文摘
本研究分离和鉴定植物内生细菌的叶子文珠兰属macowanii和研究潜在的细菌内生植物提取物的抗菌和抗癌药物及其随后的次生代谢物。从内生菌乙酸乙酯提取物和树叶(甲醇:二氯甲烷(1:1)被用于对所选致病性细菌抗菌活性菌株用肉汤采用的方法。针对U87MG胶质母细胞瘤的抗癌活性和A549肺癌细胞是由MTS (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxy-phenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)测定。细菌成功分离出的内生菌c . macowanii叶子包括Raoultella ornithinolytica,不动杆菌guillouiae,假单胞菌sp。假单胞菌palleroniana,假单胞菌putida,芽孢杆菌safensis,肠杆菌属asburiae,假单胞菌cichorii,节细菌属pascens。假单胞菌cichorii表现出广泛的抗菌活性对革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌节细菌属pascens显示至少0.0625毫克/毫升的麦克风。芽孢杆菌safensis原油提取是唯一样本显示明显的对A549细胞减少50%肺癌细胞浓度达到100μ克/毫升。代谢物的分析芽孢杆菌safensis,假单胞菌cichorii,节细菌属pascens原油提取显示存在已知抗菌和/或抗癌药物如lycorine (1) angustine (2), crinamidine (3), vasicinol(4),和powelline。它可以得出的结论是,从获得的原油细菌内生植物提取物c . macowanii叶子可以可以bioprospected biosynthesize生物活性化合物和医学应用抗菌,抗癌药物。
1。介绍
全球传染病的出现由于细菌和病毒仍然是一个严重的公共卫生问题,每年夺去了一百万人的生命,占全球总死亡人数的25% (1]。即使的发现和生产新产品和改进抗生素、病原微生物的抗药物增加了巨大的(2]。传言(3)表明,抗生素耐药性的原因包括过度使用、不合适的处方,和广泛的农业使用。因此,迫在眉睫的需要发现和开发新药物来抵御抗菌素耐药性(4]。世界卫生组织(世卫组织)已宣布,抗生素耐药性是一个全球性的公共卫生问题,声称在全球至少有700000年度死亡(5,6]。新的治疗方法应该发现抵御抗菌素耐药性(7]。大约15%的全球癌症和细菌感染属性,因此,是一个严重的健康问题8]。
在南非,脑癌似乎更普遍的男性(0.57%)高于女性(0.38%)(9]。神经胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统(CNS)肿瘤主要影响大脑10]。恶性胶质瘤是侵略性的癌症预后不良和病人平均生存18个月(11]。在南非,肺癌是常见的男性为4.91%,女性为2.52% (9]。肺癌被认为是最常见的癌症之一,在发达国家,一个非常贫穷的存活率,因为大多数患者诊断阶段,治疗治疗是不可能的。这是最难的癌症诊断(12]。世界卫生组织癌症列为全球第一大死因的人70岁以下,估计1810万新癌症病例和2018年960万人死于癌症13]。Kumar et al。14)描述了化疗药物的发现和开发治疗癌症是至关重要的,因为目前使用的治疗方法是无效的,有副作用,和许多重要的抗癌药物,如喜树碱、penochalasin, chaetoglobosin E,从内生菌分离。因此,在细菌内生菌进行进一步调查。
从不同的植物物种和植物内生菌已报告部分,在不同的地理位置和不同的环境条件15]。内生菌在宿主植物;他们改善耐旱和产生保护化合物保护宿主植物从生物和非生物因素16]。此外,Dembitsky [17)报道,内生菌产生生物活性次生代谢产物,如生物碱和内酯显示抗菌和抗癌特性。这些生物活性化合物可以探索进一步的医学,农业,和药品使用(18]。内生菌独特的生物领域越来越少见的居住环境,和他们的隔离和标识为进一步勘探至关重要(19,20.]。
文珠兰属macowanii贝克是一个药用植物原产于东部,中部,南部非洲(21]。灯泡、树叶和树根c . macowanii具有药用价值,传统上被用来治疗或管理动物和人类疾病(20.,21]。不同的植物部分用于胸痛、腹泻、肺结核、促进产奶的牛和,因此,过度开发,不被用于药用(21]。生物活性的次生代谢产物是归因于组件在化合物的混合物(协同)相比,在隔离(22];因此,代谢物指纹的原油内生菌提取物在药物发现是至关重要的。Morare et al。24)和Sebola et al。25]报道隔离细菌内生菌的灯泡和粗提取物的抗菌活性,使细菌内生菌分离树叶未开拓的。混合的天然提取物是有效的在寻找新的药物,因为它们减少耐药表型,从而这研究[26]。
本研究的主要目的是孤立和识别细菌内生菌文珠兰属macowanii叶子和探索植物内生原油提取潜在的抗菌的作用,抗癌药物,进一步分析产生的次级代谢物分离内生菌作为一种手段停止肆意文珠兰属macowanii叶子。
2。材料和方法
2.1。样品收集
收集树叶是根据Sebola方法描述et al。25),新鲜的,健康的c . macowanii叶子显示没有明显症状的疾病或食草动物伤害收集从瓦尔特·西苏卢国家植物园(鲁,豪登省,南非,26°05 10.4′S 50°27′41.5 E)。集合后,样品被放置在无菌聚乙烯袋和转移到实验室4°C被彻底清洗用无菌蒸馏水,用之前的几小时内收割。
2.2。孤立的细菌内生菌
细菌内生菌分离方法从植物的叶子被加西姆et al。(27)和Sebola et al。25与一些细微的修改。简而言之,树叶被切成小块使用无菌剪刀大约10厘米。剪叶处理5%渐变20 (Sigma-Aldrich、南非)(足以覆盖植物材料)和大力动摇了5分钟。渐变20被用无菌蒸馏水冲洗几次,其次是与50毫升的70%乙醇消毒1分钟。乙醇的痕迹被用无菌蒸馏水冲洗5次。然后,该样本有1%次氯酸钠(NaClO) 10分钟,再用无菌蒸馏水冲洗5次。最后冲洗被用作控制和100μL(这是镀在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(美国HiMedia)和营养琼脂(NA)(美国Oxoid)。样品在消毒然后浸渍磷酸盐(PBS)。浸渍样本连续稀释10−3稀释,每个稀释接种(使用扩散板法)在营养琼脂一式三份。NA板块孵化在30°C (IncoTherm Labotec,约翰内斯堡,南非)。增长是定期监测5天。灭菌的有效性监控在洗控制面板,增长表明可怜的灭菌。在这种情况下,植物部分被丢弃的盘子和灭菌是重复的。选择不同的殖民地和亚文化在营养琼脂获得纯粹的隔离。纯细菌分离甘油保存在50%在500年的比率μL甘油:500μL隔夜肉汤培养和保持在−80°C。
2.3。内生细菌的形态学鉴定
2.3.1。革兰氏染色法
确定形状和革兰氏染色剂反应,一个方法所描述的八婆(28使用了)。纯殖民地受到革兰氏染色法建立形态特征,如形状和革兰氏染色剂的反应。革兰氏染色剂幻灯片使用复合亮场显微镜观察(奥林巴斯CH20BIMF200) 1000 x放大。
2.4。分子识别
2.4.1。基因组DNA提取、聚合酶链反应、测序
16 s rRNA基因显示细菌体内寄生菌的放大方法描述Kuklinsky-Sobral et al。28]。DNA提取做了使用锆真菌/细菌工具包™(Zymo研究目录没有R2014)根据制造商的指示。聚合酶链反应(PCR)是为了放大每个细菌体内寄生菌的16 s rRNA基因引物16 s-27f: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和16 s - 1492 r: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,使用DreamTaq™DNA聚合酶(热科学™)。PCR产品凝胶萃取(Zymo研究Zymoclean™DNA凝胶回收试剂盒)和测序在正向和反向方向ABI棱镜™3500 xl基因分析仪。的测序进行Inqaba Biotechnical行业(企业)有限公司,比勒陀利亚,南非。PCR产品清洗与ExoSAP-it™遵循制造商的建议。纯化测序产品(Zymo研究、zr - 96 DNA测序清理工具™)分析了使用CLC主要工作台7,紧随其后的是一个爆炸搜索(NCBI)。
2.5。系统发育分析
获得的序列筛选使用DECIPHER23嵌合体和受到爆炸分析使用国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对16 s rDNA序列数据库确定最接近的细菌(细菌和古生菌)的物种。细菌种类有98 - 100%的相似性选择进行系统发育分析。核苷酸序列的比对进行使用肌肉与默认选项。包含空白的位置或失踪核苷酸数据被淘汰。系统发育树构建使用Neighbor-Joining (NJ)方法(斋藤和Nei, 1987)基于Tamura-Nei模型(29日]。共有1000个复制被用于引导测试。所有分支机构超过50%接连被认为是重要的(31日]。在大型7.0[所有进化进行了分析31日]。细菌分离株的16 s rRNA基因序列研究沉积在基因库中标识(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)加入数字所表1。细菌分离株的名称是基于爆炸相同百分比以及系统发育的结果。
2.6。提取的粗提取物c . macowanii叶子
二次代谢产物的提取从树叶使用先前所描述的方法进行了Yadav和《32)和Sebola et al。25]。c . macowanii叶子洗,切成小块,在室温下晾干。植物干物质混合成细粉使用商用搅拌机。150克的工厂准备材料混合2 L 50: 50甲醇:二氯甲烷的解决方案。这是允许摇晃3天在平台上瓶(Amerex Gyromax,泰梅库拉,CA,美国)在200°rcf。解决方案是通过绘画纸1号滤纸过滤;滤液蒸发在旋转蒸发器和允许空气干燥器干燥。
2.7。提取的粗提取物细菌内生菌
粗提取物的提取分离内生细菌使用前面描述的方法进行Sebola et al。25]。简而言之,磅汤(1升)准备在2 L的肉汤和测量4 L锥形烧瓶离开房间通风和热压处理过的121°C,持续15分钟。每个4 L瓶接种表中列出的植物内生细菌之一1,动摇了200°rcf和孵化30°C,一个理想的温度发展的内生菌(33]。经过7天的培养、无菌XAD-7马力树脂(20 g / L)(σ,约翰内斯堡,南非,BCBR6696V)添加到文化2 h,动摇200 rcf。树脂粗棉布过滤,清洗三次,每次300毫升的丙酮洗。丙酮可溶部分集中使用一个旋转蒸发器,和暗黄色粘性提取得到,转移到一个量筒。根据体积,乙酸乙酯添加比例为1:1 (v / v)。混合大力动摇了大约10分钟,倾析分液漏斗,并允许分离和收集每个阶段在一个锥形瓶。重复此过程,直到获得的暗黄色粘性液体后删除丙酮变得非常淡黄色液体。乙酸乙酯部分是使用旋转蒸发器蒸发,布朗提取获得的是存储在一个琥珀瓶在阴凉干燥的地方,直到做了分析。淡黄色液体蒸发,没有合理的提取或进一步分析了这种物质。棕色的原油内生植物提取物用于抗菌,抗癌化验和代谢物指纹。
2.8。抗菌的分析文珠兰属macowanii灯泡原油提取和原油二次代谢物提取植物内生细菌
评估原油的抗菌活性次级代谢物提取进行使用的最低抑制浓度(MIC)方法如前所述Sebola et al ., Sebola et al .,安德鲁斯,(25,34,35]。十一个致病性细菌物种,即蜡样芽胞杆菌(ATCC10876),枯草芽孢杆菌(ATCC19659),链球菌epidermidis(ATCC14990),金黄色葡萄球菌(ATCC25923),m . smegmatis(ATCC21293),分枝杆菌marinum(ATCC927),肠杆菌属aerogenes(ATTC13048),大肠杆菌(ATCC10536),克雷伯氏菌肺炎(ATCC10031),变形杆菌属寻常的(写明ATCC 33420)变形杆菌绿脓杆菌(ATCC10145)。抗生素链霉素作为阳性对照,由重达0.032毫克1毫升无菌蒸馏水而0.1% DMSO作为消极的控制。
2.8.1发布。样品制备
原油离开提取和原油内生植物的提取物分别重进空热压处理过的麦卡特尼瓶确保不育。少量的二甲亚砜(DMSO)(0.1%)被用来溶解原油提取,和Mueller-Hinton (MH)肉汤是添加到使溶解的粗提取液的体积32毫克/毫升的浓度作为股票的解决方案。
2.8.2。微量滴定板试验
连续使用MH肉汤稀释进行从16毫克/毫升0.031毫克/毫升,这是最低的抑制。实验进行了五个重复使用96 -微量滴定板。板的外井满心无菌蒸馏水(sdH)2O)培养液(100μL)被添加到每个不包含sdH2o .稀释原油提取样本(100μL)被添加在五井水平,而浓度降低了垂直顺序从16毫克/毫升0.031毫克/毫升。盘子都淹没了,一夜之间孵化37°C。孵化后,10μL 0.02% (w / v)刃天青钠盐染料溶液添加到井,和最终的解决方案是孵化一两个小时。减少、刃天青改变颜色从蓝色,粉色清除氧变得有限介质内,表明新陈代谢和细菌细胞的生存能力,以及没有影响原油提取的细菌。任何与一个已知浓度显示轻微的颜色变化是用作麦克风。井是视觉检查颜色变化。
2.9。抗癌化验
抗癌活性的评估使用MTS的原油进行二次代谢物提取(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxy-phenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)测定如前所述Sebola et al。(25]。200年的一个股票的解决方案μg / mL的粗提取物(离开原油提取和内寄生的粗提取液)是在0.1% DMSO和用准备的。连续稀释是根据(36,37]。简单地说,从100年进行稀释使用增长媒体μ3.13 g / mLμ克/毫升。5-dimethylthiazol-2-yl MTS (3 - (4), 5 - (3-carboxymethoxy-phenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)在体外癌症细胞毒性试验进行确定细胞生存能力的变化通过使用一种颜色改变。MTS复合(黄色)是由可行的细胞代谢形成暗紫色化合物,而死细胞把MTS复合粉的颜色。样本运行在三个板块(一式两份n= 6),据报道获得的平均值。U87MG(胶质母细胞瘤)细胞A549细胞(肺癌)使用正常组织培养技术使用杜尔贝科的修改鹰介质(默克、约翰内斯堡、SA)补充15%胎牛血清(的边后卫)(默克、约翰内斯堡、SA)。细胞(1×105细胞/毫升)孵化96 -孔板在37°C一夜之间,后续增加的原油灯泡提取和原油内生植物的提取物,在100年的浓度μ50.0 g / mL,μ25.0 g / mL,μ12.5 g / mL,μ6.25 g / mL,μ3.125 g / mL,μg / mL, 0μ克/毫升。这些细胞被培养4天,于是MTS (5μL)(美国WI Promega,麦迪逊)添加到细胞中。测量吸光度值在1小时后490海里,2小时和4 hr潜伏期。细胞生存能力计算公式 在哪里E一个提取液的吸光度,B一个是空白的吸光度,C一个的吸光度控制(39]。积极的控制是金诺芬用于所有进行测试,因为它能够抑制硫氧还蛋白还原酶以及ubiquitin-proteasome系统(UPS)通过瞄准proteasome-associated deubiquitinase,从而诱导肺癌细胞凋亡的selenocystine [39- - - - - -41]。
2.10。LC-QTOF-MS分析
2.10.1。仪表
原油离开提取原油内生菌次生代谢产物的提取识别使用LC-QTOF系统Dionex终极3000 UHPLC(热科学,达姆施塔特,德国)耦合到一个紧凑的™QTOF(力量Daltonics,不来梅,德国),使用一个电喷雾电离(ESI)界面,修改后的方法通过霍夫曼et al ., Changwa et al .,, Tapfuma et al ., Tapfuma et al。42- - - - - -46]。在这项研究中使用的仪器参数表中列出2。仪器操作控制和收购完成使用HyStar软件2.1版本(热科学,达姆施塔特,德国)。分析运行被设定为40分钟。
用于流动相梯度流表中列出3。
2.10.2。数据处理
光谱数据处理进行力量罗盘DataAnalysis软件4.3版本(力量Daltonics, Brem中心,加利福尼亚,美国)。MetFrag web 2.1版本的工具软件(美国加州Git中心)是用来比较片段支离破碎的离子与复合模式数据库,即PubChem, ChemSpider和KEGG [48]。附加数据库使用包括METLIN(美国加州斯克里普斯研究)和背包(Kanaya实验室,日本)49]。空白含有甲醇的植物提取物和NB细菌内生菌也在相同的条件下分析。比较这两个基地的色谱(从原油中提取和内生植物提取物和控制)允许过滤杂质的生长培养基(45,46]。
3所示。结果与讨论
3.1。从分子和形态的识别细菌内生菌c . macowanii叶子
内生菌独特生物领域增长的居住环境。他们的分离和鉴定为进一步勘探至关重要49,50]。在这项研究中,总共有9细菌内生菌分离和叶子的特征c . macowanii。见表1。
7革兰氏阴性细菌观察。内生植物的表型多样性导致革兰氏反应和内生菌的菌落形态51],因此不同endosphere,增长率和寄主植物的大小也会影响不同的内寄生的社区(52]。植物的内生社区受到寄主植物的年龄的影响,地理位置和温度等非生物因素52,53]。这可以解释细菌分离内生菌的多样性。
细菌属包括假单胞菌,芽孢杆菌,洋葱被孤立的内生菌从药用植物的叶子54]。这些细菌属药用植物中占主导地位,因为他们帮助宿主植物矿质营养成分和抵御非生物和生物应力55]。爆炸进行搜索的结果16 s rDNA基因序列显示分离内生菌属于细菌属等Raoultella,不动杆菌,假单胞菌、芽孢杆菌、肠杆菌属,节细菌属,见图1。这支持了我们观察到的结果。
假单胞菌是常见的细菌与植物,分离出许多植物物种和组织。他们显示一个积极的影响宿主植物的生长,如减少干旱胁迫和产生植物激素如1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸(ACC)和Indole-3-acetic酸(IAA)和作为生物防治剂(26,49,56,57]。我们隔离TES05A显示,94%相似假单胞菌sp。wb4.4 - 99。内寄生的隔离TES14A显示,83%相似假单胞菌cichoriiPc-Gd-1。内生植物的假单胞菌cichorii从马铃薯品种(孤立58]。隔离TES06A显示99%的相似性假单胞菌putidaPF45。内生植物的假单胞菌putida已分离出芒果果园(59]。隔离TES05B显示,99%相似假单胞菌palleroniana水生生物研究所7234 B。内生植物假单胞菌palleroniana据报道已经从香蕉和孤立解决自由氮、溶解磷酸盐,并产生含铁细胞在体外(60]。
TES02C显示100%的序列的身份不动杆菌guillouiaeOTU-b62。不同的不动杆菌物种已经从马铃薯品种(孤立58]。TES15A隔离显示100%节细菌属pascens段H19。节细菌属种虫害已经隔绝ethnomedicinal植物在印度南部[61年]。芽孢杆菌内生菌从向日葵孤立、土豆和棉花和帮助宿主植物磷酸盐溶解和生长素生产(56]。我们的内寄生的隔离(TES07A和TES07B)显示100%的相似性芽孢杆菌safensisTMV13-3。芽孢杆菌spp。隔离TES02B相似度为62%Raoultella terrigena米5。内生植物的Raoultella ornithinolytica被隔绝mountain-cultivated人参植物(62年]。64%的相似性之间的观察TES10A和隔离肠杆菌属asburiaeE6 - 2。内生植物的肠杆菌属asburiae被隔绝枣椰树和促进植物生长63年]。
我们所知,这是第一次报告的隔离节细菌属pascens和肠杆菌属asburiae从c . macowanii。
3.2。抗菌原油评价细菌内生植物提取物树叶
麦克风(0.0625毫克/毫升)最低的是观察节细菌属pascens粗提物和粗提取物枯草芽孢杆菌,分别。大部分内生菌的粗提取物显示了MIC值低于1.00毫克/毫升。离开原油提取呈现出引人注目的活动对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌见表4。
c . macowanii叶子在传统上被用来净化血液,治疗咳嗽、肾、膀胱疾病在人类和动物,还t治疗咳嗽和腹泻(20.]。这一研究获得的结果表明抑制枯草芽孢杆菌,m . smegmatis和p .寻常的在0.500毫克/毫升,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,和k .肺炎是在0.250毫克/毫升,抑制吗美国epidermidis和铜绿假单胞菌在1.00毫克/毫升和0.125毫克/毫升,和分别。
这些数据提供科学理由ethnomedicinal使用树叶,为抑制细菌疾病的主要病原体的叶子是用来治疗。金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,k .肺炎被最后一个抑制浓度的250μg·毫升−1生物碱如crinine, cherylline crinamidine, 3-O-acetylhamayne, bulbispermine隔绝c . macowanii叶子(64年]。我们所知,本研究是第一个报道从叶粗提物的提取c . macowanii和它的抗菌活性。
植物的栽培获得生物活性化合物导致的缺点,如肆意植物获得生物活性化合物,不同的环境条件会产生低收益率,总合成和半合成挑战由于复杂的结构65年]。许多植物内生微生物产生抗癌,抗菌,抗糖尿病的,杀虫,免疫抑制化合物(66年]。植物在不同的地方可能港内生菌与新颖的天然产物(66年,67年]。
Raoultella ornithinolytica粗提取液有麦克风值从0.250到16毫克/毫升,最显著的抑制观察k .肺炎,大肠杆菌,和m . marinum在浓度为0.500毫克/毫升,铜绿假单胞菌是抑制浓度为0.250毫克/毫升。Microcin基因已经被报道出现Raoultella ornithinolytica(62年)和microcins抗菌肽产生的肠道菌(68年]。这可以解释观察到的结果。不动杆菌guillouiae粗提物显示麦克风的值介于0.500和16毫克/毫升。对粗提物显示活动m . marinum在0.500毫克/毫升。
芽孢杆菌safensis粗提物显示麦克风的值介于0.125和> 16毫克/毫升。对粗提物显示活动枯草芽孢杆菌,m . marinum和大肠杆菌在浓度为0.125毫克/毫升,0.500毫克/毫升,分别和0.250毫克/毫升。原油的内生植物的提取物芽孢杆菌safensis隔绝Ophioglossum reticulatuml .显示抗菌活性金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(69年]。这是在协议与获得的结果。
肠杆菌属asburiae粗提物显示麦克风的值介于0.125和16毫克/毫升。对粗提物显示活动m . smegmatis和大肠杆菌在浓度为0.500毫克/毫升m . marinum和k .肺炎在浓度为0.125 mg / mL。内生植物的粗提取的肠杆菌属asburiae显示抗菌活性对k .肺炎,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,b的仙人掌。肠杆菌属压力(70年)已报告生产抗菌lipopeptides与广泛的活动(71年]。这支持结果。
节细菌属pascens粗提物显示麦克风的值介于0.0625和> 16毫克/毫升。最活跃的抑制是反对枯草芽孢杆菌在0.0625毫克/毫升。对粗提物显示活动金黄色葡萄球菌和大肠aerogenes在浓度为1.00 mg / mL。Arthrobacilin,产生的抗菌化合物节细菌属spp,显示抑制金黄色葡萄球菌(72年,73年]。这可以解释观察到的抗菌活性。
假单胞菌sp.粗提取液显示麦克风的值介于0.0625和> 16毫克/毫升。最活跃的抑制是反对m . marinum在0.0625毫克/毫升。莫匹罗星由假单胞菌菌株被报道具有抗菌活性(74年]。假单胞菌palleroniana粗提物显示麦克风的值介于0.250和> 16毫克/毫升。最活跃的抑制是反对p .寻常的在0.250毫克/毫升。对粗提物显示活动大肠aerogenes和铜绿假单胞菌在浓度为1.00毫克/毫升m . marinum和k .肺炎在浓度为0.500 mg / mL。内生植物的粗提取物假单胞菌palleroniana据报道,抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(50]。Pyoluteorin由假单胞菌palleroniana菌株被报道含有抗菌活性(75年]。假单胞菌putida粗提物显示麦克风的值介于1.00和> 16毫克/毫升。最活跃的抑制是反对铜绿假单胞菌在1.00毫克/毫升。抗生素pyoluteorin、phenazine-1-carboxamide phenazine-1-carboxylic酸产生的假单胞菌putida压力(75年]。这可以解释观察到的抗菌活性。假单胞菌cichorii粗提物显示麦克风的值介于0.125和16毫克/毫升。对粗提物显示活动大肠杆菌和p .寻常的在浓度为1.00毫克/毫升,m . smegmatis和铜绿假单胞菌在浓度为0.125毫克/毫升,枯草芽孢杆菌在0.250毫克/毫升,k .肺炎在0.500毫克/毫升。我们所知,这是第一个报告原油内生植物提取物的抗菌活性假单胞菌cichorii。
因为et al。76年]国家< 0.1毫克/毫升的浓度对原油样品的理想浓度抗感染而[生物77年,78年)建议原油样品浓度为1.00毫克/毫升,≤100μ克/毫升(0.100毫克/毫升)和≤625μg / ml被认为是非常重要的和适度的重要,因此值得注意的最小抑制浓度。严格的端点为抗感染的生物应该设置防止假结果和困惑,考虑提取和测试微生物的敏感性,提取方法和溶剂使用(66年,67年]。
这是观察从原油内生植物提取的结果假单胞菌sp.和节细菌属pascens获得c . macowanii留下了值得注意的抗菌活性与本研究中使用的病原菌和可作为抗菌药物m . marinum和枯草芽孢杆菌分别感染。
3.3。抗癌原油评价细菌内生植物提取物对抵抗癌症细胞系
植物内生微生物产生的次生代谢物作为抗癌药物和显示巨大的潜力在医学和兽医治疗(79年,80年]。抗癌药物紫杉醇和足叶草毒素已经从植物内生微生物分离(81年]。
3.3.1。抗癌原油评价细菌内生植物提取物树叶对A549肺癌细胞
假单胞菌putida和芽孢杆菌safensis原油提取显示细胞减少47%和50%,分别对肺癌细胞浓度达到100μg / mL见图2。
3.3.2。抗癌原油评价细菌内生植物提取物树叶对UMG87胶质母细胞瘤细胞
不动杆菌guillouiae原油提取显示减少了42%的UMG87胶质母细胞瘤细胞浓度为6.25μ克/毫升,节细菌属pascens原油提取显示细胞减少37%浓度的12.5μg / ml见图3。
我们所知,这是第一次报告的抗癌活性c . macowanii离开原油提取。没有观察到值得注意的活动从叶子的原油样品对细胞株用于这项研究。生物活性的化合物,如lycorine漳州水仙碱,crinamine,奥古斯汀,加兰他敏是出现在指出c . macowanii叶子和已报告具有抗癌活性(82年- - - - - -84年]。
我们所知,这是第一次报告的抗癌活性原油内生菌提取物假单胞菌palleroniana,芽孢杆菌safensis,肠杆菌属asburiae,节细菌属pascens,和假单胞菌cichorii。
不动杆菌guillouiae原油内生植物提取是唯一测试样本表现出对UMG87胶质母细胞瘤细胞,抗癌细胞减少31%在100年μ细胞减少为3.13 g / mL和53%μg / mL冒充可能抗癌剂对脑癌。
芽孢杆菌safensis原油提取呈现出引人注目的活动对A549肺癌细胞有50%的细胞减少为100μ克/毫升。原油中提取的芽孢杆菌safensis孤立的从海海绵抗癌活动对HepG2(肝癌),HCT(结肠癌癌),和MCF 7(乳腺癌)85年]。这可以解释观察到的结果,原油内生植物提取物芽孢杆菌safensis可以作为抗癌剂对肺癌。
原油的内生植物的提取肠杆菌属asburiae,假单胞菌sp。节细菌属pascens,假单胞菌palleroniana显示没有值得注意的活动对UMG87胶质母细胞瘤细胞A549肺癌细胞。提取可以测试其他癌症细胞系来确定他们的活动。假单胞菌sp.已知生产抗癌化合物和已报告有活动对许多人类癌症细胞系(86年,87年]。假单胞菌sp.和假单胞菌cichorii显示没有值得注意的活动对UMG87胶质母细胞瘤细胞A549肺癌细胞。假单胞菌palleroniana原油提取显示100细胞减少36%μg / mL对A549肺癌细胞。
原油内生植物提取物假单胞菌putida显示100细胞减少47%μg / mL对A549肺癌细胞。p . putidaTJ151能够产生氟尿嘧啶是生物活性芳族化合物,它是一种抗癌药物59]。L-methioninase,产生的一种酶假单胞菌putida,显示抗癌活性对白血病细胞株,肝脏HepG2,乳房MCF-7,肺癌A549、生物,前列腺癌和结肠HCT116 [88年,89年]。Methioninase从p . putida和5 -氟尿嘧啶抑制肿瘤生长的协同工作,因此观察到的活动(90年]。
原油内生植物提取物Raoultella ornithinolytica显示100细胞减少43%μg / mL对A549肺癌细胞。蛋白质复合体的r . ornithinolytica显示抗癌活性与海拉细胞,人类endometrioid卵巢癌行(写明ATCC crl TOV 112 d - 11731),和人类乳房腺癌行(T47D ECACC 85102201)导致细胞病变效应和减少细胞数(91年,92年]。
原油内生植物提取物的Raoultella ornithinolytica,假单胞菌palleroniana,假单胞菌putida,和芽孢杆菌safensis可以进一步纯化和检测其抗癌的活性与其他类型的癌症细胞系。
3.4。液相色谱四极飞行时间质谱LC-Q-TOF-MS分析
生物活性次生代谢产物的隔离和表征帮助区分新的和已知生物活性次生代谢产物,帮助开发和发现新的药物先导物(93年]。Lycorine, powelline一些被鉴定次生代谢物的粗提物c . macowanii叶子,芽孢杆菌safensis,假单胞菌cichorii,和节细菌属pascens。这些都是显示在表5。
树叶不是已经完成了大量的工作,和我们所知,这是第一次报告的识别叶片的次生代谢物c . macowanii和他们的使用LC-Q-TOF-MS内生菌。内生菌能够产生相似的宿主植物的次生代谢物交换与寄主植物的基因组DNA片段(103年,104年]。这些次生代谢物执行不同的功能,如抗菌、抗癌活性表现在这项研究[105年]。Melicopicine吖啶酮生物碱从叶子中分离出来的Teclea和花椒属植物物种(94年]。一个吖啶酮生物碱melicopicine隔绝Melicope fareana(106年和驱虫剂和抗菌活性107年]。这将解释原油离开的值得注意的抗菌活性提取在这项研究中观察到。
Lycorine之前是一个生物碱分离c . macowanii(108年]。的叶子c . macowanii含有更多的lycorine比灯泡和其他植物部分,如根和花(109年]。原油内生植物的临时演员芽孢杆菌safensis,假单胞菌cichorii,节细菌属pascens显示lycorine的存在,这并不奇怪从寄主植物内生菌次级代谢产物代谢能(104年]。Lycorine报道具有抗菌活性和细胞毒性和抗肿瘤的活动(95年]。这可以解释观察到的抗菌和/或抗癌活性的内生植物提取的原油。
Angustine之前是一个生物碱分离从茜草科植物和马钱科的家庭(110年]。我们所知,angustine首次被发现c . macowanii叶子提取物及其分离内生菌。
Aulicine 3-O-methyl-epimacowine crinine-type生物碱和隔绝Hippeastrum aulicum赫伯特。和Hippeastrum calyptratum赫伯特。(110年,111年]。Evidente和Kornienko [97年]报道这些crinine-type生物碱抗癌的特性。这将证明anti-lung癌症活动的原油芽孢杆菌safensis内生植物提取物。不同的癌症细胞系可用于确定原油的抗癌活性假单胞菌cichorii内生植物提取物。
Crinine-type生物碱crinamidine被孤立的从不同的植物石蒜科家族的113年),也从灯泡,开花的茎,叶和根的文珠兰属macowanii(21]。Crinamidine在整个植物的部分文珠兰属物种(114年]。Powelline是一个生物碱发生在报道c . macowanii(115年)和Ndhlala et al。115年)公布了灯泡的发生。已报告这两个crinine-type生物碱具有抗菌、抗肿瘤、抗癌活性(20.,98年,One hundred.]。这不是惊人的内生菌可以代谢次生化合物从主机(105年)和显示大量的寄主植物的生物活性。
Vasicinol是喹唑啉生物碱Adhatoda zeylanica医生。(117年]。原油内生植物提取物的芽孢杆菌safensis,假单胞菌cichorii,节细菌属pascens显示这个生物碱的存在;这并不奇怪,一些喹唑啉生物碱是由微生物(118年]。Vasicinol可以测试其他耐药病原菌抵御抗菌素耐药性,其抗菌活性报道了耆那教等。99年]。
Brefeldin A是一种真菌代谢物由子囊菌(119年),和我们所知,这是首次被报道在细菌内生菌。Brefeldin被报道具有抗癌活性(101年];不同的癌症细胞系可用于确定其抗癌活性不同的细胞系。
从获得的结果,观察不同保留时间之间的叶子和细菌内生菌样品,即使使用相同的色谱条件。等因素的关联使用的萃取溶剂化合物(120年],极性的变化被分析的样品,和片断的次生代谢物检测(121年],次生代谢产物复合物的形成和提取溶剂用于影响不同保留时间观察,他们创建一个示例矩阵(122年]。
所确定的生物碱lycorine、crinamidine powelline真石蒜科家族的生物碱(120年,124年),这支持获得的结果文珠兰属macowanii这个工厂属于家庭。这些生物碱的可用性会导致过度使用和肆意c . macowanii获得这些生物活性化合物65年,125年]。内生植物的生物勘探孤立的代谢物可以帮助拯救环境自内生菌已报告包含相似的生物活性化合物作为寄主植物(66年,126年),在一些做药用植物被保存和收入产生的生物勘探从内生菌代谢产物127年]。
4所示。结论
这项研究揭示了植物内生细菌的存在和同居的叶子c . macowanii这告诉我们的微生物群落c . macowanii。原油内生植物提取物显示显著的抑制活性对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种。原油提取内生菌(假单胞菌putida和芽孢杆菌safensis)表现出对肺癌有前途的抗癌活性。据确认从内生菌次生代谢产物的生物活性,这数据提出了一种可能性,肆意c . macowanii对其药用价值也将停止。这是一个有望找到药物发现和生物探勘。仍然需要进一步提取从内生菌次生代谢产物。
数据可用性
所有的数据提供了完整的结果部分本文除了细菌内生菌的DNA序列可用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,加入数字为每个内生植物可以在表中找到1的手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
Tendani伊迪丝Sebola CSIR DST-Interbursary被授予奖学金的支持(IBS)奖学金和约翰内斯堡大学的优点为研究生奖学金。作者要感谢瓦尔特·西苏卢植物园植物材料的取样和识别和质量规范的团队Eric Morifi先生,先生Thapelo Mbele,和女士Refilwe Moepya协助的威特沃特斯兰德大学的质谱实验。南非国家研究基金会(NRF)在批准号TTK150713125714资助了收集、分析和解释细菌内生菌的分离和鉴定。南非国家研究基金会(NRF)在批准号114384年资助的抗菌研究的分析和解释。科技部通过人工湿地研究(了解)项目资助的抗癌研究的分析和解释。