文摘

酸水解过程中使用传统方法在高浓度时导致产品有较低的收益率,它需要一个长时间的过程;因此,它变得不那么有效。在这项研究中,我们分析了影响微波预处理和生物乙醇生产从大象草地上cofermentation (狼尾草purpureum)。我们使用原料的组合技术和酸水解利用微波预处理方法象草地上(狼尾草purpureum)作为木质纤维素的材料。其次是cofermentation酿酒酵母ITB-R89和毕赤酵母属stipitisITB-R58生产生物乙醇。最优糖混合物(果糖和木糖)水解产品被cofermentation随后转化为生物乙醇酿酒酵母ITB-R89和p . stipitisITB-R58,进行不同浓度的培养液为5天(48小时)30°C和pH值4.5。大功率液体色谱分析表明,最优培养液浓度能够转换76.15%的糖混合基质(葡萄糖和木糖)10.79 g / L(34.74%的收益率)的生物乙醇为10% (v / v)。乙醇产量的最优速度为0.45 g / L / d,对应于69.48%的发酵效率。

1。介绍

在印尼,化石燃料的国家消费也逐年增加。这一增长是由于人口增长,运输使用增加,工业活动高潮。此外,高燃料需求下降加剧了石油生产能力。因此,目前是一个需要从使用化石燃料的生物燃料(1]。

重要的是,浪费或非食用生物质含量高的材料,如秸秆、草、木、棕榈树和空果串,可以转化为生物乙醇在不影响粮食供应。这样一个非食品物质具有高生物量象草为内容(狼尾草purpureum),它大量存在于热带国家如印度尼西亚。生物量的大象草的形式主要是纤维素(31.5%)、半纤维素(34.3%),和木质素(34.2%)2]。纤维素和半纤维素含量高的大象草使其成为一个优秀的来源为生物乙醇生产原料。

通常,纤维素和半纤维素从大象草可以获得1 - 2小时内去木质素过程涉及孵化的碱性溶液在高温下(120°C以上)(3]。接下来,获得的纤维素和半纤维素转化为简单碳水化合物(D木糖,D葡萄糖,D甘露糖,D半乳糖,l甘露糖)通过酸水解,β(1、4)糖苷键坏了强酸,如H₂所以₄或盐酸。然而,这种原料和水解的过程并非没有限制。当碱性去木质素过程发生在很长一段时间,它可能会导致其它木质纤维素成分转化为次生化合物如木糖醇、琥珀酸、乳酸、糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、甘油,所有这些都可以作为抑制剂在水解的下一阶段4]。此外,加酸水解过程中使用传统方法在高浓度时导致产品有很长一段时间内较低的收益率;因此,这个过程变得不那么有效。另外,剩余的酸可以对环境有负面影响。

为了克服上述使用传统方法的低效率和环境问题,一种新的替代方法是使用微波炉delignify和水解木质纤维素。在这个过程中,基本解决方案使用的浓度低于常规(回流)中使用的方法,较低的温度条件和较短的反应时间。王等人证明过程使用微波脱木素(base-catalyzed过程)是更有效的从生物质比传统方法提高木质素的释放。他们也能够分解木质素生物样品中90%通过使用离子液体(醋酸1-ethyl-3-methylimidazolium)作为溶剂,这是更有效的过程,比传统的脱木素的释放只有70% - -80%的木质素从木质纤维素组件后回流的生物质16 h (4]。

微波的方法也被应用于酸水解纤维素和半纤维素,淀粉的水解率的葡萄糖增加50 - 100倍,比传统的加热方法(5]。因为使用的酸浓度也降低,这个过程需要更短的生产时间和更环保、经济。

发酵过程,酿酒酵母和发酵单胞菌属mobilis只生产乙醇通常使用葡萄糖,而不是糖,戊糖为原料,因为要么酵母不能代谢戊糖糖。然而,一些酵母等毕赤酵母属stipitis不仅代谢葡萄糖还其他戊糖糖,如木糖生产乙醇。一个限制p . stipitis然而,耐乙醇的水平较低,使cofermentation方法至关重要。Cofermentation coculture是一个过程,通常,酿酒酵母与p . stipitis,其中己糖和戊糖糖逐渐代谢生产乙醇(6]。在这项研究中,我们分析了微波预处理的影响,从大象草cofermentation生物乙醇生产。

2。方法

2.1。化学物质

DNS试剂(Na_2我年代₂O₃氢氧化钠3 5-dinitrosalicylic酸和酒石酸钠钾)和葡萄糖、木糖、H₂所以₄盐酸、氢氧化钠、从默克公司购买。所有使用的化学物质被解析的品位和使用前未经纯化。水的解决方案都是准备和溶解在蒸馏水。

2.2。菌株和文化传媒

从大象草生物乙醇生产原料使用微波预处理方法和稀酸水解,用两株酵母cofermentation紧随其后。p . stipitisITB-R58和酿酒酵母ITB-R89菌株获得的微生物实验室,化学工程系,各种万隆研究所。琼脂板(10.0 g / L酵母提取物,20 g / L蛋白胨,20.0 g / L葡萄糖,和25.0 g / L型细菌的琼脂)和培养液中(5.0 g / L酵母提取物,5.0 g / L蛋白胨,20.0 g / L的混合物木糖和葡萄糖作为碳源)被用于维护文化。发酵培养基(5.0 g / L酵母提取物,5.0 g / L蛋白胨,5.0 g / L KH₂阿宝₄,0.4 g / L MgSO₄h·7₂啊,0.5 g / L NH₄所以₄、水解葡萄糖18.71 g / L和13.61 g / L木糖水解液)是用于生产生物乙醇。

2.3。培养条件

的增长曲线p . stipitisITB-R58和酿酒酵母ITB-R89菌株测定的方法Arnata [7]。一个殖民地起动器上的每个物种生长培养基(0.5% (w / v)蛋白胨,1.0% (w / v)酵母提取物,和2% (w / v)葡萄糖和木糖),其次是孵化在37°C一夜之间剧烈的晃动(150 rpm)。在生长曲线实验之前,0.1%的文化被转移到生产中、在同等条件下孵化。酵母的增长文化是监控每天通过测量光密度(OD)在600海里。

2.4。样品制备、原料和稀酸水解的大象草使用微波预处理方法

最初,大象的木质纤维素含量草决心根据Surajit的方法(8]。1克样品的数量150毫升H₂O回流2小时在100°C。剩余样本被干回流2小时和150毫升0.5 H₂所以₄在100°C。样品的残留,干是沉浸在10毫升72% (v / v) H₂所以₄溶液在室温下4小时,然后稀释至0.5 H₂所以₄在100°C,随后回流2小时,然后晒干。残渣过滤,用软化水中性。残留物干在烤箱温度为105°C,直到重量是恒定的,随后体重(体重d)。随后,残留物被熏的火山灰和体重(体重e)。木质纤维素的组成部分的构成大象草样品确定使用以下计算(8]: 与一个是初始重量的干粉末象草为样本;b后干样品残渣的重量与热水回流;c回流后残留样品的重量为0.5 M H₂所以₄;d样品处理后残留的重量72% (v / v) H₂所以₄解决方案;和e是火山灰样本残留的重量。

大象草之前洗净晾干隔夜切成1厘米长的段。随后,草在烤箱混合和干4 h 60°C。草地上粉就已筛获得100 -网粉。粉的特点是使用扫描电子显微镜(SEM)(地产- 6510 - la)。

去木质素的方法执行根据,Chen等人提出的用细微的修改(5),特别是在这项研究中使用微波去木质素的过程。总共已筛粉20克是放置在一个500毫升玻璃烧杯和悬浮在300毫升的2% (w / v)氢氧化钠溶液。暂停是放置在一个微波反应器SINEO MAS II,紧随其后的是加热在400 W微波辐射功率为30分钟90°C。加热混合物随后被过滤,用热水洗净,用酸中和。由此产生的粉干,粉末的表面形态进行了分析使用SEM。

随后,大象草粉末原料的过程(±10 g)水解了H₂所以₄解决方案(250毫升)和辐照SINEO MAS II微波反应器的辐照功率400 W 95°C (9]。优化条件下的微波水解delignified大象草粉末在这项研究中进行如表所示1。

水解产品过滤,随后中和。固体产品进一步以扫描电镜表面拓扑结构。解决方案的还原糖含量测定用DNS方法使用Biochrom天秤座S70紫外可见分光光度计,木糖的内容是由高效液相色谱法(HPLC)使用一个惠普Aminex 87 h列(0.6 - -0.8毫升/分钟的流量,列温度为75°C)。

2.5。Cofermentation生物乙醇生产的过程

Cofermentation糖的混合物的过程执行Yadav et al .,轻微的修改,使用p . stipitisITB-R58和酿酒酵母ITB-R89文化(10]。水解发酵培养基添加到解决方案,其次是高压灭菌15分钟在120°C。酵母文化都被转移到无菌发酵培养基和厌氧孵化30°C。介质的pH值调整到4.5通过添加氢氧化钠或盐酸2.0解决方案。评估培养液浓度对生物乙醇生产、细胞浓度是不同的(即。,5.0%;10.0%和20.0% (v / v))在cofermentation过程。剩余的葡萄糖、木糖和乙酸测定高效液相色谱法(6]。记录每一个5天的数据。

3所示。结果与讨论

3.1。形态学的大象草之前和之后的治疗

大象草,在这项研究中,使用的木质生物质含有纤维素,半纤维素,木质素作为其主要组件(11]。然而,它的成分变化显著,这取决于品种、气候和土壤肥力。理解它的化学成分是重要的发展中有效的预处理方法解构其刚性结构和选择适当的微生物将糖转化为乙醇。因此,草的结构性碳水化合物含量测定治疗前后通过监测草的表面形态和通过测量化学内容的草。

草的表面形态如图1。结果显示,草粉末的表面形态紧凑,刚性和酸水解前脱木素(图1(a))。治疗也解除了对纤维素乙酰和其他酸性替换,保护纤维素。扫描电镜结果显示,粉草(图后脱木素被打破了1(b))。草粉末的表面形态和酸水解处理后脱木素进行了更重要的损伤,表明治疗都成功地降解木质纤维素的部分的草粉末(图1(c))。

去木质素过程使用氢氧化钠结合微波预处理技术帮助降解并释放木质素与纤维素和半纤维素材料。这是因为木质素不是一个糖基聚合物,不能用作生物乙醇生产原料通过微生物发酵,抑制微生物的生长和发酵过程4]。此外,治疗去除乙酰和其他酸性替换半纤维素,通过多种纤维素酶保护免受攻击纤维素。扫描电镜结果显示,草粉末原料后被打破了,如图1(b)。此外,酸水解后需要去木质素降解β1,4-glycosidic线性葡聚糖链纤维素或债券β4-D-pyranosyl连杆的异构的半纤维素多糖单体糖,如葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖。

3.2。草化学成分的粉末

结果表明,纤维素含量使用碱性脱木素后微波预处理技术(43.6%)高于技术常用的碱性脱木素(37.1%)(表2)。

我们的研究结果表明,利用微波预处理技术碱性脱木素后的纤维素含量(43.6%)高于技术获得使用通常的碱性脱木素(37.1%),以及结合热碱性脱木素(31.2%,研究了艾丽亚娜一直et al。3])。这一研究获得的高水平的纤维素含量与微波预处理过程表明,碱性脱木素技术成功地破坏了结构的木质素和碳水化合物之间的联系和自由纤维素释放到解决方案。然而,纤维素和半纤维素含量降低酸水解后,随着这个过程也分解纤维素的糖苷键或δ1,4-D-pyranosyl连杆的半纤维素,产生其单糖。Yadaf等人报道,传统酸水解的100.0 g大象草产生48.06克纤维素(10]。与此同时,在我们的研究中,100.0 g的大象草导致52.6克的纤维素。Bjorling Lindman使用电子束辐照和玉米秸秆的预处理(碱性脱木素12]。他们报告说,葡萄糖产量20%未经处理的样品相比,43%样品接受电子束辐照和氢氧化钠原料。杰弗里斯和金也报道,水解淀粉葡萄糖增加100倍的速度通过使用微波辐射(13]。

上述结果表明,微波预处理技术结合和酸碱性脱木素能够降解纤维素的水解方法有效且高效地与一个较短的反应时间,同时大大降低木质素含量和产品,与传统方法相比(5]。

木质纤维素的发酵玉米胚芽蛋白酶解物比成熟的生物乙醇生产的过程更加困难(例如,从甘蔗汁),因为玉米胚芽蛋白酶解物包含更广泛的抑制化合物。抑制剂成分和浓度依赖不仅木质纤维原料的类型,而且化学与自然的预处理和水解过程14]。此外,玉米胚芽蛋白酶解物纤维素含有己糖和戊糖,而木糖通常是主要从硬木纤维素糖的玉米胚芽蛋白酶解物15]。因此,发酵微生物,用于我们的实验应该能够产生生物乙醇的玉米胚芽蛋白酶解物(包括戊糖)具有高产量和生产力以及对人类是安全的。

3.3。还原糖的浓度后去木质素的过程

3.3.1。水解的大象草粉末没有微波协助

的影响和最优时段在碱性脱木素硫酸浓度对酸水解是评估使用DNS方法测定还原糖的浓度产生上述治疗方法。所有的实验没有微波预处理。为每个治疗测试四个条件:1.5,2.0,2.5,和3.0 h时间对脱木素,以及0.5%,2.0%,5.0%,7.0% (v / v)为硫酸浓度。结果呈现在图2,这是基于两个时间实验表示为还原糖的平均浓度(g / L)(表3)。

过程是观察2.5 h脱木素和7.0% (v / v)的硫酸浓度是最好的条件生产9.41 g / L的还原糖大象草粉末。然而,这个结果仍低于先前的结果艾丽亚娜一直et al .,进行方法和常用的脱木素酶法水解纤维素馏分的大象草和34.4 g / L的产生还原糖(3]。因此,在这项研究中,大象草粉末样品的原料过程被酸水解后修改使用微波辐射加热。

3.3.2。水解的大象草粉末通过微波援助

在这项研究中,为了获得更高的收益率的葡萄糖/还原糖,我们修改了预处理过程包括微波预处理技术,采用微波辐照提高反应效率。结果去木质素和水解的大象草粉末通过使用微波辐射加热展示在表4。微波辐照的力量似乎还原糖的量产生显著影响。结果显示,还原糖的浓度随着温度的增加和减少是微波辐射功率(表4)。

根据水解在表的结果2显示使用的硫酸浓度的增加在水解过程中,产生的还原糖浓度增加。然而,它减少了5% (v / v)硫酸浓度、水解时间40分钟,95°C的温度和辐照功率500 W。这种情况是由于一些产品被转换成次生化合物如糠醛和羟甲基糠醛(羟甲基糠醛)16]。最优条件的酸水解大象草结合微波预处理技术为2% (v / v)硫酸浓度为400 W辐照功率30分钟在95°C,产生还原糖的26.63 g / L,对应于66.57%的水解效率。这个结果没有微波治疗高于脱木素,这是只有9.41 g / L的水解效率23.54%3]。还原糖的浓度增加了45.05%而没有微波预处理。这个最优条件也比以前的工作更有效Chen等人曾0.5% (v / v)硫酸浓度900 W微波辐射功率为60分钟121°C,生产11.9 g / L的还原糖5]。

我们的研究结果表明,利用微波预处理技术碱性脱木素后的纤维素含量(43.6%)高于技术获得使用通常的碱性脱木素(37.1%),以及结合热碱性脱木素(31.2%,研究了艾丽亚娜一直et al。3])。这一研究获得的高水平的纤维素含量与微波预处理过程表明,碱性脱木素技术成功地破坏了结构的木质素和碳水化合物之间的联系和自由纤维素释放到解决方案。然而,纤维素和半纤维素含量降低酸水解后,随着这个过程也分解纤维素的糖苷键或δ1,4-D-pyranosyl连杆的半纤维素,产生其单糖。Yadav等人报道,传统酸水解的100.0 g大象草产生48.06克纤维素(10]。与此同时,在我们的研究中,100.0 g的大象草导致52.6克的纤维素。Bjorling Lindman使用电子束辐照和玉米秸秆的预处理(碱性脱木素12]。他们报告说,葡萄糖产量20%未经处理的样品相比,43%样品接受电子束辐照和氢氧化钠原料。杰弗里斯和金也报道,水解淀粉葡萄糖增加100倍的速度通过使用微波辐射(13]。上述结果表明,微波预处理技术结合和酸碱性脱木素能够降解纤维素的水解方法有效且高效地用较短的反应时间,以及大幅降低木质素含量和产品,与传统方法相比(5]。

3.4。文化的发展

确定接种酵母,酵母细胞的培养是评估每一天(图3)。细胞培养是监控和数据记录每日在细胞数量的变化,确定每个培养液的OD。酿酒酵母需要12 h适应中,达到一个最佳的OD 0.706 48 h。60小时后,酿酒酵母进入死亡阶段。与此同时,种植p . stipitis文化导致较慢的细胞密度增加。的指数增长p . stipitis在24小时开始,一直持续到66年小时,0.682小时的最大OD 60。细胞,然后进入死者阶段在84小时。这些结果表明,p . stipitis插入12 h速度比酿酒酵母玉米胚芽蛋白酶解物成大象草。生长曲线测量每小时执行一次,没有重复了4天。

3.4.1。剂浓度的影响

确定培养液浓度对生物乙醇生产的影响,连续实验通过改变每个酵母培养液浓度(即。,5%,10%,20% (v / v))在cofermentation过程中进行。高效液相色谱分析的结果的乙醇和乙酸含量在发酵后产品提出了以下数据。

乙醇和乙酸的存在证实了在发酵后产品比较保留时间的乙醇和乙酸标准,如图4和5、乙醇和乙酸浓度计算使用高效液相色谱的色谱数据分析。随后的峰面积数据的乙醇和乙酸被输入到每个乙醇和乙酸标准回归方程来源于线性情节在色谱峰面积与浓度的乙醇和乙酸,如数据所示6和7分别得到乙醇和乙酸的浓度。乙醇的峰面积在发酵后产品的高效液相色谱分析色谱随后输入到乙醇标准回归方程的变量(y)的浓度(x),如下:

类似的计算进行了乙酸的浓度。

葡萄糖和木糖的初始浓度为5%,10%,和20% (v / v)的培养液治疗是16.67和6.04 g / L;17.43和16.31 g / L;分别和18.45和8.45 g / L。初始浓度的葡萄糖和木糖使用直接从大象的预处理过程获得草。OD,剩余的葡萄糖和木糖浓度,生物乙醇和乙酸积累每天观察5天。两个底物浓度降低培养液浓度在cofermentation,如图8。生物乙醇和乙酸的最佳浓度测量显示,5%的培养液浓度(图6(一))产生5.26 g / L生物乙醇和2.24 g / L醋酸cofermentation 48 h,和这两个产品的浓度cofermentation 72 h后下降。在这种情况下,生物乙醇产量为23%,最高的生产力的速度每天0.2 g / L。发酵效率达到34.41%的速度和基质转换效率56.38%。此外,10%的培养液浓度实验导致了一个最佳的生物乙醇浓度在48 h cofermentation (10.79 g / L,图8 (b)),底物发酵和转换效率的69.48%和76.15%,分别。生物乙醇的浓度开始降低cofermentation 72 h后,表明基质的数量也减少了,而且酵母72小时后进入死亡阶段。与此同时,20% (v / v)培养液浓度实验(图8 (c))显示不同的结果最优生物乙醇浓度,这是13.31 g / L cofermentation 96小时。此外,发酵的效率是66.97%,底物转化率达到92.88%。每个培养液的发酵过程进行了一次5天。

3.4.2。基板和产品参数Cofermentation期间观察到的

在这项研究中,最高的生物乙醇浓度为13.31 g / L,获得96天20% (v / v)培养液浓度。然而,使用材料的有效性和效率,10% (v / v)培养液浓度比其他培养液浓度(表展示了更好的结果5)。乙醇产量(Y_{p / s}可以使用以下公式计算:

面包酵母(酿酒酵母)是最常用的微生物为生物乙醇生产13- - - - - -17]。然而,它不能发酵木糖,因为它缺乏木糖还原酶基因(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH) [13,18]。据报道,酵母可以容忍-18%的乙醇浓度12%和5 g / L未离解的醋酸浓度、最常见的碳环酸玉米胚芽蛋白酶解物中发现。温度的范围从4°C到32°C,酿酒酵母能发酵葡萄糖、蔗糖和棉子糖,表现出一个最佳的活动- 34°C,和不活跃在温度40°C以上pH值约为4.5。乙醇生产后Embden-Meyerhof-Parnas通路(EMP)葡萄糖转化为丙酮酸,丙酮酸是转化为乙醛和有限公司₂,由丙酮酸脱羧酶催化。乙醛然后降低乙醇的乙醇脱氢酶(19]。乙醇产量从己糖发酵最高可达90%。因此,这个选择酵母发酵玉米胚芽蛋白酶解物的象草。

作为OD值增加,底物的量减少,产生的乙醇浓度也增强。图中可以看到8在48小时获得的最佳乙醇浓度为5% 5.26 g / L培养液浓度为10%和10.79 g / L培养液浓度。然而,第一个小时后的浓度降低。然而,浓度下降后,72年和96年小时的发酵过程。这可能是由于衬底的数量明显减少了微生物,已经开始变成死亡的阶段,由乙醇更新或氧化成另一种产品,即乙酸。对比剂浓度为20%,初发酵,产品也产生了醋酸,达到了2.28 g / L,而乙醇没有检测到。然而,在48小时,醋酸的浓度降低,但乙醇浓度增加。当从OD值,可以说,微生物的数量仍在固定相或死和活的微生物平衡;因此,发酵仍有可能持续更长时间,因为在发酵的开始,只有木糖最佳转换,而剩下的葡萄糖水平仍然很高,也就是说。,9.93 g / L。发现在第96小时获得的最佳乙醇浓度为13.31 g / L,而醋酸的浓度降低。因此,发酵过程可以持续更长的时间,所以更多的乙醇产品形成。

生物乙醇生产的主要挑战之一是木糖发酵。密集的努力进行介绍生物体可以使用木糖生产乙醇。因此,在本研究中,我们使用p . stipitis木糖生产乙醇等隐蔽的戊糖糖磷酸戊糖途径。Yadav等人报道,最佳温度是研究°C和pH值约为3.0 - -5.5 (11]。此外,p . stipitis可以适度转化木糖乙醇厌氧或厌氧高产量,例如,0.3 - -0.44 g的木糖乙醇/ g 30°C (20.]。因此,该酵母结合酿酒酵母被用作微生物发酵象草为生产生物乙醇的玉米胚芽蛋白酶解物。

乙醇产量(Y_{p / s})大象草水解液发酵过程,如表所示5成正比,生产率(Lp)和发酵效率(EF)。取得了最佳的效果,当发酵发生在48小时内,达到23.15%;然而,有一个减少72小时和96小时。这种减少是由于其他辅助产品的存在,其中一个是醋酸,正如在图8,从而降低乙醇生产醋酸的浓度增加为72和96小时。

之前的研究使用coculture从稻草玉米胚芽蛋白酶解物的生物乙醇生产酿酒酵母和p . stipitis实现生物乙醇的浓度12 g / L,效率值为0.33 g / L / d和发酵效率高达95% (11]。Kosasih也报道了生物乙醇浓度从空手掌群玉米胚芽蛋白酶解物使用酿酒酵母- - - - - -p . stipitis和酿酒酵母- - - - - -克鲁维酵母菌属marxianus为9.67%,生产力的速度为0.08 g / L / d (21]。在目前的研究中,生物乙醇浓度达到最高为13.31 g / L, 96天,用20% (v / v)培养液浓度。

4所示。结论

在这项研究中,使用碱性脱木素后的生物质内容微波酸水解技术是纤维素的47.4%,24.3%的半纤维素,木质素的10.8%,和10.7%的灰,在下列最佳条件:H的浓度₂所以₄,2%;温度、95°C;微波辐射功率400 W;水解时间,30分钟。还原糖含量为26.63 g / L,表明66.57%的水解效率。血糖水平升高了45.05%而无助的微波辐射过程。最优时间的增长酿酒酵母ITB-R89和p . stipitis分别ITB-R58在48小时60。探讨最佳的糖混合物水解产品(果糖和木糖),由cofermentation随后转化为生物乙醇,培养液的浓度为5天(48小时)在不同温度30°C和pH值为4.5。高效液相色谱分析显示,10% (v / v)培养液浓度转换的最佳浓度为76.15%的糖混合基质(葡萄糖和木糖)为10.79 g / L(34.74%的收益率)的生物乙醇和乙醇生产效率的最优率0.45 g / L / d与69.48%的发酵效率。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

确认

作者目前最好的感谢东帝汶和万隆理工大学促进这项研究。