对抗潜在的土壤链霉菌属从泰国南部隔离抑制食源性致病菌

文摘

链霉菌属众所周知的能力产生成千上万的生物活性次生代谢产物和酶。本研究旨在评估粗提取物的抑制活动多样化链霉菌属从水稻土壤收集在那拉提瓦,泰国,对食源性致病菌。总共有136放射菌类使用cross-streak分离筛选方法产生有效的代谢物对5致病性细菌的能力。这些,19(13.97%)隔离细菌有抗菌活性与至少一个测试。大部分的隔离能强烈抑制的增长金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430除外铜绿假单胞菌ATCC27853。形态的基础上,文化,和生化特性,有效的隔离安装属表现出典型的特性链霉菌属。原油的两个7选择乙酸乙酯提取物有很好的敌对活动金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430当测试用琼脂扩散试验。此外,最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的值2提取使用比色汤采用方法评估范围从256 - > 1024μ对测试细菌g / ml。的部分核苷酸序列16 s rRNA基因导致识别活动隔离链霉菌属物种。这些活动链霉菌属隔离可以提供一个有趣的来源产生无数的天然化合物抗菌活性,大概可以对抗细菌病原体在不久的将来发展。

1。介绍

食源性疾病是一个重要的健康关注,每年影响全世界三分之一的人。报道,在低收入国家食源性疾病的负担远高于高收入国家(1]。此外,世卫组织报告的最高发生食源性疾病和死亡率在非洲和东南亚地区。全球食源性感染是造成230000人死亡5.5亿人感染腹泻疾病每年食源性疾病,占所有死亡人数的30%在低于5岁的儿童1]。

链霉菌属众所周知的能力产生成千上万的生物活性次生代谢产物和酶(2,3]。属由丝状的革兰氏阳性细菌属于门放线菌。物种可以生长在各种栖息地,如土壤、海洋沉积物和海洋海绵(4,5]。丰富的隔离的链霉菌属被用来使多数natural-derived抗生素(6]。因此,他们被视为最大的微生物药用应用,产生超过50%的临床使用抗生素和抗菌、抗真菌、抗病毒、驱虫剂药物和免疫调节器(7,8]。其他相关产生的次生代谢物链霉菌属也表现出多种生物活性和作为药理代理人和农业9,10]。

自然的发现,生物活性化合物抗菌活性可能导致小说的发展的首选药物治疗病人感染细菌性疾病。细菌感染,每年参与的死亡人数大约有1700万人(主要是儿童和老人),而传染病仍然是全球第二大死因的(11]。然而,耐药细菌的快速崛起是目前的一个主要公共健康问题在世界的许多地方,特别是在发展中国家(12]。抗生素耐药性可以调用的结果更糟对患者临床后果的风险,更昂贵的医疗费用,增加死亡率(13- - - - - -15]。声名狼藉的,最近的研究表明,最常见的导致抗药性细菌造成的感染在医院和社区包括金黄色葡萄球菌,肠球菌都有效,肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌,肠杆菌属物种(16]。人们一般都会接触到这些耐药细菌通过农场动物、水产养殖、食品处理程序(17]。抗生素耐药性往往由于过度使用或滥用抗生素和缺乏认识,这直接促进病原体的能力适应几种常见抗生素。耐多药(MDR)的细菌感染的患病率从东北九省医院报道泰国被记录为3 - 75% (18),而大多数患者医院感染机会。因此,人们迫切需求新的抗生素来对抗这些细菌。因此,本研究旨在孤立链霉菌属从各种土壤样本在那拉提瓦,泰国南部,具有强抗菌活性对致病细菌。这项发现可能导致的结果提供了一种新生物活性次生代谢产物的潜在来源。

2。材料和方法

2.1。样本收集和隔离放线菌

30从三个不同的网站收集土壤样本位于那拉提瓦省,泰国,在Bacho达克呗,Yi-ngo区(图1)。样本随机从稻田里每一个区域(10个字段)。一个镘刀被用来探究土壤。约100 g的每一个土壤样本被删除后大约10厘米深度约3厘米的土壤表面。这些样本被放置在无菌塑料袋,封闭严密,立即转移到实验室。一些土壤理化参数包括纹理、颜色、pH值、水分含量测定(19,20.]。后,样品被风干在45°C 4 h,随后压碎,已筛。干燥的土壤是申请预处理过程在70°C 1 h在干热灭菌器。连续稀释法使用预热土壤提供放线菌隔离。短暂,1克干土悬浮在9毫升无菌蒸馏水和无菌水10连续稀释⁻⁵。0.1毫升的整除每个稀释扩散板的淀粉酪蛋白琼脂培养基(SCA、Himedia、印度)补充25μ克/毫升的萘啶酸(美国Sigma-Aldrich)和50μ克/毫升的两性霉素B(美国Sigma-Aldrich)抑制革兰氏阴性细菌和真菌污染,分别。盘子在30°C孵化为7 - 14天。潜伏期后,观察每个板的存在放线菌殖民地,通常有粉状或粘合剂的性格,有皱纹的或干燥特性和分支丝有或没有空中菌丝(21]。的殖民地放线菌在酵母提取物re-streaked麦芽提取琼脂培养基(ISP-2、Himedia、印度)和孵化30°C 7 - 14天。纯放线菌殖民地单独保存在一个琼脂斜面ISP-2在4°C和保持在25% (v / v)甘油股票被储存在−80°C到使用。

2.2。筛选抗菌活性

的抗菌活性放线菌隔离是由初级筛选检查按照以下5选择人类致病菌:大肠杆菌ATCC25922,沙门氏菌血清型沙门氏菌感染ATCC14028,铜绿假单胞菌ATCC27853,蜡样芽胞杆菌MTCC430,金黄色葡萄球菌ATCC25923。测试微生物接种在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB、Himedia、印度)37°C为18 - 24 h。拮抗试验最初使用cross-streak筛选方法(22]。每个隔离的放线菌接种于ISP-2 30°C 7 - 14天。当时re-streaked在穆勒辛顿琼脂(尼古拉斯,Himedia,印度)直接在板的中心和孵化为7天30°C。每个测试致病性细菌是使用条纹线垂直于培养放线菌隔离在同一尼古拉斯板和孵化24小时35°C。的抑制作用放线菌隔离对试验菌株的生长评估使用抑菌圈的检测,结果表示如下:−=不活动;+ =弱活动(< 50%抑制);+ + =适度活动抑制(50 - 80%);和+ + + =强烈活动抑制(> 80%)。

2.3。假定的描述和识别链霉菌属隔离

有效的放线菌从抗菌筛选获得特征的存在链霉菌属用形态学方法,它主要依赖于革兰氏染色法,天线质量颜色和孢子的形成。形态观察是由增长ISP-2琼脂孵化为7 - 14天,然后在30°C的Gram-stained镜检。假定天线产生的菌丝的颜色链霉菌属隔离与国家统计局标准比较颜色表(23]。孢子链安排检查在油浸(1000 x)使用幻灯片培养法。此外,识别的链霉菌属分离是基于7生化测试:过氧化氢酶反应,尿素水解,H₂年代生产、吲哚生产、柠檬酸降解活性测试,赖氨酸脱羧酶(LDC)测试。的链霉菌属隔离被确定属水平根据Bergey系统细菌学手册(24]。

2.4。制备的原油提取

活性化合物的提取后进行Taechowisan et al。25)与小修改。45毫升ISP-2肉汤孢子悬浮液接种5毫升(1×10⁸孢子/毫升)10天大的选定的假定链霉菌属菌株生长在ISP-4 Himedia,印度板块和孵化与搅拌30°C 2天的120 rpm。孵化后,50毫升的这种文化无菌转移到450毫升ISP-2肉汤,然后在相同条件下培养5天。文化汤是一种高级绘画纸滤纸过滤收集上层的。乙酸乙酯(j.tB一个ker, USA) was added to the supernatant at a ratio of 1 : 1 (v/v) and shaken vigorously for 2 days. The solvent phase was vaporized to dryness at 50°C using a rotary evaporator (Heidolph, Germany). The filtrate of ethyl acetated crude extract was dissolved in 5 ml of acetone, dried, and kept at 4°C for further assay.

2.5。初步测试原油乙酸乙酯提取物的生物活性代谢物

收集到的粗提取物的抑制作用在决定使用琼脂扩散法检测细菌用细微的修改(26]。短暂,细菌生长在TSB 35°C的18 - 24 h后细胞颗粒使用离心收获2000 g×10分钟。颗粒是在决赛0.85%生理盐水resuspended细胞密度0.5麦克法兰的标准,然后擦洗在尼古拉斯的盘子。无菌6毫米软木钻孔机是用于在接种板上打孔。10毫克/毫升股票提取解决方案是由溶解干粗提取液10%二甲亚砜(DMSO,默克公司、美国),然后50μ每个提取的l是加载到洞。板块在室温下了45分钟,直到完全分散提取到媒介在孵化前的35°C 18 - 24 h。每个实验做了一式三份。1毫克/毫升链霉素(美国Sigma-Aldrich)和10% DMSO作为积极的和消极的控制,分别。周围明确区油井的直径以毫米,结果后来被报告为3个重复的平均值±标准偏差。的假定链霉菌属隔离显示更强的抗菌活性进一步选择确定的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的部分纯化细胞外原油提取测试病原体。

2.6。麦克风和MBC测定原油中提取

麦克风和MBC的乙酸乙酯粗提物进行评估使用比色汤采用方法与一些修改(27]。提取10% DMSO溶液中还原了蒸馏水最终获得2048的浓度μ克/毫升。然后,提取的二倍稀释系列于96年由双重力量MHB,平底的微量滴定板最终浓度从1到1024不等μ克/毫升。一个整除(50μ1×10 l⁶CFU /毫升)的细菌悬液随后被引入到井进行测试。板在35°C孵化15 h。积极控制链霉素(100μg / ml)和不育控制(0.85%氯化钠)包含在每个测试。所有化验测试剂进行了一式三份。潜伏期后,50μl(0.2毫克/毫升溶液2,3,5-triphenyl氯化四唑(Himedia、印度)加载所有井进一步确认细菌的生长和孵化3 h的35°C。改变颜色的粉红色表示细菌生长的存在,而缺乏任何粉红色的最低浓度提取被认为是麦克风的价值。此外,一个从每个稀释循环表现出生长抑制条纹在TSA板要注意生存的病原体。提取物的浓度导致没有细菌菌落的生长板视为MBC值。麦克风的抑制程度测定提取分类是基于以下几点:< 512的强有力的抑制剂,麦克风μg / ml;温和的抑制剂,麦克风的512 - 1024μg / ml;1024年>和疲软的抑制剂,麦克风μ克/毫升(28]。

2.7。分子识别和排序的16 s rRNA基因

所选的链霉菌属隔离显示强烈的敌对活动对测试细菌培养在营养肉汤1毫升30°C 96 h的风潮。颗粒的收集使用6000×g离心10分钟。基因组DNA提取DNA进行使用QIAamp迷你包(试剂盒、德国)制造商的指导后隔离革兰氏阳性细菌的基因组DNA。PCR扩增的16 s rRNA基因进行了使用通用引物27 f - 1492 r (29日]。bp 1400 - 16 s rRNA扩增子使用GenepHlow凝胶/纯化PCR工具包(Geneaid、台湾),随后测序(一垒公司、马来西亚)在两个正向和反向方向与上面相同的引物。纯化序列与序列数据存入基因库数据库使用NCBI BLAST方案。

2.8。数据分析

使用SPSS进行统计数据分析软件包版本26(美国IBM公司)。之间的抑菌圈直径均值比较原油提取并测试病原体进行评估使用单向方差分析测试与Dunnett T3事后分析。统计结果与 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。样本收集和隔离放线菌

数据收集的30个土壤样品的理化性质在那拉提瓦展示在表的三个地方1。的分布放射菌类隔离在这些样本被发现。总共有136放射菌类隔离是生长在SCA中(表1),其中45例(33.09%),57例(41.91%),34 (25.00%)放线菌从Bacho孤立,达克呗,分别和Yi-ngo土壤样本。

3.2。筛选抗菌活性

所有136放线菌分离筛选对5选择细菌病原体敌对活动。其中,只有19个分离株(13.97%)活跃的隔离(表2),其中,14隔离(73.68%)能强烈抑制的增长b的仙人掌MTCC430, 12个分离株(63.16%)有强烈的抑制作用金黄色葡萄球菌ATCC25923 8隔离弱或适度抑制增长大肠杆菌ATCC25922, 2个隔离的增长的抑制作用很微弱美国血清型沙门氏菌感染ATCC14028。所有的隔离可能抑制经济增长铜绿假单胞菌ATCC27853。最敏感的细菌产生的代谢物放线菌是b的仙人掌MTCC430和金黄色葡萄球菌ATCC25923;因此,他们选择进行进一步的测试。

3.3。假定表征和鉴定链霉菌属隔离

19日活动放线菌隔离是主要分为链霉菌属根据他们的形态外观包括颜色的气生菌丝体和孢子形成的存在。四种颜色的气生菌丝体被确定,大多数隔离灰色(9隔离;47.37%)、白(6隔离;31.58%),或黄色(3隔离;15.79%),如表所示3。幻灯片文化显示不同形状的孢子链根据每个隔离与螺旋,rectiflexibile, retinaculiaperti;然而,大多数隔离(42.11%)retinaculiaperti孢子链。所有隔离的生化特征如表所示3。这些分离株革兰氏阳性和过氧化氢酶。没有产生吲哚隔离或H₂美国柠檬酸和尿素的退化是指出在某些隔离。所有隔离non-motile LDC测试和消极。

3.4。初步测试原油乙酸乙酯提取物的生物活性代谢物

7隔离高对抗性的活动金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌被选出的MTCC430确定滤液粗提取物的生物活性代谢物。他们两个(隔离1 bac-7和12 bac-7)表现出良好的活动对测试细菌抑菌圈直径从8.17±0.29,13.00±0.00毫米(表4和图2)。

3.5。麦克风和MBC测定原油中提取

麦克风和MBC的原油提取的结果金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430表4。两种提取物的注意1 bac-7fe麦克风价值高(512μg / ml),被分类为一个温和的抑制剂金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430,而12 bac-7fe MIC值为256μg / ml被认为是一个强有力的抑制剂。它从隔离观察到粗提取液1 bac-7没有抗菌活性与其MBC值高于1024μg / ml反对金黄色葡萄球菌ATCC25923,而12 bac-7fe MBC值高(512μg / ml)。此外,提取分离12 bac-7较低MBC值(256μ比1 g / ml) bac-7fe反对B。昙花,MTCC430。标准的抗生素链霉素有麦克风和MBC值3.13和6.25μg / ml,分别对病原菌进行测试。

3.6。分子识别和排序的16 s rRNA基因

从假定部分DNA序列放大链霉菌属隔离7 bac-1 11 bac-7 2 bac-10 4 tak-5 9 tak-5 1 bac-7, 12 bac-7使用BlastN搜索进行了分析。结果表明,这些隔离标识为链霉菌属种虫害和99.3 - -100%的相似性及其基因库加入数字记录MZ389213, MZ389214, MZ389215, MZ389216, MZ389217, MT373689和MT373690分别。

4所示。讨论

努力发现新的生物活性物质是必要的,因为他们的优势目前治疗耐多药带来的传染病病原体。是否属于家庭放线菌是众所周知的世界各地的重要生产广谱次生代谢物(30.,31日]。在目前的研究中,30从稻田土壤样本3区那拉提瓦省被追究的存在放线菌。136年的流行放线菌隔离是最大的在德白(41.91%),其次是Bacho(33.09%)和Yi-ngo (25%)。这是第一个报告探索土壤放线菌在泰国南部的一个省。在泰国进行的一项研究发现50放线菌隔离从6土壤样本收集从春武里省32]。在另一项研究中,123例孤立的放线菌被发现在那空Ratchasima来自37个森林土壤样本,泰国(33]。放线菌普遍存在土壤中富含有机质,可以生长在土壤的表层深度5 - 10厘米的34]。我们的结果证明,所有的隔离放线菌广泛分布于酸性土壤pH值在3.7和5.2之间,和适度的水分从15.5%到37.9%不等,与先前的报道(35- - - - - -37]。各种影响因素的人口密度放线菌土壤样本中包括pH值、温度和土壤含水量(8]。目前的发现基于抗菌活性的筛选,确定19隔离(13.97%)主要展出鼓励向研究病原菌的抗菌活性。大多数活跃的隔离能强烈抑制增长金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430,而一些放线菌隔离有弱或温和的活动大肠杆菌ATCC25922和美国血清型沙门氏菌感染ATCC14028。然而,铜绿假单胞菌ATCC27853是最不敏感的细菌。萨普克塔等。38)报道,44.8%的孤立链霉菌属种虫害活动反对金黄色葡萄球菌活动,10.3%的人反对大肠杆菌和k .肺炎对,没有一个有活动铜绿假单胞菌。这些结果表明之间的不同敏感性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌由于独特的结构组成的细胞壁。革兰氏阳性细菌只是肽聚糖层,并不妨碍生物活性化合物的渗透。另一方面,革兰氏阴性细菌外膜组成的脂多糖成分,提供了一种有效的封锁亲脂性的溶质和导致更大的抵抗这些化合物39]。考虑的形态和生化特征19活跃的隔离放线菌在最近的研究中,他们的典型特征是按照属的一个成员链霉菌属。因此,分离都是自动识别为链霉菌属隔离。此外,气生菌丝体的灰色是最主要的(47.37%),其次是白色系列(31.58%)。这是符合先前的调查结果,灰色和白色系列报道是一个主要集团从土壤分离(40,41]。在活跃的隔离,选择7隔离显示强烈的抑制效果b的仙人掌MTCC430和金黄色葡萄球菌ATCC25923随后评估他们的能力分泌扩散性的生物活性代谢产物滤液原油提取基于琼脂扩散试验。结果表明,拮抗的影响原油提取12 bac-7fe和1 bac-7fe反对金黄色葡萄球菌链霉素ATCC25923明显低于标准。然而,抑菌圈的意思是12 bac-7fe反对b的仙人掌MTCC430阳性对照没有明显不同。其余5提取没有任何区域检测致病菌的抑制,这与他们的抗菌活性在琼脂板获得主要的筛查。结果是同意Abussaud et al。40),发现只有5 8活跃的隔离有活动在肉汤培养琼脂培养基产生拮抗作用。这些结果可能归因于不同的培养基成分,培养液的大小,或生长条件影响的能力链霉菌属隔离分泌不同稳定增长表面活性物质和液体介质(8,42]。另一个可能的解释是,一些活性代谢物排放是否可能被摧毁或溶剂萃取过程中发生了化学反应8,42]。提取的滤液来源于文化链霉菌属菌株利用乙酸乙酯被广泛利用恢复强大的次生代谢物。Lim et al。43]报道anti-MDR最强的细菌活动从乙酸乙酯提取物达到土壤链霉菌属。此外,乙酸乙酯提取物链霉菌属anulatusneae - 94对耐多药最高抑制效应金黄色葡萄球菌相对于其他溶剂萃取(44]。在最近的研究中,孤立的抑制活动12 bac-7反对金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430显然比孤立的乙酸乙酯粗提物获得1 bac-7;然而,这两个活动隔离显然是被证明链霉菌属高的物种相似性的基础上16 s rRNA基因序列分析。的比较我们发现早期的研究结果表明,原油乙酸乙酯提取的链霉菌属sp。FEAI-1明显表现出更高程度的抑制对金黄色葡萄球菌和b的仙人掌,麦克风和MBC值由-125年15.6的范围μ62.5克/毫升和-250μg / ml,分别45]。可能是因为实验中使用的文化条件的差异而影响活性代谢物的生产。王等人。46]报道不同过程的参数如温度、培养时间、碳,氮源对次生代谢物生产造成的影响。进一步研究优化生长条件和营养需求12 bac-7和1 bac-7隔离需要改善抗菌代谢物生产。此外,代谢物原油提取也应该通过HPLC-MS结构特征来识别活跃的化合物可能有助于未来发展成新的治疗药物。

5。结论

我们的研究主要集中在寻找新的、有用的生物活性代谢物soil-derived放线菌。2的链霉菌属spp。(隔离1 bac-7和12 bac-7)分离出30种不同稻田土壤收集在那拉提瓦省的3个地区,泰国南部。虽然,形成的乙酸乙酯粗提取物分离都温和对革兰氏阳性强烈抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923和b的仙人掌MTCC430,一个孤立的链霉菌属sp。(12 bac-7)应该被认为是一种很有前途的有效来源代谢物对所选测试病原体。

数据可用性

在这项研究中使用的数据都包含在这篇文章中,和核苷酸序列数据可从NCBI数据库。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

WC和SD设计研究并协助撰写和编辑的手稿。WC和WBI进行实验和分析数据。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是财务支持的医学院,公主Naradhiwas大学(Med.内部授予2019)。作者扩展他们的感谢安德鲁·约翰·华纳博士英语修正在这个手稿。

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