质,包括疏水性,静电电荷和电子供体/电子受体的特征。

表面疏水性通常被认为是微生物粘附的主要因素。一些作者认为疏水性是关键参数控制细菌粘附表面(4,15,31日- - - - - -36]。与水接触角表示为润湿性( )通常是用来评估表面疏水性。然而,使用这种方法,只有可能的定性评价疏水性(9,10]。因此,范Oss和同事(24表面疏水性Δ]提出了一种定量测定G艾维考虑几个表面性质的参数(电子供体(γ−)和接受者(γ+)特点和Lifshitz-van范德华(γLW))。

许多研究工作已经使用定性或定量解释疏水性胶粘剂研究微生物的行为。然而,据我们所知,没有先前的研究调查了疏水性的参数可以解释更好的粘附行为大肠杆菌菌株。因此,本研究旨在评估12的粘附能力大肠杆菌菌株分离食品坚持一种惰性表面(玻璃),然后调查之间的关系表面疏水性和根据定量(Δ粘附行为G艾维)和定性( )方法。

表2提供了接触角测量结果表明,玻璃的支持有一个亲水表面由定性( )和定量(ΔG艾维与先前的研究人员()方法,这他4,13,32,35,36]。研究结果表2也表明,大肠杆菌菌株有不同的疏水性,这取决于两个提到的方法。事实上,只有大肠杆菌76年菌株13日,EI3 EI2, 65人亲水根据这些方法。这些结果显示相似之处与Hamadi [9,12),报告说大肠杆菌尿路感染患者分离出菌株亲水性与这两种方法。

根据文献,细菌细胞的疏水性,在很大程度上是受细胞表面上的残留和结构,亲水或疏水(10,19,37]。因此,细菌疏水性不同物种间和压力,即使在相同的应变,根据模式和发展阶段,生长培养基成分,甚至分析技术(7,9,38,39),有可能解释亲水性的变化甚至在同一物种在我们的工作。

试验表明,粘接效果大肠杆菌菌株表现出了不同的能力遵守玻璃材料(图1)。调查的粘附行为之间的关系大肠杆菌菌株及其表面物理化学性质,我们评估之间的关系大肠杆菌使用定性的粘附行为和表面疏水性( )和定量(ΔG艾维)策略。结果在图3表现出强烈的对数相关性(∆自由能之间的交互G艾维)的粘附大肠杆菌菌株在玻璃支持;然而,与定性观察疏水性无显著相关。同样,先前的研究调查疏水性之间的关系属性( )的大肠杆菌及其附件的能力还没有找到一个支持的疏水性表面的程度之间的相关性和粘附细胞的数量34,40,41]。

一些工作,包括这个,有报道称,定性的疏水性( )是一个通用的概念,无法解释许多支持系统微生物粘附的结果(4,42,43]。根据Goulter [2),定性的疏水性是一个一般的概念,不能直接测量,但估计只能通过观察大量细胞的大部分属性和解释这些相互作用的分子。这可能是一个主要因素,使得许多研究无法找到定性的疏水性和粘附行为之间的显著相关性(4,7,23]。

很少有研究热力学方法用于粘附行为的解释。然而,这种策略可能在理解微生物粘附代表一个重要的工具,因为它考虑了Lifshitz-van范德华相互作用和酸碱相互作用中扮演着一个重要角色粘附[9,44]。根据获得的结果,我们建议的附着力大肠杆菌压力主要是由玻璃基质表面定量疏水性(ΔG艾维)。因此,我们建议(Δ交互的自由能G艾维应该进一步研究)作为一个重要的参数,以了解和预测菌株的粘附行为。

5。结论

最初的依恋的机制大肠杆菌压力表面是最有可能的一个复杂的过程,涉及几个因素。许多方面,如疏水性、已被证明在细胞连接起着关键作用。本研究表明,定性的疏水性( )无法解释系统的粘附行为12大肠杆菌菌株;然而,定量疏水性(ΔG艾维显示良好的对数与粘附细胞的百分比。这项工作提供了重要的方法对于理解机制粘附行为的不同方面(Δ通过专注于研究热力学方法G艾维)作为一个重要的模型可以预测的疏水性大肠杆菌粘附行为。

结束,比较大肠杆菌菌株附着在其他基质和生物膜的形成的研究可以更好地通知他们的行为根据其表面定性和定量疏水性。这种策略可以帮助理解和控制这些菌株的粘附行为以减少biocontamination食品行业的风险

6。信息披露

这项工作是该研究项目的一部分,RS / 2011/32:“研究生物膜形成的材料用于食品工业。”项目的“项目国家du开发署de la矫揉造作的Sectorielle”发起的国家科学和技术研究中心(CNRST)与贝尼省科技学院合作Mellal,费斯科学技术学院和巴斯德研究所,摩洛哥。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Hassan Latrache Hafida查希尔,Ellouali Mostafa设计研究和修正最后的手稿。Elfazazi Kaoutar, Btissam Mayoussi, Safae Tankiouine, Chorouk Zanane进行实验工作。Souad Lekchiri导致数据分析和文章写作和修正。El Mostafa Mliji进行细菌鉴定。Elfazazi Kaoutar进行数据分析和写这篇文章。

确认

作者想表达最真诚的感谢海赛姆·m·哈瓦希河博士,研究员在动物卫生微生物学和食品安全研究所的埃及,参考兽医实验室质量控制,本文在回顾他的非常宝贵的帮助。