内生植物的刺盘孢属siamense生物防除和电阻感应瓜拉那幼苗 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

Paullinia cupanavar。sorbilis在巴西被称为瓜拉那植物,是一种重要的植物和一个主要传统作物在亚马孙。这是巴西本地物种的经济和社会的重要性,特别是在亚马逊地区。引起炭疽病刺盘孢属种虫害作物的主要挑战。因此,目前的研究证实是否c . siamense植物内生真菌感染真菌病毒,可以保护幼苗,减少或消除症状特征。总蛋白质和酶的活动pathogenesis-related蛋白质(prp),包括过氧化物酶(POX)、几丁质酶(气)和苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、量化。瓜拉那苗品种的猫被喷洒c . siamense分生孢子悬液(5.0×10³分生孢子/毫升)。十天之后,秧苗喷洒暂停植物病原体的分生孢子(1.0×10⁶分生孢子/毫升)。一组收到的这些幼苗的杀菌剂表示作物。两次杀菌剂应用应用程序之间的间隔15天。负控制幼苗没有收到任何处理(水和受精除外),和积极控制幼苗治疗只有植物病原体。实验项目2019年12月至2020年2月在一个温室。应用于治疗平均温度25°C和85%相对湿度。传单被随机收集各治疗组(0)48岁,72和96小时后病原体接种和分析总蛋白质和酶生产(痘、PAL和CHI)。28天后,幼苗叶病变的比例是评估。c . siamense接种减少损伤。总有差异蛋白质和prp在接种后不同时间点,除了气活动,在治疗。我们所知,这是第一个电阻感应在瓜拉那植物的记录。

1。介绍

瓜拉那工厂(Paullinia cupana肯。var。sorbilis(集市)。Ducke),属于无患子科的家庭,是一种原产于热带雨林。成果以刺激和其他药用价值。这ethnopharmacological知识来自原住民社区,最近,从当地的人口1]。瓜拉那粉,从种子通过干燥和磨碎,可以溶解在水中,摄取纯净,或与其他草药混合2]。的使用p . cupana软饮料行业的广泛一直探索(3),它也被用作制药和化妆品工业的原料在巴西和世界其他地区(4]。

刺盘孢属种虫害引起炭疽病在瓜拉那植物,叶枯病落叶紧随其后。在适宜的条件下,acervuli开发内部坏死病变,产生分生孢子的质量(5]。成熟的或老的叶子不受影响。连续攻击的真菌导致死亡的分支,最终的工厂6]。虽然各种方法对病原体的检测,化学防治仍然是黄金标准治疗炭疽病(5]。

生物防除是替代化学农药的应用由于其效率高、成本低、环境友好,它在世界范围内越来越多的被应用7]。生理植物和微生物之间的相互作用(真菌和细菌)可能造福于农业,这些相互作用促进植物生长和阻力8]。

诱导阻力的特点是植物保护植物病原体使用生物和非生物细胞内。各种微生物如真菌、细菌和病毒,可以在植物诱导抗性(9,10]。真菌已经测试的生物诱导葡萄(11),黄瓜12,番茄13),和大麦(14]。

炭疽菌siamensePrihastuti, l . Cai & k·d·海德内生真菌不同主机(15,16[],产生抗菌物质17和抗胆碱能类18),和其潜在bioherbicide一直探索(19]。在以前的作品(20.),卡萨斯等人观察接种后减少炭疽病症状c . siamense感染真菌病毒的时候种植在瓜拉那BRS-Cerecaporanga克隆的幼苗。

为此,本研究评估是否植物内生真菌c . siamense诱导阻力,降低或消除了典型症状在瓜拉那BRS-Maues克隆的幼苗。

2。材料和方法

2.1。微生物

内生植物的c . siamense携带真菌病毒以前从健康的叶子中分离出来的瓜拉那植物在茂圣海伦娜农场,亚马孙(3°25′18.1”年代,57°40′40 8”W),及其潜在的病原体生长抑制进行了分析在体外(20.,21]。致病性c . fructicolaPrihastuti l . Cai & k·d·海德曾从瓜拉那叶子中分离出来呈现坏死病变和沉积的文化收集植物病理学实验室的亚马逊国家研究所的研究(INPA)。c . fructicola致病性已经证明基于科赫法则(22]。

2.2。分生孢子产量进行分析

c . siamense在试管培养7天在合成营养琼脂(SNA)政权交替光每12 h在30°C。在每个管,10毫升无菌蒸馏水渐变80增加了1%。分生孢子收集从培养基使用软毛刷和量化使用纽鲍尔的房间。悬架被调整至孢子密度为5.0×10³分生孢子/毫升。c . fructicola在马铃薯葡萄糖琼脂培养上面(PDA)在同等条件下,悬架是适应孢子密度为1.0×10⁶分生孢子/毫升使用标准应用于植物病原刺盘孢属spp。23,24]。

2.3。体外试验

2.3.1。幼苗的准备

选定的瓜拉那苗BRS-Maues克隆被Jayoro请提供农业公司(Presidente Figueiredo、亚马孙、巴西)。基质成分是腐殖质加砂(4:1),尿素(0.56公斤/米³),氯化钾(0.3公斤/米³)和FTE-BR-12(0.2公斤/ m³)矿产受精。每一个黑包包含3公斤的衬底,肥料应用的根外追肥后每月相关建议(6]。幼苗被维护在一个温室实验区域的农业科学学院(FCA)的联邦大学的亚马孙(UFAM)。实验是在2019年12月至2020年2月之间进行的。实验设计是完全随机的四个治疗(消极的控制,积极控制,生物防治剂+病原体,和杀菌剂+病原体)和五个复制的幼苗。苗,只有水和施肥试验期间被认为是消极的控制。积极控制幼苗接种只有病原体。

2.3.2。生物防治剂接种

苗用三到四个年轻的叶子完全展开传单被用于这个试验。真菌悬挂是适用于所有传单(25°C,相对湿度86%)使用电动粉碎机和回转式压缩机(40磅力/波尔²;舒尔茨、巴西)。创建一个潮湿的室内使用透明塑料袋48 h。袋被移除,幼苗观察植物病原体暴露前10天。负控制秧苗喷洒无菌蒸馏水。

2.3.3。幼苗的准备炭疽病化学控制

这个试验中使用的幼苗有3至4个完整的叶子,最新发布,完全展开传单。苗用于化学控制化验喷洒杀菌剂flutriafol (12.5% m / v)准备根据制造商的指示。胶辊的艾格雷(2.5% v / v)被添加到混合物中。电动背包喷雾器(20 L)是用于应用程序之间7和9点(24°C,相对湿度90%)。第一个喷雾应用暴露于植物病原体的前2天,第二个应用后15天第一个应用程序(25°C,相对湿度86%)。

2.3.4。植物病原体接种

一个c . fructicola悬架准备和调整浓度为1.0×10⁶分生孢子/毫升。所有幼苗,除了消极的控制,在同一天注射植物病原体(25°C,相对湿度80%)和培养48 h潮湿商会促进分生孢子的萌发和殖民。幼苗被评估为28天,每天根据炭疽病的图解规模在瓜拉那植物(25]。

2.4。酶化验

2.4.1。酶的提取制备

现年48岁的传单被随机收集在0 72和96 h后病原体接种测量总蛋白质和酶的活动pathogenesis-related蛋白质(PRP)。五个传单收集从每个治疗复制。传单(150毫克)浸渍在1% (v / v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和1.2毫升0.1醋酸钠缓冲使用砂浆(EDTA pH值5.1毫米)。提取是离心机(离心机Excelsa®4 280 - r;Fanem、巴西)17970 g×25分钟。上层清液转移到超小型电子管和存储在−20°C (26]。所有程序都在4°C。

2.4.2。总蛋白

总蛋白质含量测定用布拉德福德在96孔酶标法(27]。酶法提取(10μL)和布拉德福德试剂(250μL)被添加到每个。2分钟后(24°C),吸光度测量在595 nm使用分光光度计(SpectraMax + 384;美国分子设备有限责任公司)。牛血清白蛋白(BSA)作为标准,结果是表达毫克每毫升(28]。

2.4.3。过氧化物酶(POX)活动

痘活动是在30°C使用直接分光光度法,基于转换的愈创木酚tetraguaiacol在470纳米29日]。到10μ酶法提取L, 290μ包含250 L的一个解决方案μL愈创木酚和306μL过氧化氢在100毫升0.01 M磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)补充道。混合添加到井,5分钟后吸光度测量的反应。酶活性计算使用摩尔消光系数(ɛ26600摩尔/厘米),活动单位表达的结果是每毫升(30.]。

2.4.4。苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)

到30μ酶法提取L,包含115的解决方案μL 0.1四硼酸钠缓冲(pH值8.8)和55μL (L-phenylalanine (20 mM)添加31日]。反应混合物被允许在30°C水浴中30分钟。控制样本,提取与1毫升的硼酸钠缓冲被替换下场。接下来,6μL 6 N HCl是用来停止反应。trans-cinnamic酸衍生物的吸光度测量使用分光光度计在290海里。酶活性是计算使用ɛ104毫米/厘米,和活动单位表达的结果是每毫升(32]。

2.4.5。几丁质酶(气)

太极拳活动进行了分析使用二硝基水杨酸(DNS)方法,基于量化N-acetylglucosamine(唠叨)最后减速器组1% (w / v)胶体几丁质作为底物(33]。米勒描述的方法(54)是用于修改(34]。0.035毫升的酶提取、0.035毫升的1%胶体几丁质是补充道。混合了微型板块井和孵化30分钟的50°C。反应是停止通过添加DNS(0.1毫升)在沸水浴10分钟。样本迅速冷却到24°C通过添加0.08毫升的水和离心机(离心机5430 R;埃普多夫,德国)在2204 g×10分钟。上层清液的吸光度测量在540海里。被定义为一个单位的太极活动释放的酶量每分钟1摩尔的唠叨下描述的条件。标准曲线构造使用唠叨(3.3毫克/毫升),和结果表达的活动单位每毫升。

2.5。统计分析

主数据之前使用一个同质性试验来验证方差分析(方差分析)。结果不同的治疗受到图基的测试( )使用SISVAR 5.7 (35]。病变和酶活性的结果转换为√(x+ 1)和同质性测试后进行方差分析。

3所示。结果

3.1。微生物

内生植物的c . siamense和植物病原体c . fructicola(图1)培养PDA获得各种瓜拉那苗。内寄生的显示一致的增长和殖民地色彩的典型刺盘孢属。植物病原体有菌丝的快速成长,虽然它没有显示粘液的分生孢子,在显微镜下显示了强烈的生产。突出附着胞的存在说明真菌的致病性特点(图1(f))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

3.2。体外试验

病原体引起的症状后留下的开始治疗后28天(箭头,图2)。第一个症状观察接种后第五天的病原体。叶坏死病变等症状,红褐色,保证金(图发展有更大的优势2 (d)),结壳的叶片,在严重感染的情况下,总干燥的叶子。的比例每个治疗中可以看到表的症状1。

(一)

(b)

(c)

(d)


治疗	病变(%)	简历(%)

积极的控制	1±0.023^一个	2.03
炭疽菌siamense+病原体	3±0.044^一个	1.79
杀真菌剂+病原体	4±0.092^一个	2.38

列中的值紧随其后的是相同的字母不明显不同( ,图基的测试)。简历:变异系数。

3.3。酶测定

总蛋白和prp量化在树叶收集在不同的时间点。总蛋白质之间没有明显差异负控制和幼苗感染植物病原体接种(表后直到96 h2)。


治疗	总蛋白(mg·毫升⁻¹)
	运行时间在小时后病原体接种
	0	48	72年	96年	简历(%)

CS +病原体	0.002±0.0007^b	0.003±0.0010^b	0.003±0.0010^一个	0.003±0.0007^一个	0.32
F+病原体	0.003±0.0009^一个	0.002±0.0006^一个	0.003±0.0009^一个	0.003±0.0009^一个	0.32
积极的控制	0.003±0.0009^一个	0.002±0.0010^一个	0.002±0.0012^b	0.003±0.0013^一个	0.46
消极的控制	0.003±0.0014^一个	0.003±0.0011^b	0.003±0.0013^一个	0.002±0.0011^b	0.42

列中的值紧随其后的是相同的字母不明显不同( ,图基的测试)。CS:炭疽菌siamense;F:杀菌剂;简历:变异系数。

POX活性更高的感染幼苗比消极的控制(表3)。48和72小时的时间,收到的幼苗内寄生的痘生产提出高于负控制的幼苗。72小时后,有一个在所有治疗酶产量的下降。


治疗	过氧化物酶(U mL⁻¹)
	运行时间在小时后病原体接种
	0	48	72年	96年	简历(%)

CS +病原体	2.434±0.39^一个	2.533±0.34^一个	2.447±0.38^一个	2.211±0.46^一个	0.16
F+病原体	2.030±0.47^b	2.325±0.44^ab	2.591±0.29^一个	2.122±0.42^ab	0.18
积极的控制	2.061±0.46^b	2.322±0.35^ab	2.577±0.41^一个	2.182±0.51^一个	0.19
消极的控制	1.877±0.49^b	2.132±0.52^b	2.092±0.45^b	1.812±0.52^b	0.24

列中的值紧随其后的是相同的字母不明显不同( ,图基的测试)。CS:炭疽菌siamense;F:杀菌剂;简历:变异系数。

PAL活性略增加后48和72 h(表4)。


治疗	朋友(U·毫升⁻¹)
	运行时间在小时后病原体接种
	0	48	72年	96年	简历(%)

CS +病原体	0.101±0.02^一个	0.098±0.01^ab	0.099±0.01^一个	0.087±0.02^一个	0.20
F+病原体	0.093±0.02^一个	0.103±0.02^一个	0.093±0.02^ab	0.084±0.02^一个	0.23
积极的控制	0.097±0.02^一个	0.098±0.02^ab	0.085±0.01^公元前	0.093±0.02^一个	0.22
消极的控制	0.085±0.02^一个	0.087±0.02^b	0.072±0.01^c	0.079±0.02^一个	0.24

列中的值紧随其后的是相同的字母不明显不同( ,图基的测试)。CS:炭疽菌siamense;F:杀菌剂;简历:变异系数。

太极拳活动略增加后48和72 h(表5)。气生产其他酶相比很随机。尽管统计数据显示治疗超过72 h之间的显著差异,酶的数量的差异是非常小的。


治疗	气(U·毫升⁻¹)
	运行时间在小时后病原体接种
	0	48	72年	96年	简历(%)

CS +病原体	0.0002±0.00005^一个	0.0002±0.00003^b	0.0002±0.00004^一个	0.0002±0.00006^一个	0.26
F+病原体	0.0002±0.00004^一个	0.0003±0.00007^一个	0.0001±0.00004^b	0.0002±0.00004^一个	0.27
积极的控制	0.0002±0.00005^一个	0.0003±0.00006^一个	0.0002±0.00006^一个	0.0002±0.00006^一个	0.32
消极的控制	0.0002±0.00006^一个	0.0002±0.00008^b	0.0002±0.0001^一个	0.0002±0.00008^一个	0.37

列中的值紧随其后的是相同的字母不明显不同( ,图基的测试)。CS:炭疽菌siamense;F:杀菌剂;简历:变异系数。

4所示。讨论

在目前的研究中,c . siamense在瓜拉那幼苗接种来评估其潜在抑制植物病原体和改变总蛋白质和prp的主机。在炭疽病控制化验,幼苗接种c . siamense面对病变的比例低于幼苗处理杀菌剂。然而,生物防除的功效仍低于疾病控制由植物的耐药机制(表1)。在先前的研究中,同样的真菌是用来控制炭疽病在瓜拉那苗(“Cerecaporanga”),观察病变比例(5%20.]。在目前的研究中,幼苗感染病原体仅显示病变比例的1%;然而,这些值更高,达到50%的成年植物(36]。本研究进行了苗期,因为没有数据表明损失的百分比比较的炭疽病。

然而,我们观察到的结果可以解释的基础上,以下几点。在这项研究中,采用生物防治剂悬浮浓度为5.0×10³分生孢子/毫升。在这样的化验,培养液必须更为集中。

例如,在研究木霉属asperellum悬架(37),他们使用了悬浮在一个集中的5×10⁸菌落接种高粱种子,而在另一项研究[38),悬挂在一个3×10的浓度⁵分生孢子/毫升。此外,生物防除代理申请的数量决定基于悬浮液的浓度接种。关于应用生物电控制代理的数量,有报道称两个应用程序的其他物种浓度较高的微生物(10⁸CFU)的间隔15天39]。

微生物已被公认为潜在的电阻电感和生长促进剂。在茶树幼苗处理t . asperellumTC01,炭疽病的严重程度所致c、降低了58.2% (38]。在研究t . asperellum死亡的比例,减少所致炭疽菌graminicola观察(33%),除了增加高粱的生长(37]。

系统性抗性微生物引起的植物病害生物防治的一个重要特征(40]。痘、PAL和太极与诱导系统抗性植物组织(41]。我们所知,目前的研究是第一个报道总蛋白质和prp瓜拉那植物。平均总蛋白质含量保持稳定在种苗处理72 hc . siamense,但它稍微增加48和72 h仅与病原体治疗后(表2)。在植物中,蛋白质合成发生后检测微生物在植物组织结构。这些结构对诱导子功能、激活一系列信号分子和诱导基因的表达编码prp (42]。蛋白质合成的反应时间根据不同的易感性或抗性植物(43)阶段的植物生命周期(44),和诱导子类型(生物或非生物)(45,46]。

在目前的研究中,痘和PAL的活性增加在瓜拉那苗48和72 h后感染c . fructicola和接种c . siamense。这种酶活性增加可能是由于减少病变特点,痘是国防相关流程,包括过敏反应、木质化,栓化,植物抗毒素生产41]。在烟草植物中,暂停芽孢杆菌siamensis是控制植物病原体接种主产。最大痘活动观察72 h后接种(47]。在鹰嘴豆幼苗接种rhizobacteria作为植物病原体的拮抗剂尖孢镰刀菌f . sp。ciceris接种后,痘和朋友活动增加了(48]。

接种的rhizobacteria种子推广植物先天免疫和阻止症状,这表明接种阶段的生物防除代理可能会干扰阻力对植物病原体激活的效率。朋友是PRP合成的关键酶。它催化nonoxidative脱氨基作用的苯丙氨酸反式肉桂酸和氨,这是一个初始步骤的生物合成的酚类化合物,包括水杨酸(SA) [49]。SA扮演着重要的角色作为信号分子诱导抗性基因的表达对食草动物和病原体(42]。没有明显差异在太极拳活动的治疗方法。

几丁质酶通常发现少量的蔬菜,和他们的增加是在暴露于病原体中几丁质结构,如真菌、昆虫和其他无脊椎动物(50]。预计,病原体接种后,会有这种酶的表达,增加(表没有被观察到5)。这些结果可能与类型相关的传单收集获得的酶提取。采用方法,随机收集传单并不总是受伤的标准化。因此,推断,在观察植物的病原体的存在是本地化的,几丁质酶的数量在健康传单可能不是那么高。此外,这种酶的活性在活的有机体内是复杂的,因为它是与位置等因素有关,植物的表达水平(51]。例如,基本几丁质酶位于植物细胞的液泡,可能不会直接接触真菌生长的细胞间隙(52]。酸的形式,另一方面,通常分泌到质外体或细胞外环境。另一个假设是,工厂的固有电阻可能使用其他生化机制不一定抑制疾病和几丁质酶等酶的生产。工厂的第一道防线是由结构和生化机制存在病原体之前沉积。角质层,气孔、纤维和毛状体的结构机制,而酚类、生物碱、不饱和内酯、氰和硫磺苷、植物毒素,和蛋白质/多肽的生化机制(53]。这种动态因素的协同交互解释了非齐次的叶病变分布范围从无症状的幼苗完全影响他人。

5。结论

目前的研究表明c . siamense接种减少的百分比病变所致c . fructicola瓜拉那苗。此外,这种植物内生真菌的存在促进了总蛋白质和PRP合成植物病原体接种后在不同的时间。更多的研究是必要的优化实验条件和验证的潜力c . siamense瓜拉那苗生物防除。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由改善高等教育的协调人员(披肩),巴西(融资代码001)和亚马孙州的基础研究的支持(FAPEAM 002/2018-UNIVERSAL亚马孙)。作者感谢联邦大学的亚马孙(UFAM)和Jayoro农业公司的技术支持和咨询。他们也感谢Editage (http://www.editage.com)英语编辑。

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国际微生物学杂志