文摘
葡聚糖酶是一种有用的酶,这种酶催化降解低分子量葡聚糖的分数,它有许多重要的商业和临床应用。内生真菌代表高的热稳定和pH-stable酶的来源。在这项研究中,Delonix regia树皮板试验,12个孤立的真菌菌株,透明区域被发现在只有一个应变。通过使用标准的rDNA测序分析,被确认为孤立的压力Talaromycessp。在碳源的情况下,在一个中等含1%右旋糖酐T2000作为唯一碳源,最大的葡聚糖酶活性达到大约120 U /毫升孵化后2天的最佳pH值为7.4。蛋白胨除了生产中作为唯一氮源是伴随着葡聚糖酶产量显著增加。同样,一些金属离子,如铁2 +和锌2 +,显著提高酶产量。然而,没有显著差异造成的铜2 +。原油葡聚糖酶是由硫酸铵纯化分离,其次是交联葡聚糖G100色谱28-fold净化。生产葡聚糖酶是45 kDa的最佳活动37°C和pH值为7。此外,MgSO的存在4,FeSO4,NH4所以4增加了纯化葡聚糖酶活动;然而,SDS和EDTA减少它。有趣的是,生产葡聚糖酶表达显著的pH值稳定,温度稳定,和生物膜抑制活动,减少一家生物膜86%和6%的生物膜的形成。
1。介绍
葡聚糖酶,α1,6-d-glucan-6 glucanohydrolase,是一种诱导酶,裂解α1,6-glycosidic联系在葡聚糖的水解导致高分子量右旋糖酐低分子量分数(1- - - - - -3]。葡聚糖酶产生的各种真菌,细菌和其它微生物广泛用于研究目的(4]。在医学上,本地的分葡聚糖酶水解葡聚糖生成特定分子量分数用于准备血液替代品震惊患者恢复血容量由于极度失血5- - - - - -8]。另一方面,葡聚糖酶发挥着有效的作用在食品行业,如糖浆、饮料加工(9]。在制糖业,葡聚糖酶可以最小化右旋糖酐蔗汁中有农药残留,这妨碍了糖生产过程(10蔗糖量),避免了巨大的损失和提高生产质量的糖(11- - - - - -13]。
在口腔卫生,葡聚糖酶可用于口腔护理产品,如牙科粘贴和漱口水,去除牙菌斑和预防龋齿。不同的dextranase-producing微生物,如细菌、霉菌、酵母,之前在各种研究报告(4,14- - - - - -17]。正如前面记录的,真菌是最常见的商业来源的葡聚糖酶酶活性高和低免疫效果,相比产生的细菌和其他微生物(2,18]。植物内生真菌酶有很大的制药,工业和农业的重要性和演示各种生物活动造成内寄生的天然产物(19,20.]。
之前的研究表明,大多数孤立的葡聚糖酶的特点是低热量和pH稳定性(1,21]。一般来说,真菌内生菌提高植物的性能和抵抗不同的压力和负担他们独特的适应通过生物活性化合物的生产(22,23]。因此,内生真菌可能产生真菌酶高度有益酶行业由于其合理稳定在高温和极端的pH值水平。本研究的主要目标是分离内生真菌生产葡聚糖酶和优化这种酶的生产条件。
2。材料和方法
2.1。隔离的内生真菌菌株和初级筛查Dextranase-Producing菌株
几个从真菌菌株Delonix regia植物,生长在埃及的三角洲地区。总共12收集植物内生真菌菌株。由此产生的真菌菌株有净化的酵母蛋白胨葡萄糖琼脂(YPD)板块和孵化28°C 3 - 8天。之后,一个独立的殖民地每个孤立的亚文化在葡聚糖酶production-screening介质(pH值5.5)含1%右旋糖酐T2000 [(2000 kDa)淀粉微球产品(乌普萨拉,瑞典)],0.3%纳米3,0.05%的氯化钾,0.1% K2HPO4h·32啊,0.05% MgSO4h·72啊,0.001% FeSO4h·72O、和1.5%琼脂粉,结果发现5天后孵化的28°C (1]。积极dextranase-producing菌株产生透明(清晰)对这种媒介的浑浊的背景区。
2.2。识别Dextranase-Producing内生植物
dextranase-producing真菌菌株的鉴定,核糖体内部转录间隔区(ITS)是使用通用ITS1放大(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)引物(英国Biosearch技术)。目标PCR产品(581个基点)被用作模板在测序反应使用ABI棱镜®BigDye终结者循环测序反应准备工具包(美国应用就近,福斯特城)。分析了反应混合物ABI 3730 DNA分析仪(美国应用生物系统公司,培养)。基于dextranase-producing菌株的DNA基因序列和相关生物基因库,多个DNA序列比对是使用软件包MEGA4版本执行。孤立的真菌菌株的检测,系统发育树构建neighbor-joining算法的使用引导测试后1000次。
2.3。培养条件对原油葡聚糖酶生产和优化培养时间
胞外葡聚糖酶的生产,生产的液体培养基由葡聚糖T2000 (g %) 1.5%, 0.1% K2HPO4.3H2O, MgSO 0.4%酵母提取物,0.05%4.7H2啊,和pH值7.4 (24]。孢子是调整数到107孢子/毫升使用直接显微计数血细胞计数器(10]。水下文化发酵,一毫升调整dextranase-producing菌株孢子悬浮液的悬浮在这种媒介(50 ml)其次是孵化在旋转瓶(200 rpm) 30°C为7天。之后,每个瓶是过滤的内容,其次是在6000转离心20分钟在4°C。当时上层清液检测酶活性(1,25储存在−)和葡聚糖酶生产的80°C,直到进一步的分析。
2.4。测定葡聚糖酶的生产
葡聚糖酶活动是由测量中还原糖解放es交互通过微型板块比色测定由索莫吉和纳尔逊用细微的修改26- - - - - -28]。96孔酶标,25岁μl酶样品与25孵化μl 1%右旋糖酐T2000可溶性在0.1 M柠檬酸缓冲(pH值5)在每个在37°C。孵化24小时后,50μl刚做好的索莫吉铜试剂添加;然后用醋酸表井是密封其次是孵化在80°C水浴30分钟。板与运行冷却用水进行冷却5分钟紧随其后的50μl arsenomolybdate试剂(2.5 g钼酸铵,3 g砷酸钠,2.1毫升浓硫酸,45毫升水)在每一个。使用微型板块分光光度计比色测量在500 nm读者ELx808™(Winooski Biotek仪器公司,VT)。标准曲线构造使用麦芽糖浓度从100年到2000年不等μ克/毫升。一个单位(U)葡聚糖酶的酶活性被定义为所需的酶催化的形成在1分钟1摩尔的麦芽糖标准试验条件(U /毫升)。其他值计算如下:
具体活动(U /毫克)=总活动(U) /总蛋白量(毫克),总活动(U) =酶活性(U /毫升)×酶解,而总蛋白=蛋白质浓度(毫克/毫升)×蛋白质溶液的体积(29日]。
2.5。蛋白质浓度测定
蛋白质浓度(毫克/毫升)确定使用布拉德福德方法使用布拉德福德试剂(热费希尔科学、美国)30.]。牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线是由策划不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma-Aldrich),这是作为标准蛋白对其吸光度值在595纳米微型板块分光光度计阅读的读者。每个蛋白质浓度在毫克/毫升计算基于吸光度测量标准相比在595海里。
2.6。优化不同影响因素的葡聚糖酶的活动
不同影响因素研究了葡聚糖酶活动接种葡聚糖酶生产媒体如前所述水下文化发酵条件。
2.6.1。葡聚糖酶生产优化碳源
最大的葡聚糖酶生产,不同的碳源,如葡萄糖、淀粉、蔗糖,添加浓度为1.5%在生长介质代替葡聚糖T2000。
2.6.2。葡聚糖酶生产优化的氮源和浓度
最大的葡聚糖酶生产、各种有机和无机氮源替代酵母提取物如蛋白胨、胰蛋白胨,尿素,硝酸钾,硝酸钠,硫酸铵补充0.4%的浓度。
2.6.3。葡聚糖酶生产优化培养基pH值
影响介质的pH值范围内测试3 - 8.5使用1 N盐酸和1 N灭菌前氢氧化钠。标准试验程序,酶活性的酸碱介质计算来确定最佳酶生产。
2.6.4。金属离子和其他试剂对葡聚糖酶产量的影响
一些金属离子的影响分别估计0.05%的浓度在标准试验条件下使用铜2 +(CuSO4)、锌2 +(ZnSO4),菲2 +(FeSO4在毫克)2 +离子(MgSO4)免费生产介质。
2.7。葡聚糖酶酶纯化
粗酶提取物是饱和硫酸铵处理解决方案从20到90%,其次是孵化与磁搅拌4°C。隔夜孵化后,收集沉淀蛋白质在10000转离心20分钟在4°C,紧随其后的是溶解在0.01磷酸钾缓冲(pH值7)。结果提取蛋白质透析在同一个缓冲区一夜之间在4°C。进一步净化浓缩透析酶进行交联葡聚糖G100列preequilibrated与磷酸钾缓冲(pH值7)低温流量为0.2毫升/分钟。收集一百分数(2每毫升)柱分离后,紧随其后的是吸光度测量在280 nm监控分离蛋白质的浓度(31日]。
确定酶活性后,分数高的葡聚糖酶活动汇集在一起,其次是确定分子量12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)分离之后,考马斯亮蓝染色法(32]。
2.8。不同的参数对活动的影响和/或葡聚糖酶酶的稳定
孵化温度效应对葡聚糖酶活性测定在25日,30日,37岁,40岁,50岁和60°C。相对活动被表示为一个百分比最高的活动,而葡聚糖酶活性最高的100%。葡聚糖酶的耐热性测试没有基质添加治疗的1 h在0.01 20 - 90°C磷酸钾缓冲控制样本(pH值7)。100%的活动作为最大的酶活性。
为研究pH值的影响,净化葡聚糖酶酶活性测定的pH值范围3.0 - -10.0(柠檬酸柠檬酸钠缓冲,pH值3.0 - -6.0;磷酸钾缓冲,pH值7.0 - -8.0;carbonate-bicarbonate缓冲区,pH值9 - 10)。相对活动被表示为一个百分比最高的活动,而葡聚糖酶活性最高的100%计算。葡聚糖酶活动的pH稳定性测试在3.0 -10 pH值范围为1小时37°C使用相同的缓冲区。的相对活动表示为百分数最大的活动。此外,一些金属离子和试剂的影响,即MgSO4,NH4SO4,FeSO4、氯化钠、SDS、EDTA影响葡聚糖酶活动调查在3种不同浓度,1毫米,5毫米,10毫米。
2.9。定量检测生物膜的活动
定量测定的生物膜生产、标准菌株P。绿脓杆菌PAO1(微生物学和免疫学部门文化集合)TSBG(胰蛋白酶的酱油汤补充1%葡萄糖)在一夜之间文化是调整在600 nm (OD 0.2 - -0.25600海里)使用分光光度计(WPA colorwave CO7500色度计)(33]。100年之后,μl整除预调文化接种在四个邻近直井,除了消极控制(仅TSBG),其次是孵化24小时37°C。隔夜孵化后,每个被和清洗的内容与200年的三倍μl磷酸缓冲盐(PBS) (0.01 M, pH值7.4)。贴壁细胞被固定治疗150μl无水甲醇为15分钟,其次是甲醇的愿望。干燥后,每个150玷污了μl 1% (w / v)结晶紫和留给20分钟;然后板冲洗三次蒸馏水和风干。结果结合生物膜resolubilized通过增加150μl 33% (v / v)冰醋酸。在540 nm,测量进行使用ELx808™吸光度标(Winooski BioTek仪器公司,VT) (34- - - - - -37]。
2.9.1。酶在生物膜生产的影响
antibiofilm酶活性的测定,100年μl的纯化酶(5 U) 0.01米磷酸钾缓冲4复制100年了μl (OD-adjusted细菌悬液,其次是在37°C孵化24小时没有颤抖。作为一个消极的控制,100年μl 0.01磷酸钾缓冲被用来代替纯化酶。孵化后,生物膜活性决心如上所述。
2.9.2。酶在旧建立了生物膜的影响
调查的葡聚糖酶影响24小时老牌PAO1菌株的生物膜,100μl的纯化酶(5 U) 0.01米磷酸钾缓冲(pH值7)被添加到4井窝藏24 h老牌生物膜的标准菌株PAO1,其次是孵化24小时在37°C。消极的控制是由增加100μl磷酸钾缓冲(pH值0.01米,7)到4井窝藏24 h老PAO1生物膜相同的压力。一夜之间,生物膜减少活动被量化后孵化。相对生物膜减少活动是按照百分比计算相对于消极的控制(减少百分比设置为0%)。
2.10。统计分析
数据分析使用单向方差分析后跟Bonferroni使用SPSS软件的测试。
3所示。结果与讨论
3.1。Dextranase-Producing菌株的筛选和鉴定
在有氧条件下,只有一个隔离(名为EGY)形成了一个透明带筛选媒体通过降解葡聚糖T2000板。系统发育树的构建,包括其rDNA序列(581个基点)的孤立的应变和一些从基因库获得序列(图1)。结果,被确认为孤立的压力Talaromycessp。
(一)
(b)
3.2。培养时间对葡聚糖酶产量的影响
一般来说,潜伏期不同根据微生物生长速率和酶生产的模式10]。48 h的孵化后,葡聚糖酶活性增加到最大产量达到大约120 U /毫升(图2)。同样,2014年,蔡等人发现,葡聚糖酶生产的最佳培养时间Catenovulumsp.是0和48 h的范围内(38]。相比之下,最高产量的葡聚糖酶达到5天后拟青霉属lilacinus和7天的孵化镰刀菌素sp.和青霉菌aculeatum(10,39]。
3.3。葡聚糖酶生产优化碳源
不同的碳源如葡聚糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖添加作为唯一碳源的葡聚糖酶生产中。最大的葡聚糖酶生产实现当只有右旋糖酐T2000成立在培养基中,虽然没有酶生产中检测出媒体补充葡萄糖、蔗糖、淀粉(图3)。这些结果表明,葡聚糖酶酶生产高度substrate-specific和诱导。先前一些研究报道,增加微生物生长和葡聚糖酶生产可以观察到当使用右旋糖酐作为碳源40- - - - - -43]。
3.4。葡聚糖酶生产优化氮源
一些有机和无机氮源检测他们的角色在葡聚糖酶酶的生产。酵母提取物、蛋白胨和胰蛋白胨支持更高的酶生产的2nd天的孵化,但不同的互动;蛋白胨导致显著增加酶生产酵母提取物相比。相比之下,没有显著区别胰蛋白胨和酵母提取物可以追踪(图4)。在另一项研究中发现了类似的结果,从芽孢杆菌sp.作为dextranase-producing微生物(41]。此外,酵母膏和蛋白胨与葡聚糖酶产量水平高有关Catenovulumsp。,而大豆粉、玉米粉、和酪蛋白葡聚糖酶产量有所下降。此外,无机氮源,如硝酸铵、尿素、硝酸钾、磷酸和铵,对葡聚糖酶产量没有显著影响。同样的观察以前检测到使用无机氮源如硫酸铵、硝酸铵(38]。
3.5。葡聚糖酶生产优化的pH值
文化传媒的初始pH值的影响研究了葡聚糖酶生产的pH值范围3 - 8.5。酶的最高产量在pH值达到7.4;然而,显著减少酶生产时观察到媒体的pH值逐渐降低(图5)。一些研究表明,最大葡聚糖酶酶产量青霉菌funiculosum和Catenovulumsp.可以在初始pH值达到8.0 (17,38]。相比之下,由不同的真菌物种能够达到最优葡聚糖酶生产的pH值的范围从5.5到6.0 (10,16,39,44]。
3.6。金属离子对葡聚糖酶产量的影响
一些金属离子的影响葡聚糖酶生产Mg相比+ 2是估计的。的铁+ 2或锌+ 2导致酶产量显著增加。然而,没有造成显著影响铜的加入+ 2(图6)。
3.7。纯化酶的识别
Talaromycessp.原油葡聚糖酶酶主要是集中了70%硫酸铵治疗。这部分纯化酶的具体活动385 U /毫克(表1)。葡聚糖酶的酶被使用交联葡聚糖凝胶过滤层析进一步纯化G100。样本管19、20、21和22日被sds - page合并和分析。纯化的葡聚糖酶在合并后的分数出现作为一个乐队(图7(一)),表明单体分离的高效净化过程中,净化28-fold浓度以6%的收益率和3429 U /毫升(表特定活动1)。纯化的分子量葡聚糖酶是大约45 kDa(图7 (b)),这是不同于其他之前报道真菌葡聚糖酶等曲霉属真菌allahabadiiX26 (66 kDa) (12),Talaromyces pinophilus编辑(58 kDa) [45),青霉菌aculeatum(66.2 kDa) (21]青霉菌cyclopium(66 kDa) (46),而毛壳菌属globosum(53 kDa) [31日]。
(一)
(b)
3.8。葡聚糖酶酶学性质
3.8.1。温度和pH值对葡聚糖酶活性和稳定性的影响
pH值和温度的影响进行了研究Talaromycessp.葡聚糖酶的活动。的最适温度37°C。葡聚糖酶的热稳定性评估显示,这种酶保留超过80%剩余活动后存储在20 - 70°C 1 h。此外,pH值6是最大葡聚糖酶活性(所需数据8和9)。产生的酶是非常稳定的pH值范围5.0 - -8.0(图9)。因此,生产葡聚糖酶是高度热稳定性和pH-stable。然而,对葡聚糖酶青霉菌aculeatum、最佳pH值和温度是4.5和45°C,分别为(21]。葡聚糖酶活性最高青霉菌cyclopium据报道在55°C和pH值5.0 (46]。有趣的是,毛壳菌属globosum葡聚糖酶能够承受高温60°C和低pH值为5.5 (31日]。
3.8.2。几个因素和化合物对葡聚糖酶活性的影响
几个化合物对葡聚糖酶活动的影响研究考虑到控制(化合物)的反应没有添加100%活动(表2)。酶活性增加的摘要(1毫米),MgSO4(10毫米)和(NH)4)2所以4(10毫米)17.7%、12.6%和18.8%,分别。相反,氯化钠(1毫米)其次是酶活性降低了5.6%。然而,Na+和菲2 +提高了酶的活性青霉菌cyclopium(46]。相比之下,一些结果表明FeCl2(1毫米)强烈抑制葡聚糖酶的活动青霉菌aculeatum和毛壳菌属globosum(21,31日]。在最近的研究中,添加EDTA(10毫米)和SDS(5毫米),其次是减少酶活性为9%和12.6%,分别。类似的观察发现的酶活性毛壳菌属globosum和Talaromyces pinophilus被EDTA(10毫米)略有下降了8%和17%,分别为(31日,45]。相比之下,Talaromyces pinophilus葡聚糖酶活动可以增加9% SDS(5毫米)的存在45]。
3.9。葡聚糖酶酶对生物膜形成的影响P。绿脓杆菌标准菌株PAO1
酶的作用除了在一家生物膜以前记录(47]。在我们的研究中,酶的使用5单位减少86%活动24小时老牌的生物膜P。绿脓杆菌应变PAO1,坚持的微量滴定板(图10)。此外,生物膜形成时减少了6%P。绿脓杆菌与葡聚糖酶cocultured来自哪里Talaromycessp。(图10)。类似的观察结果Catenovulumsp. 40单位catenovulum葡聚糖酶在媒体BHI阻碍了生物膜的形成,减少的细胞群年代。变形链球菌坚持玻璃盖玻片(38]。
4所示。结论
总之,一个真菌菌株鉴定为Talaromycessp.可能产生热稳定性酶表达高酶活性(大约120 U /毫升)。研究酶的生产影响因素导致的结论是,最佳碳源是右旋糖酐T2000最佳pH值为7.4。同样,发现最大酶产量的2nd天的孵化。一些生产条件的变化可以追踪;蛋白胨作为氮源增加了酶的生产。菲2 +和锌2 +除了导致酶活性显著增加,而铜2 +在这样的活动还没有显著差异。粗酶提取纯化部分(三倍)用硫酸铵沉淀(70%饱和),然后通过凝胶过滤层析进一步纯化(28-fold)。纯化葡聚糖酶是45 kDa的最适温度37°C和一个最佳pH值为6.0。葡聚糖酶活性增加MgSO的存在4,FeSO4,NH4所以4。相比之下,SDS和EDTA灭活酶。此外,纯化葡聚糖酶减少了24 h老牌生物膜P。绿脓杆菌标准菌株PAO1 86%,抑制生物膜的形成在一个较低的程度上(减少6%)当cocultured这种细菌。最后,因为:高pH值的稳定性Talaromyces葡聚糖酶,内生真菌可以被认为是有前途的葡聚糖酶酶的来源有不同的行业应用。
数据可用性
所有数据集生成或分析本研究可在合理的请求期间从相应的作者。
信息披露
这项工作进行了微生物学部门,学院制药、收住曼苏拉大学,科埃及。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢教授阿塔哈卡里尔,生药学教授学院制药、收住曼苏拉大学,科提供工厂的样品和他的帮助在工厂工作。作者要感谢Mohamed Eladawy先生,示威者在美国微生物学和免疫学,学院制药、收住曼苏拉大学,科帮助生物膜一章。我们特别感谢扩展到Rana Sherif小姐,前研究员生物化学部门,德州理工大学艺术与科学学院帮助英语用法。