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国际微生物学杂志
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国际微生物学杂志/2021年/文章

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体积 2021年 |文章的ID 5557361 | https://doi.org/10.1155/2021/5557361

Shahram Shahraki Zahedani,哈米德塔玛色比,Mojdeh Jahantigh, ”共存的毒力因子和射流泵在临床分离株的基因铜绿假单胞菌:分析从伊朗Biofilm-Forming菌株”,国际微生物学杂志, 卷。2021年, 文章的ID5557361, 8 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/5557361

共存的毒力因子和射流泵在临床分离株的基因铜绿假单胞菌:分析从伊朗Biofilm-Forming菌株

Shahram Shahraki Zahedani,1 哈米德塔玛色比,2 和 Mojdeh Jahantigh1

1扎黑丹大学医学科学,微生物系扎黑丹、伊朗

2Shahroud大学医学院的医学科学,Shahroud,伊朗

学术编辑器:路易吉Santacroce
收到了 2021年3月22日
接受 2021年5月08
发表 2021年5月21日

文摘

背景。生物膜的形成和射流泵(EPs)相关扮演关键角色的致病性和抗生素耐药性铜绿假单胞菌。在这项研究中,生物膜形成和EP在临床分离的协同作用铜绿假单胞菌感染了。方法。八十六(86)铜绿假单胞菌隔离不同临床标本收集和使用不同的生化检测确认。生物膜的形成是用结晶紫试验调查。同时,EP基因被确定的PCR方法。结果。根据结果,gentamicin-resistant (n= 50,66.29%)和耐环丙沙星(n= 61,是最常见的和粘菌素(69.66%)菌株n= 1,1.12%)和头孢他啶(n= 12,7.86%)耐药菌株是最普遍的。此外,MDR 22隔离(31.42%),11隔离XDR株(12.35%)。同时,19隔离(22.47%)属于强大的生物膜,29岁隔离温和的生物膜(21.34%),3(11.23%)隔离弱生物膜生产商。EP基因的分布如下:mexA(n= 44岁的34.83%),mexB(n= 33岁的32.58%),oprM(n= 59岁的29.21%),oprD(n= 61,30.33%),tetA(n25.58%)= 22日,tetR(n= 19,22.09%)和埃姆雷(n= 21,24.41%)。然而,有一个强大的重要生物膜的形成和每股收益之间的联系铜绿假单胞菌。结论。在这项研究中,我们建议的多药耐药性射流泵、MexEF-OprN,显著降低铜绿假单胞菌致病性。相比之下,MexAB-OprM和MexCD-OprJ泵的存在并不影响毒性。

1。介绍

铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌)是一种机会主义的范式临床病原体先天对许多抗生素的耐药性。在人类中,铜绿假单胞菌在严重烧伤主要是十分关注的,癌症和艾滋病患者,以及那些免疫抑制(1,2]。其他重要感染引起的生物体是肺炎、心内膜炎、眼内炎、脑膜炎、败血症、结膜炎。的频率铜绿假单胞菌高手术和烧伤伤口感染3]。

一般来说,铜绿假单胞菌自然是不如其他革兰氏阴性杆菌对许多抗生素敏感。耐多药(MDR)铜绿假单胞菌菌株的特别关注,带来了显著的临床的挑战4,5]。单独的耐多药菌株因为耐多药流出系统之间的协同作用,外膜通透性低。固有的生物体的重要特征之一是抵抗多种抗生素和消毒剂,主要是由于耐多药流出系统和低外膜通透性(6,7]。

射流泵(EPs)膜转运蛋白代表内在和获得抗生素耐药性机制的重要组成部分铜绿假单胞菌(8]。这种生物本质上是对许多结构无关的抗菌药物由于其外膜的低渗透和各种EPs的组成型表达与广泛的底物特异性7,9]。然而,四个著名的基因不同的射流系统也已被确认为负责多药耐药性(MDR)铜绿假单胞菌,即MexAB-DprM MexCD-OprJ、MexEF-OprN MexXY-OprM。每个泵都有优惠的抗菌剂基质。EP的基因存在于所有菌株,但他们不是在高水平表达。然而,增加表达式可以结果等监管基因的突变mexR控制mexAB-OprM基因(2,10]。

各种调查显示每股收益之间的相关性和生物膜的形成6]。然而,EPs的直接影响细菌致病性和毒力尚不清楚。任何缺陷在EP活动会影响生物膜的形成。因此,抑制任何流出活动的抑制剂可以减少生物膜的形成(11]。铜绿假单胞菌是一个投机取巧的病原体与慢性感染有关。它是医院和社区获得性感染的主要原因。致命的铜绿假单胞菌经常危及生命,经常出现耐多药隔离治疗病人提出的挑战。耐药性和毒性之间的相互作用是总是一起考虑。细菌许多不利环境的适应程度是主要的担忧医疗中心。所以,这些基本的分析细菌特征对管理策略是至关重要的。然而,医疗设备和组织表面生物膜的增长会导致生物膜的形成和增加伤口和呼吸道感染的风险(12,13]。同时,EPs和生物膜铜绿假单胞菌至关重要的临床和环境隔离容忍干燥(11]。

因此,本研究进行了了解其他EP的角色和关系类型与不同的临床分离株的生物膜的形成铜绿假单胞菌南部的伊朗。

2。材料和方法

2.1。研究设计和隔离的集合

在这个descriptive-analytical研究中,510个不同的临床标本,包括血液、尿液、伤口,烧伤口,导管,脓肿,收集从病人到教学医院扎黑丹、伊朗,从2018年9月到2019年5月。隔离被飞速Luria Bertani麦肯基(磅)和琼脂板到达实验室。他们的身份被革兰氏染色后,活性测试,和生化反应,本质上所描述的塔玛色比et al。1]。然而,86年铜绿假单胞菌分离收集。所有的道德标准已经在准备提交的文章,受人尊敬的。IR.ZAMUS.REC.1396.140。

2.2。麦克风模式的决心

抗生素敏感性测试阀瓣扩散试验(DDT)证实隔离生化反应的进行铜绿假单胞菌。然而,隔离被归类为敏感,每一种抗生素耐药,或中间通过测量相应的抑制区并且按照CLSI终于解释准则。滴滴涕是基于使用光盘,meropenem, imipenem,头孢吡肟,头孢他啶,庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、粘菌素,aztreonam和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑(桅杆、英国)。电性能测试条(Liofilchem、意大利)是用于确定colistin-resistant菌株。

2.3。筛选的生物膜生产商菌株

形成生物膜的能力在微量滴定板几乎化验,和结晶紫法(CVM)被Azeredo et al。14]。在这种情况下,铜绿假单胞菌写明ATCC19606年作为阳性对照,培养基作为消极的控制。

2.4。DNA提取

DNA提取所有的表型确认铜绿假单胞菌隔离的煮法塔玛色比等的研究表明(15]。

2.5。EP基因的检测

特定的引物(表1)被用来增强EP基因。PCR反应进行的总量25µ包含1 l .反应µL的DNA模板,12µL掌握混合(Fermentas沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),1µM的底漆,10µL去离子水(美国Sigma-Aldrich)。进行了PCR检测(基于表1)Bio-Rad MJ迷你热循环(英国)赫默尔亨普斯特德镇T100cyclerBio-Rad,激烈的盖子。在完成反应,管与PCR产品在4°C。进一步分析和确认是由执行分析琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖凝胶在85 V)为95分钟(16]。
基因 的引物序列 热循环 产品尺寸(bp) 裁判
mexA F: CTCGACCCGATCTACGTC 95°C / 5分钟;(95°C / 1分钟,56°C / 30秒,72°C / 45秒)X30;72°C / 5分钟 503年 (8]
接待员:GTCTTCACCTCGACACCC
mexB F: TGTCGAAGTTTTTCATTGAG 95°C / 5分钟;(95°C / 1分钟,58°C / 45秒,72°C / 45秒)X35;72°C / 5分钟 280年 (8]
接待员:AAGGTCAC GGTGATGGT
oprM F: GATCCCCGACTACCAGCGCCCCG 95°C / 5分钟;(95°C / 1分钟,57°C / 1分钟,72°C / 45秒)X30;72°C / 5分钟 247年 (8]
接待员:ATGCGGTACTGCGCCCGGAAGGC
oprD F: ATCTACCGCACAAACGATGAG 95°C / 5分钟;(95°C / 1分钟,59°C / 45秒,72°C / 1分钟)X30;72°C / 5分钟 156年 (8]
接待员:GCCGAAGCCGATATAATCAAAC
tetA F: AAGAATCCGCGCGTTCAATCG 95°C / 7分钟;(95°C / 1分钟,55°C / 1分钟,72°C / 50秒)X35;72°C / 10分钟 138年 (15]
接待员:GCCCGGCACCGGCATAAT
tetR F: CCGAATGCGTATGATTCTCC 95°C / 10分钟;(95°C / 1分钟,57°C / 30秒,72°C / 1分钟)X30;72°C / 10分钟 84年 (15]
接待员:CGCTTTACTGGCACTTCAGC
埃姆雷 F: CCGCCATGACCAACTATCTC 95°C / 5分钟;(95°C / 1分钟,58°C / 1分钟,72°C / 1分钟)X30;72°C / 5分钟 249年 (6]
接待员:GCTGGCCGTAGACGAACATC
表1
寡核苷酸序列用于这项研究和热循环条件。
2.6。统计分析

数据统计分析使用GraphPad棱镜软件版本8 (GraphPad软件有限公司、钙、美国)和适当的统计检验方法,即。,学生的t以及,Wilcoxon测试、卡方检验或单向方差分析。

3所示。结果

在86年分离的铜绿假单胞菌从男性,19隔离(22.93%)患者和67例孤立从收集女性患者(72.04%)。如表所示215个来自尿(17.44%),21日从伤口(24.41%),从留置医疗设备(12.79%)11,29日从血液中(33.72%)。收集的样本在妇产科病人住院(n= 6)、儿科学(n= 14),内部的(n= 13),紧急(n= 17),神经学(n= 7),重症监护室(ICU) (n= 15),燃烧单元(n= 14)。
生物膜 外排泵基因 IMI 海洋博物馆 创 CIP 自动取款机 CPE CAZ C AMK TMP / SMX 耐多药 XDR
RND类型 MFS类型 类型阶梯短环到超级扁环
MexA mexB oprM oprD tetA tetR 埃姆雷
强(n33.72%)= 19日 12 19 17 19 11 8 7 11 9 19 16 7 6 9 1 16 7 14 9
温和的(n= 29,33.72%) 19 7 28 29日 3 11 11 6 2 22 28 7 15 0 0 5 12 7 1
弱势(n= 3,3.48%) 9 4 3 3 8 0 3 2 4 4 9 2 9 1 0 8 0 1 1
临床分离株
伤口(n= 21,24.41%) 15 19 18 20. 9 4 10 6 5 13 19 6 14 4 1 3 5 11 4
尿液(n= 15,17.44%) 9 11 14 12 11 14 7 2 1 14 15 1 1 2 0 9 5 5 2
血(n= 29,33.72%) 12 3 24 27 2 1 3 11 9 21 24 10 17 6 0 17 8 6 5
医疗设备(n12.79%)= 11日 8 1 3 4 0 0 2 0 0 2 3 0 0 0 0 0 1 1 0
性别
男(n22.09%)= 19日 19 11 19 13 11 7 6 7 13 17 19 10 8 4 1 17 6 13 5
女(n= 67,77.90%) 25 22 40 48 11 12 15 12 2 33 42 7 24 8 0 12 13 9 6
医院部分
妇产科(n= 6 6.97%) 6 3 4 6 5 1 3 0 0 5 6 1 2 0 1 2 0 2 0
儿科(n= 14人,16.27%) 3 1 11 11 2 3 1 1 2 3 10 2 4 0 0 2 0 1 0
内部单位(n= 13,15.11%) 6 1 5 9 3 1 1 1 1 1 7 1 3 1 0 1 2 1 1
紧急(n8.13%)= 17日 10 9 11 13 1 3 6 3 2 11 10 1 7 0 0 7 1 1 1
ICU (n= 15,17.44%) 7 11 13 9 5 9 2 3 1 15 15 3 5 7 0 6 7 7 3
燃烧单元(n= 14人,16.27%) 12 8 14 13 6 4 8 11 9 14 13 9 13 4 0 11 9 10 6
神经外科(n= 7,8.13%) 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
IMI: imipenem;MER: meropenem;创:庆大霉素;CIP:环丙沙星;自动取款机:aztreonam;CPE:头孢吡肟;C:粘菌素;AMK:阿米卡星;TMP / SMX:磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶;ICU:重症监护室。
表2
的biofilm-forming能力铜绿假单胞菌和百分比的外排泵基因相关抗生素。
3.1。抗生素耐药模式

耐环丙沙星(70.93%)和庆大霉素(58.13%)最常见,其次是头孢吡肟(32.20%)、阿米卡星(33.72%)、和aztreonam (19.76%)。耐头孢他啶(13.95%)是最不隔离中检测到。此外,22 MDR隔离(31.42%)和11 XDR隔离(15.71%)报告(图1)。


图1
抗生素临床分离株的耐药模式铜绿假单胞菌。IMI: imipenem;MER: meropenem;创:庆大霉素;CIP:环丙沙星;自动取款机:aztreonam;CPE:头孢吡肟;C:粘菌素;AMK:阿米卡星;TMP / SMX:磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶。
3.2。生物膜的生产

生物膜形成的结果如表所示2。在86年的铜绿假单胞菌现年51岁的隔离(59.30%)被认为是生物膜生产商,和35隔离(40.96%)缺乏生物膜。同时,19隔离(22.09%)属于强大的生物膜,隔离(33.72%)29日为温和的生物膜,3(3.48%)隔离弱生物膜生产商。然而,生物膜的形成之间的显著相关性和抗药性细菌的患病率已经观察到。减少抗生素耐药性流行在biofilm-forming菌株显著除了粘菌素和aztreonam ( > 0.05)。

3.3。流行的EP基因

根据图259隔离(68.60%)oprM和61年分离株(64%)oprD33,紧随其后的是44隔离(67.44%)、分离(38.37%),22个分离株(25.58%),21个分离株(24.41%),和19个分离株(22.09%)检测到mexA,mexB,tetA,ermE,tetR分别为(表2)(图2)。然而,图3和表3显示统计抗生素耐药性和EPs基因之间的联系。同样,一个强大的关系观察生物膜形成和EP基因( ≤0.05)。的MexA,mexB,oprM,tetA,和oprD基因呈现明显更频繁地在耐多药和XDR隔离和生物膜形成隔离。相比之下,tetR和埃姆雷基因antibiotic-sensitive隔离之间更频繁。之间没有统计协会的一些抗生素,如粘菌素和EP基因( > 0.05)。

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(一)
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(d)
图2
放大和凝胶电泳琼脂糖EP基因的2%铜绿假单胞菌。(一)mexA503个基点,mexB280个基点;1:积极控制、井3 - 9:阳性菌株mexB;10:积极控制和井11到18:阳性菌株mexA。(b)oprM247个基点,oprD156个基点;2:积极控制、井3 - 10:阳性菌株oprM;11:积极控制和井12至18:阳性菌株oprD。(c)tetA138个基点,tetR84个基点;1:积极控制、井2到7:阳性菌株tetA;7:积极控制和井8到14:阳性菌株tetR。(d)埃姆雷249个基点;1:积极控制和井2到8:阳性菌株埃姆雷。梯100基点。
(一)”name=
(一)
(b)”name=
(b)
图3
外排泵基因之间的联系,抗生素耐药性,生物膜的形成,临床样本铜绿假单胞菌隔离。(一)外排泵基因之间的联系,抗生素抗性和生物膜的形成。(b)外排泵基因与临床样本之间的联系。使用学生的每个数据集进行了分析t以及和双向方差分析和提出了意味着+ SEM。 值< 0.05; 值< 0.01; 值< 0.001;和 值< 0.0001。ns:废话。
生物膜 射流泵的家庭
RND类型 MFS类型 类型阶梯短环到超级扁环
MexA mexB oprM oprD tetA tetR 埃姆雷
强大的 = 0.009 = 0.001 = 0.008 = 0.009 = 0.039 = 0.022 = 0.041
温和的 = 0.017 = 0.050 = 0.036 = 0.002 = 0.075 = 0.033 = 0.019
弱 = 0.043 = 0.003 = 0.032 = 0.017 = 0.015 = 0.048 = 0.028
临床分离株
伤口 = 0.040 = 0.029 = 0.016 = 0.048 = 0.066 = 0.043 = 0.051
尿液 = 0.056 = 0.037 = 0.044 = 0.011 = 0.006 = 0.005 = 0.006
血 = 0.250 = 0.089 = 0.014 = 0.097 = 0.25 = 0.1 = 0.068
医疗设备 = 0.058 = 0.060 = 0.084 = 0.12 = 0.09 = 0.049 = 0.17
性别
男性 = 0.31 = 0.11 = 0.33 = 0.47 = 0.075 = 0.082 = 0.059
女 0.085 0.020 0.009 0.005 0.066 0.043 0.051
医院部分
妇产科 = 0.049 = 0.016 = 0.055 = 0.005 = 0.009 = 0.045 = 0.043
儿科 = 0.019 = 0.062 = 0.035 = 0.015 = 0.009 = 0.45 = 0.21
内部单位 = 0.31 = 0.11 = 0.33 = 0.47 = 0.075 = 0.082 = 0.059
紧急 0.025 0.015 0.084 0.001 0.075 0.033 0.019
加护病房 = 0.002 = 0.001 = 0.072 = 0.050 = 0.039 = 0.044 = 0.011
燃烧装置 = 0.019 = 0.020 = 0.048 = 0.053 = 0.036 = 0.050 = 0.018
神经外科 = 0.094 = 0.31 = 0.19 = 0.020 = 0.62 = 0。27 = 0.093
表3
相关性射流泵,生物膜的形成,临床分离株,分离和抗生素耐药性P。绿脓杆菌。

4所示。讨论

本研究表明,头孢他啶colistin-susceptible菌株是最频繁的,就像图中描述1。在目前的研究中,13.95%的ceftazidime-resistant菌株被发现铜绿假单胞菌隔离。同时,colistin-resistant菌株没有检测到隔离。Dehbashi等人,Rodulfo等人报告了类似的结果1,17]。然而,根据图1,高耐庆大霉素(58.13%)和环丙沙星(70.93%)在隔离观察。这些结果同意Kuti等人的研究和Ijaz et al。18,19]。

的能力铜绿假单胞菌抵抗干燥和形成生物膜使其非生物表面长时间生存。在最近的研究中,表2显示,22.47%的隔离被归类为强大的生物膜和21.34%,温和的生物膜。95%的耐多药菌株强大的生物膜隔离和89/47%温和的生物膜隔离被报道。此外,XDR菌株被发现在82.44%的强大的生物膜和78.94%的温和的生物膜。杨等人研究了生物膜的形成对imipenem疗效的影响。然而,他们报告说,imipenem功效显著减少老化生物膜(20.]。拉希米等人发现biofilm-producing铜绿假单胞菌相对更高的电阻比non-biofilm-forming株阿米卡星。同时,MDR / XDR菌株表现出强烈的生物膜的形成和抗生素抗性之间的关系(21]。

调查的患病率RND-type、MFS-type SMR-type EP编码基因,我们的报告,这些流出系统中广泛分布铜绿假单胞菌。然而,mexA,mexB,oprM,oprD基因RND-EP在场的51.62%,38.37%,68.60%,和70.93%的测试隔离,分别。此外,SMR-EP基因的分布在24.42%的观察铜绿假单胞菌。然而,tetA和tetRMFS-EP基因被发现在隔离的25.58%和22.09%,分别。基于等人报道相同的结果和证明RND-EP基因在MDR / XDR菌株更丰富铜绿假单胞菌比其他EP基因(22]。

然而,EP也可以改变的致病性铜绿假单胞菌和生物膜的形成起着重要的作用。如表所示2,所有EP家庭特点是生物膜的生产菌株。据我们所知,这是第一个报告描述的分布三个EP家庭在伊朗和报告与生物膜形成相关铜绿假单胞菌。Alav et al。6)和Rumbo et al。23)发现与EP基因分离的生物膜的形成能力大于株缺乏基因。然而,Rampioni等人证实EPs和生物膜的形成之间的关系铜绿假单胞菌;应该注意的是,这种联系取决于许多因素(24]。

基于表2,射流的压力系统最常见的伤口和尿液标本。然而,如表所示3和图3,我们发现了一个强大的生物膜的形成及其EP基因之间的联系。这些发现表明,EPs在生物膜的形成起着关键作用,抗生素耐药性铜绿假单胞菌。还有一个重要的EPs的家人和生物膜的形成之间的关系铜绿假单胞菌。同意这些发现,Horna等人Shigemura等人报道的一个重要的生物膜的形成之间的关系,EPs和致病性铜绿假单胞菌孤立的从伤口和尿液。他们还指出,与EPs抗药性治疗和有一个更重要的作用导致尿路感染(25,26]。在当前的研究中,有一个重要的EP家庭和生物膜的形成之间的关系。RDN-EP的频率和MFS-EP高生物膜生产商菌株。这种观察类似于Minagawa et al。”年代的发现,这表明RND-EP扮演更重要的角色铜绿假单胞菌(27]。索托表明菌株与EPs更倾向于生物膜的形成。他说一个重要的生物膜的形成和EPs在革兰氏阴性菌之间的关系28]。

此外,没有每股收益与每股收益比细菌致病性细菌和扮演一个重要角色在伤口和尿路感染。因此,临床样本的类型是一个重要的因素在这种相关性[29日,30.]。然而,生物膜增长增加水平的突变和quorum-sensing-regulated机制。常规染色体等耐药机制β内酰胺酶,调节射流泵和突变细菌在抗生素目标分子也有助于生物膜的生存(31日,32]。

此外,多个电阻最常用的抗生素是很常见的铜绿假单胞菌由于拥有大量的毒力因素(33]。高抗生素耐药性水平可归因于多重射流泵的一致行动与染色体编码的抗生素抗性基因和细菌细胞信封和生物膜形成的低渗透现象(34]。

总之,我们的研究支持了EPs和生物膜的形成之间的关系。Biofilm-forming能力铜绿假单胞菌EPs认为,与宿主-病原体通信的重要组成部分和medical-device-related感染。同时,每股收益构成重大威胁在临床伤口作为水库的耐多药病原菌。铜绿假单胞菌会变得更耐由于环境条件和生物膜等不同生理状态。有必要注意轻微上升的阻力中观察到诊所,因为这可能表明适应耐药性的出现伤口感染和可能的治疗问题。因此,电阻状态在到达理想情况下应该作为一个潜在的混杂变量控制的电阻在biofilm-forming菌株之间的联系和接触抗菌药物。这些结果表明,铜绿假单胞菌生物膜的形成有很大的倾向在伤口感染,导致抗生素耐药性的增加。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢扎黑丹大学医学科学(ZAMUS)的金融支持进行研究。这项工作是由从扎黑丹大学医学科学研究资助(批准/奖。IR.ZAMUS.REC.1396.140)。

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