Supershed大肠杆菌O157: H7潜力增加了持久性Rectoanal结鳞状上皮细胞和抗生素耐药性

文摘

Supershedding牲畜棚大肠杆菌O157: H7 (O157)≥10⁴菌落/ g粪便。最近我们证明supershed O157菌株(SS-O157), SS-17, hyperadheres rectoanal结(RAJ)的鳞状上皮(交易所)细胞可能导致SS-O157坚持在这个网站更大的数字,从而增加了粪便O157负载描述supershedding现象。为了验证这是否会签名坚持SS-O157轮廓度,我们测试了附加SS-O157隔离(n= 101;每个从不同的交易所细胞粘附试验动物)。SS-17相似,所有101 SS-O157表现出综合的依从性在证交所细胞,与56%附加强烈(> 10细菌/细胞;hyperadherent)和44%附加适度(1 - 10细菌/细胞)。应变类型使用多态放大输入序列(拍)分析分配101 SS-O157 5主要演化支但不是任何主要的基因型。有趣的是,69%的SS-O157隔离与人类爆发O157菌株基于脉冲场凝胶电泳概要文件(CDC PulseNet数据库),分为两个演化支拍区分他们从剩余SS-O157,和在交易所hyperadherent细胞。的一个子集SS-O157隔离(n= 53)代表不同的拍和交易所细胞粘附概要分析了抗生素耐药性(AR)。几个SS-O157(30/53)显示sulfisoxazole阻力,和一个隔离是sulfisoxazole和四环素耐药。最低抑制浓度(MIC)检测证实一些电阻使用Kirby-Bauer磁盘扩散试验观察。每个SS-O157隔离进行至少10基因与AR有关。然而,基因与AR很少是放大直接相关:aac(3)第四在2隔离,南2 3隔离,tetB在一个隔离。整合酶基因,int,与收购integron-based AR /传播,被发现在92%的SS-O157隔离。我们的研究结果表明,SS-O157隔离在牛拉吉可能会持续更长时间,但展览有限公司向临床抗生素的耐药性。

1。介绍

大肠杆菌O157: H7 (O157)是第一个志贺产毒大肠杆菌(STEC)血清型与腹泻带血或出血性结肠炎(HC)和溶血性尿毒症综合征(HUS)在人类1,2]。孤立的36年前,1982年,受污染的汉堡包,导致两国爆发在美国(美国)(3),已经每年涉及估计有63153人患病,2138人住院,在人类中,20人死亡,仅在美国就(4- - - - - -6]。

牛的主要水库和渐近运营商O157,优先殖民的rectoanal结(RAJ) [5]。在美国,O157流行范围从0.2到48.8% 0.2 - 27.8%的奶制品和牛肉(7- - - - - -11]。与脱落增加牲畜棚O157季节性的,在温暖的冬天月和减少脱落(12]。一些动物间歇流大于10⁴O157 CFU / g粪便,称为“supershedders”[12- - - - - -14)与相应O157菌株称为supershed O157 (SS-O157) [13]。STEC生存在农场是有据可查的13,14],supershedder牛增加O157在笔的数量,从而提高群患病率在农场和饲养场15]。Supershedding现象可能影响主机、细菌和/或环境因素(12]。

很少有研究到目前为止在细菌的环境因素与supershedding有关。一项研究相关phage-type PT 21/28,与人类的发病率增加,SS-O157菌株(15- - - - - -17]。亚瑟等人发现,71%的基因多样化的102 SS-O157菌株T的核苷酸的替换在255转移Intimin受体或位置行动基因突变被发现在人类临床分离株(18]。之一,我们最近证明SS-O157应变SS-17 102 SS-O157隔离,hyperadheres(综合,强烈坚持模式)牛rectoanal结(RAJ)鳞状上皮细胞(交易所)使用机制独立于adhesin Intimin,这可能导致SS-O157坚持在这个网站更多的18,19]。序列分析SS-O157应变SS-17确定几个产生的单核苷酸多态性(snp)的毒性和依从性基因如编码nonfimbrial丰富儿童和青少年卫生与发育司,yfaL,toxB(18,19),可能导致增加依从性观察应变。SS-17基因组的比较分析与另一个hyperadherent SS-O157应变SS-52透露167年产生的单核苷酸多态性在不同毒性和依从性基因,将需要进一步的分析确定他们的角色在supershedding20.]。

人类STEC感染的抗生素治疗是目前不主张在美国,一些研究表明,治疗可能加重toxin-related组织损伤和症状的患者(21]。然而,最近的一项研究发现,总的来说这不是抗生素治疗,而抗生素的类型(例如,β内酰胺抗生素)中使用3天的腹泻与溶血尿毒综合症的发展(22]。抗生素如rifaximin、磷霉素、阿奇霉素和meropenem被发现没有从O157刺激志贺毒素的释放和non-O157菌株体外(23,24]。这些抗生素已经被推荐用于治疗早期STEC疾病预防溶血性尿毒综合征(25- - - - - -27]。然而,抵抗抗生素在STEC可能混淆追求这些选项。抗生素耐药性(AR) STEC隔离变化大大取决于宿主物种(动物和人类)和源隔离28,29日),但发生率低至6%(从牲畜粪便)(30.)高达58%(乳制品)31日已报告。同时,耐药STEC已经从小腿粪便分离(32)、牛肉和乳制品(31日]。质粒携带整合子,gene-capture系统中,扮演着重要的角色在收购/抗菌素耐药性基因的传播和被发现在几个O157 non-O157 STEC [32]。考虑到SS-O157坚持牛主机,他们暴露在肠道内的其他细菌一样的选择压力允许增加收购/ AR的传播。虽然是没有使用抗生素清理STEC牛,可能有间接的影响与AR基因STEC的传播到其他细菌和自SS-O157隔离增加O157环境中的负载(13,15- - - - - -17),他们也可以帮忙增加抗生素耐药性的传播。

表型特征的基于“增大化现实”技术在细菌隔离可以确定这两个定性,使用抗生素敏感性测试(AST)和定量,使用最低抑制浓度(MIC)测试中,这两种都是基于Kirby-Bauer磁盘扩散法(33]。重要的是要知道患病率(AST)以及水平的阻力(MIC)抗生素达到成功治疗细菌感染;临床实验室标准研究所(CLSI)更新和修改AST和麦克风指南通过技术的全球共识的过程,以确保一致性和再现性的结果在不同的实验室,使这些测试普遍适用的工具来确定抗生素耐药性(34,35]。基因型特征的基于“增大化现实”技术在细菌中依赖于演示AR基因在染色体或质粒的存在,聚合酶链反应(PCR)和各种PCR已经成功修改用于检测AR基因的细菌来自人类,动物,或环境(36- - - - - -38]。耐药基因在一个孤立的存在可能会影响抗菌治疗的临床结果。例如,欧洲国家已经使用大环内酯类,如阿奇霉素在STEC治疗人类感染的早期阶段没有任何但志贺毒素诱导表达英里(一个)基因抵抗阿奇霉素可以防止这种疗法的成功应用39]。最常见的基于“增大化现实”技术的基因中观察到STEC隔绝人类,blaTEM-1,箍、strB sul1、sul2 dfrA,春节(A)(40),而福罗、ampC春节(A),检测,和sul1已确定在牛STEC隔离恢复从农场和屠宰场41]。此外,抵抗抗生素氨苄青霉素、庆大霉素、链霉素,sulfisoxazole,四环素,功效与1类整合子的存在(42]。

在这项研究中,我们试图验证(i)如果综合坚持将签名坚持SS-O157轮廓度,(2)如果SS-O157展示AR和AR基因,和(3)如果SS-O157菌株遗传相似度和概要文件证明可以与依从性和/或基于“增大化现实”技术的表型。确定依从性表型,以前描述的18]SS-O157隔离((n从不同的动物)= 101),每个交易所细胞粘附试验进行了测试。此外,我们使用表型(AST和麦克风)和基因型的测试描述AR SS-O157隔离,按照CLSI指南(34),对抗生素的重要人类诊所和之前报道AR基因STEC隔离来自人类和动物,农场,和食物来源(40,41]。四环素抗性基因的存在在SS-O157隔离也是基于他们频繁的患病率调查O157隔离从人类和牛29日]。整合酶基因,int,与integron-based AR收购/传输和粘菌素抵抗编码基因(mcr1,mcr2)吸引了科学界的兴趣(42- - - - - -44),因此,我们旨在确定这些基因的存在在我们组SS-O157隔离。这些数据是很有用的,因为在病原体耐药基因的存在可能影响抗菌治疗的临床结果,使基于“增大化现实”技术的传播环境中或在水库主机。考虑到固有O157菌株之间的遗传变异(45- - - - - -47),我们使用了快速、pcr、多态放大输入序列(48- - - - - -51)输入系统组相关基因SS-O157隔离并寻求相关的表型特征。

2。材料和方法

2.1。菌株

先前孤立SS-O157 (n= 101)被用于这项研究[18]。控制O157菌株包括SS-O157和O157测序,即:SS-17 [19,20.],SS-52 [18),宋- 1266 (k . c .宋博士提供的佛罗里达大学盖恩斯维尔FL), 933年EDL(写明ATCC®43895™)和酒井法子(写明ATCC®baa - 460™)从美国获得类型文化集合(写明ATCC;弗吉尼亚州马纳萨斯),EC4115 (STEC中心,密歇根州立大学东兰辛,MI)。一个non-STEC大肠杆菌(写明ATCC®25922™)作为控制每个CLSI只有在抗生素敏感性测试建议(34]。

二十个通用的牛大肠杆菌(non-O157)从收集的粪便样本中分离出五个健康,nonchallenged、控制奶牛参加另一项研究(NADC机构动物保健和使用委员会协议# ars - 2016 - 480)。粪便样本(1 g)在10毫升trypticase接种大豆肉汤(Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西)和孵化在37°C 18 h。隔夜粪便文化被镀(100μL) MacConkey琼脂板,每样例和四个随机选择粉红色的殖民地,每个从不同的板块,并确认大肠杆菌通过革兰氏染色法,增长CHROMagar™大肠杆菌(DRG International Inc .,斯普林菲尔德,新泽西),使用分析和生化测试剖面指数API 20 e测试条(生态区'rieux Inc .、杜伦、数控)。四个大肠杆菌隔离/粪便样本选择覆盖任何之间的遗传变异性大肠杆菌从同一动物隔离。所有20牛大肠杆菌O157和六个non-O157 STEC隔离测试(O26、O45 O103, O111, O121,和O145)抗原使用乳胶凝集试验(Oxoid /热科学的皮尔斯,洛根,UT)。

选择SS-O157隔离(n= 53)代表不同的拍和证交所细胞粘附的概要文件是用于AST化验和AR基因PCR,如下所述,确定他们的表型和遗传抗生素耐药性资料,如下所述。所有隔离抗耐药(R)或中级(I)在AST化验证实了麦克风测试。6控制O157菌株和20牛大肠杆菌也用于这些化验。PCR测序紧随其后是为了确定AR基因的存在。

2.2。基于多态放大输入序列(拍)SS-O157的类型和分类

每个殖民地溶解产物测试一式三份确认生成的配置文件如前所述[49- - - - - -51]。简而言之,底漆对目标8多态XbaI - 7多态Avr的II-restriction酶网站,和四个毒力基因编码志贺毒素1和2 (Stx1,Stx2),Intimin -γ(运算单元)和hemolysin-A (他)被用来生成扩增子的殖民地溶解产物在炎热的开始,降落PCR反应(49- - - - - -51]。PCR反应放大Avr的第二使用QIAquick PCR -限制性内切酶位点净化净化设备(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和消化Avr的II-restriction酶(新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)确认限制网站的存在。

未加权的两组方法与运算手段(UPGMA)算法被用来创建基于拍概要文件系统树图的SS-O157 (n= 101)使用分子进化遗传学分析软件版本7(大型7.0;http://www.megasoftware.net/)。每个扩增子的存在与否是用于编码和创建系统树图如下:没有扩增子(评分,0)扩增子的存在(得分,1)和附加的一个功能AvrII网站(得分,2)。同样的评分模式是用来表示拍数据图形化最小生成树使用PHYLOViZ软件(http://www/phyloviz.net/),描述如下。

2.3。依从性分析

坚持化验,菌株在杜尔贝科修改鹰的培养基培养低葡萄糖,DMEM-LG(表达载体,卡尔斯巴德,CA) 37°C没有曝气,洗,resuspended DMEM没有葡萄糖(DMEM-NG;英杰公司)如前所述19,52]。确定细菌分离株的依从性模式在真核细胞,两个坚持化验使用两种不同类型的细胞进行,遵循标准化的协议(19,52- - - - - -56]:

2.3.1。Rectoanal结鳞状上皮(交易所)细胞试验

该交易所试验得到了4技术和2生物复制。如前所述(52- - - - - -56),证交所rectoanal连接的细胞收集牛纳入国家动物疾病无关的实验中心(NADC,艾姆斯,IA), NADC机构的批准下动物保健和使用委员会和储存在−80°C。证交所细胞悬浮在DMEM-NG最终浓度的10⁵细胞/毫升。每个细菌分离与交易所细胞混合细菌°:10°细胞比率:1。曝气的混合是在37°C的环境(110 rpm) 4 h,颗粒状,洗,并在100年重组μ重蒸馏的水(dH的l₂暂停(2 O)。滴μl)放在Polysine幻灯片(热科学/皮尔斯,罗克福德,IL),干,固定和染色fluorescence-tagged针对O157抗原的抗体和交易所的细胞角蛋白细胞如前所述52- - - - - -56]。坚持交易所细胞定性记录为扩散模式,综合,或不依从定量的百分比低于细胞有或没有遵循细菌(55];坚持记录时强烈附着(hyperadherent)超过50%的细胞有10附着细菌,适度附着在50%或更少的证交所细胞5到10附着细菌,不依从,不到50%的比例只有1到5附着细菌细胞。证交所与不添加细菌细胞受到试验过程和作为负控制确认没有既存O157细菌。

2.3.2。HEp-2细胞粘附试验

坚持模式显示在HEp-2菌株细胞(人类表皮样癌喉与海拉细胞污染)(写明ATCC®CCL-23™)测定使用相同的生长条件与交易所使用的依从性分析,如前所述19,52- - - - - -56]。Hep-2依从性试验进行了有两个生物复制技术和2 /菌株。除了控制压力,只有53/101 SS-O157隔离代表所有主要演化支拍和交易所细胞粘附配置文件进行了测试分析。幻灯片是沾fluorescence-tagged目标O157抗原和抗体HEp-2细胞肌动蛋白细丝像前面描述的那样52,55)和定性、定量记录如上表示。

2.4。抗生素敏感性测试(AST)

53 SS-O157隔离选择根据他们的拍和细胞粘附的概要文件,代表所有的演化支最大的遗传多样性和不同表型的坚持。相比之下,六个控制O157 (SS17、SS52 jeong - 1266, EDL933,酒井法子,和EC4115)菌株和20牛大肠杆菌隔离也包括在内。所有隔离检测抗17临床相关抗生素Kirby-Bauer磁盘扩散法根据临床和实验室标准协会(CLSI)指南34)(表S1)。简而言之,纯化细菌菌落(3- - - - - -5]在trypticase接种大豆肉汤(TSB;正欲/热费希尔科学,罗克福德,IL)达到0.5∼的麦克法兰浊度(浓度∼10⁵CFU /毫升)。培养液是spread-plated到Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)(正/热费希尔科学)板用无菌棉拭子(热费希尔科学)。15分钟内接种、抗生素光盘被分发到尼古拉斯板使用自动盘式分配器(正/热费希尔科学)。盘子被孵化的37°C 16 h和隔离被列为敏感(S),中间耐药(I),或耐药(R)基于区域的直径每盘(图的抑制S1)和解释从CLSI标准手册(34]。以下抗生素使用光盘:氨苄西林(10μg),阿莫西林/克拉维酸(20/10μ阿奇霉素(15克)μg)、头孢西丁(30μCeftiofur(30克)μg),头孢曲松(30μg)、环丙沙星(5μ氯霉素(30克)μ粘菌素(10 g)μ磷霉素(200克)μg)、庆大霉素(10μ萘啶酸(30克)μg)、多粘菌素B (300 IU),链霉素(10μg), Sulfisoxazole(0.25毫克),磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶(23.75/1.25μg),四环素(30μg)(正/热费希尔科学)。CLSI推荐参考菌株对抗生素敏感性测试,大肠杆菌(写明ATCC®25922™),用于验证试验条件和质量的抗生素(34]。

AST的SS-O157隔离是图形表示为最小生成树的N位点变异0,单独或结合拍概要文件,使用PHYLOViZ 2.0软件(http://www/phyloviz.net/),通过将与每个抗生素获得的结果转换为分数如下:耐药(评分,0),中间耐药(得分,1),和敏感(得分,2)。

2.5。最低抑制浓度(MIC)测试

所有细菌分离株(53 SS-O157 6控制O157和20牛大肠杆菌intermediate-resistant和耐AST表型选择对各自的抗生素使用麦克风话筒测试条(基线测试®,生物群落'rieux Inc . Durham NC)。因此,隔离测试麦克风对11个抗生素,为每个抗生素一式三份(结果表示为平均麦克风μg / mL),基于CLSI指南(34)(表S2)。简单,四个纯化细菌菌落接种在trypticase大豆肉汤(TSB;正欲/热费希尔科学,罗克福德,IL)达到0.5∼的麦克法兰浊度(浓度、∼10⁵CFU /毫升)。培养液是spread-plated到Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)(正/热费希尔科学)板用无菌棉签(热费希尔科学)。15分钟内接种,麦克风条(基线测试®)被放置到尼古拉斯的盘子。盘子被孵化的37°C 16 h和麦克风(μg / mL),对应的椭圆区域抑制地带(图S1),直接读条。大肠杆菌(写明ATCC®25922™)被用作控制验证试验条件和抗生素的质量(34]。

2.6。抗生素耐药性的PCR筛选和序列分析,整合酶,志贺毒素基因

2.6.1。PCR筛选

所有细菌分离株(53 SS-O157 6控制O157和20牛大肠杆菌31)PCR筛选的基因直接或间接相关的基于“增大化现实”技术,整合酶(int)、粘菌素电阻(mcr-1, mcr-2),志贺toxin-1 (stx1)和2 (stx2)基因。殖民地溶解产物准备从孤立的细菌菌落trypticase大豆琼脂(TSA;正欲Difco,迪金森,火花,MD)作为一个模板。有针对性的引物生成使用Primer-BLAST软件(57]或来自其他研究如表所示S3。每个殖民地溶解产物进行了测试与个别引物对。PCR进行9700年ABI GeneAmp PCR热循环(应用生物系统公司,培育城市,CA)使用10μ200年殖民地溶解产物l pmol每个引物,800年μM deoxynucleoside三磷酸腺苷,1 x稀释的前女友Taq酶缓冲区,和2.5 U(豆类的前女友TaqDNA聚合酶(豆类生物公司,山景,CA)。热启动PCR技术采用结合降落PCR (58)跨越60°C的退火温度范围- 40°C最初20周期。然后,另一组放大段15周期使用40°C作为最终退火温度。放大产品解决在1%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色和可视化紫外凝胶医生系统(Bio-Rad大力神,CA)。

2.6.2。测序

PCR扩增子使用QIAquick凝胶的凝胶中提取和纯化提取工具包(美国试剂盒)和使用应用生物系统公司测序BigDye v3.1终结者化学ABI 3130 xl仪器感染性细菌性疾病研究单位(基因组学中心),NADC,埃姆斯。每个PCR产物测序使用正向和反向PCR引物(表S3)。核苷酸序列分析使用EditSeq™版本14.0.0和MegAlign Pro™14.0.0 (DNASTAR®麦迪逊,WI)并与序列可用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi(59,60]。达成共识序列生成使用正向顺序和反补的反向序列分析与之前报道的基因同源性/身份之前在NCBI数据库中使用核苷酸基本的局部比对搜索工具(BLASTn) [60]。PCR /扩增子对应的产品mcr-1引物(短期和完整)后观察PCR从11个细菌隔离被测序分析。

的Stx2基因被发现在四个牛大肠杆菌分离从一个动物(动物# 887)放大Stx2基因和这些序列进行比较Stx2序列从控制O157菌株。总的来说,我们测序10Stx2扩增子和基因序列对齐使用Clustal W前进行系统发育分析使用MEGA7 [59]。系统发育分析(邻居加入树)stx2序列,基因之间的距离(进化趋异)和速度变化的网站进行了分析使用统计方法和最大似然Jukes-Cantor核苷酸替换模型与伽马分布(JC + G模型,形状参数= 0.5)。组名(SS O157、控制O157和大肠杆菌)被添加到序列指定原点。的最大似然序列的系统发育树构建使用JC + G模型和1000引导程序复制。

3所示。结果

3.1。多态放大输入序列(拍)分类101 SS-O157隔离成五个不同的演化支

拍的遗传多样性分析验证SS-O157隔离测试(n= 101,表S4)。dendogram生成大型7.0软件,基于拍档案,分类SS-O157隔离成五个演化支,进化枝1,2和3组成35岁,分别为33岁和30隔离(图1、表S4)。亚瑟等人101年的研究发现36 SS-O157有相同的脉冲场凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现)模式作为O157与人类爆发的疾病控制和预防中心(CDC)和存储在脉冲净数据基础18,61年,62年]。在我们的分析中,SS-O157拥有相同但是脉冲场凝胶电泳的出现模式作为人类疫情的菌株(34/36,94%)受到限制主要演化支(图1和21)反映他们可能区别于其他SS-O157隔离即使所有SS-O157隔离动物/牛的起源和本质上是克隆的48,63年]。

3.2。所有SS-O157演示了一个综合的依从性在交易所细胞相比HEp-2细胞表型

来确定一个共同的依从性表型有助于SS-O157棚的大量牛隔离在交易所和HEp-2细胞评估依从性分析(52- - - - - -56]。SS-O157测试(n= 101),54%证明aggregative-strong或hyperadherent(> 50%低于细胞> 10细菌/细胞)依从性表型和44% aggregative-moderate(> 50%低于细菌细胞5 - 10 /细胞)在交易所细胞(表S5,图2)。尽管并不是所有SS-O157隔离hyperadherent他们集体共享的综合依从性表型比例细胞(表S5,图2)。然而,hyperadherent特征可能有助于增加SS-O157在牛的持久性。有趣的是,36的SS-O157但是脉冲场凝胶电泳的出现与人类爆发菌株的概要文件(CDC PulseNet数据库;hyperadherent 18), 69%(25/36), 31%(11/36)在他们aggregative-moderate坚持证交所细胞。此前报道,HEp-2细胞粘附试验的结果没有提供任何见解的微分坚持功能SS-O157,确认这些nongastrointestinal细胞不能反映真正的细菌宿主相互作用可能发生在胃肠道(GIT)的人类或牲畜(19,52- - - - - -56]。SS-O157隔离(n= 53)测试,89%(47/53)表现出diffuse-moderate依从性表型看到大多数O157隔离(19,49- - - - - -53)和11%(6/53)在HEp-2不依从细胞(表S6,图2)。

控制株显示出类似的主机特定的依从性资料。五个六个控制O157 (SS17、SS52 jeong - 1266, EDL933,和EC4115)菌株表现出综合依从性对证交所细胞除了一个应变(酒井法子)粘在扩散模式(表S5)。然而,所有六株坚持HEp2细胞扩散的方式(表S6)。

3.3。SS-O157演示不同易感性17抗生素使用抗生素敏感性测试评估(AST)

AST的53 SS-O157隔离测试试验,57%(30/53)耐sulfisoxazole (0.25μg),一个隔离,C104耐sulfisoxazole (0.25μg)和四环素(30μg)(表S7)。同时,89%(47/53),69%(37/53),26%(14/53),22%(12/53),9%(5/53)的隔离中间抵抗阿奇霉素(AZM-15),链霉素(S-10),氯霉素(正在)ceftiofur (XNL-30)和四环素(TE-30)(表S7)。6控制O157菌株的抗菌谱表示电阻在50%(3/6)和50%(3/6)的接触电阻阿奇霉素(表压力S8)。中间电阻也在50岁,83年,66年,50岁,50%的菌株对控制sulfisoxazole (G-25),氯霉素(正在),四环素(TE-30),链霉素(S-10)和头孢西丁(FOX-30),分别为(表S8)。

的牛大肠杆菌隔离(n= 20)还演示了不同易感性17抗生素检测40岁,30日,15日,和15%的大肠杆菌耐sulfisoxazole、四环素、氯霉素、链霉素、分别(表S9)。牛的抗菌谱大肠杆菌菌株表示5%的隔离是耐庆大霉素和阿奇霉素。中间电阻在75年发现,40岁,25岁和25%的隔离对链霉素、四环素、阿莫西林/克拉维酸和氨苄青霉素(表S6和S9)。

最小生成树(MST) SS-O157 AST的分析数据产生6节点与主要的节点包括12隔离(C-18、C-23 C-28, C-31, C-34, C-36, C-39, C-42, C-53, C-54, c - 73 c - 78)共享同一AST概要(图3(一个))。然而,集成AST的拍概要数据在生成MST没有产生任何特定的AST拍的相关性,表明系统没有规定抗生素resistance-susceptibility SS-O157(图3 (b))。

3.4。最低抑制浓度(MIC)测试可靠地验证AST的结果

细菌分离株(O157 SS-O157,控制,和牛大肠杆菌),中间AST表型耐药(I)显示低水平的麦克风(μg / mL)各自的抗生素;麦克风(μg / mL)是小于或等于“敏感范围阈值”(表1)。例如,麦克风(μg / mL)在“敏感范围阈值”六个抗生素(阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢西丁、头孢噻肟/ ceftiofur,庆大霉素,和萘啶酸)在所有隔离测试(表1)。

一个牛大肠杆菌隔离(912 - 4)在“耐药范围”麦克风阿奇霉素(≥8μg / mL), sulfisoxazole (≥512μg / mL),四环素(≥16μ抗g / mL)对应(R) AST表型观察到相同的隔离(表1)。同样,与抗耐药(R) /中间隔离(I) AST表型与氯霉素(870 - 2)和链霉素(870 - 2,c - 104)麦克风上方阻力阈值(表1)。此外,三牛大肠杆菌(870 - 2、888 - 2、912 - 1)和三个SS-O157 (c - 66 c - 87 c - 104)隔离了麦克风sulfisoxazole“耐药范围”,对应于耐药(R) AST表型(表1)。然而,一些孤立的没有显示高麦克风sulfisoxazole即使他们中间耐(jeong - 1266, SS-52 EDL933 914 - 3, c - 2, c - 5, c13,碳14)或耐药(酒井法子,888 - 4、912 - 2,c - 4, C-11,技术,C-18, C-22, C-38,四十五,C-49, c - 80 c - 85 c - 88 c - 90 c - 99) AST表型(表1)。这种差异的原因尚不清楚,然而,鉴于麦克风结果重现的方式完成后一式三份使它比AST分析更可靠,抗生素可以容易批次差异磁盘和人为错误(64年]。

3.5。基于“增大化现实”技术的相关基因从SS-O157放大,控制O157和牛大肠杆菌隔离

18/31基因放大至少在一个ss - 0157菌株。每一个测试隔离> = 10基因的八个基因(acrB, ais、arnA吗咖能够,mdtH yfbH, yjcP,和yjcR)在场所有的隔离测试(表吗2和S10)。基于“增大化现实”技术的特定基因中发现SS-O157菌株aac(3)第四(2隔离:C7、人私下偷偷收藏盒式),南2(3隔离:C5、C99 C104),和tetB(1隔离:C104)(表2和S8)。总的来说,九个不同PCR概要文件基于基因的存在与AR 53 SS-O157隔离(表中被识别2)。此外,int扮演一个角色在水平基因传播放大从48/53 (91%)SS-O157(表2和S10)。

一种类型的PCR概要,包括14与AR(相关的基因acrB、ais arnA emrA, fsr、玛咖,马拉,mdtH, mdtO, pmrD, rarD, yfbH, yjcP,和yjcR6控制中)普遍O157菌株(表进行测试2和S11)。的int基因存在于所有6控制O157菌株(表2和S9)。同样,12个基因(acrB、ais arnA emrA, fsr、玛咖,mdtH, mdtO, rarD, yfbH, yjcP,和yjcR)在场所有的牛吗大肠杆菌隔离测试和只有一个(888 - 1)包含了多种抗生素耐药性操纵子(耐喹诺酮和四环素)转录因子,玛拉(表3和S12)。链霉素抗性基因(aadA1)在15%的隔离和在场int出现在60%的隔离。多粘菌素B电阻(pmrD)和磺酰胺电阻(sul2)是目前在85%和10%和四环素抗性基因tetA, tetB和tetC20岁的流行在40和25%的牛吗大肠杆菌隔离(表3和S12)。粘菌素耐药性细菌从食品生产的动物正在积极研究[65年),但没有intermediate-resistant或耐AST表型对粘菌素在这项研究和观察mcr1和mcr2基因没有被放大。

3.6。从SS-O157志贺毒素基因放大,控制O157和牛大肠杆菌隔离

引物对针对志贺毒素1和2基因(stx1和stx2)使用(表S3)。的stx1基因从49%放大SS-O157隔离和控制O157菌株酒井法子和EDL933(表S10和S11)。没有一个牛大肠杆菌有stx1基因(表S10)。除了一个隔离,所有SS-O157隔离放大stx2基因(表S10)。所有控制O157菌株和令人惊讶的是四牛大肠杆菌从一个动物(4/20,25%)隔离放大stx2基因(表S11和S12)。SS-O157志贺毒素基因的分离与之前报道的结果(18]。

3.7。测序结果与基于“增大化现实”技术相关的基因

PCR扩增子在两个方向测序和共识序列生成21和9不同的AR基因SS-O157和牛大肠杆菌分别隔离(表向和S14系列)。扩增子目标16 AR基因(ais, acrB arnA emrA, fsr, int,玛咖,马拉,mdtH, mdtO, pmrD, rarD, tetB, yfbH, yjcP,和yjcR后)一直与他们的同系物BLASTn分析(表向)。有趣的是,扩增子的dfrA1、sul1 sul3 tetA基因没有结合各自的同系物(表向)。重新设计tetA引物(表S3)目标的全部长度tetA基因,也未能放大了全身tetA基因从控制O157 SS-O157菌株(数据没有显示)。相比之下,tetA基因扩增身份之前报道的99%tetA基因在BLASTn分析从牛大肠杆菌(表S14系列)。

无论使用的引物组,非特异性扩增子时获得一些隔离放大的mcr -1基因。扩增子的凝胶纯化和基因测序证实身份。结果证实了非特异性扩增,和之前报道没有同源性mcr -1基因(基因库)观察(表向和S14系列)。非特异性扩增可能发生由于低特异性的引物和/或由于基因的存在有一些相似序列mcr -1基因(表向和S14系列)。

3.8。志贺Toxin-2基因测序结果

序列分析(数据S2和S3)表明,stx2牛的基因大肠杆菌隔离是类似的身份(> 97%)stx2基因控制O157菌株(表S15和图S2尽管所有的牛的乳胶凝集试验大肠杆菌(n= 20)对七个主要STEC血清型(O26、O45 O103, O111, O121, O145,和O157)是负面的。遗传距离(进化趋异),基于stx2序列,在牛大肠杆菌,在控制O157和牛之间大肠杆菌和控制O157隔离是0.012、0.006和0.038,分别指示的细微差别stx2序列(表S15,图S2)。邻居加入和最大似然的进化树显示不同的分组和,因此核苷酸序列的差异stx2控制O157和牛之间大肠杆菌隔离(图S3)。

4所示。讨论

在这项研究中,综合遵守交易所细胞被发现的特点所有SS-O157测试隔离hyperadherence示威的54%。SS-O157隔离进行AR基因的最小数量和一些表型耐sulfisoxazole和四环素。每个SS-O157隔离进行至少10基因直接或间接相关的基于“增大化现实”技术,其中八(acrB, ais、arnA吗咖能够,mdtH yfbH, yjcP,和yjcR)是存在于所有的隔离。基于“增大化现实”技术的特定基因中发现SS-O157菌株aac(3)第四在2隔离,南2 3隔离,tetB在一个隔离。先前报道(18),确定使用拍在这项研究中,SS-O157分离株基因多样化,但是没有坚持或者基于“增大化现实”技术的概要文件可以被关联到一个特定的块类型。然而,拍集群能够94%的SS-O157相同但是脉冲场凝胶电泳的出现模式的人类爆发菌株(18成两个演化支,演化支1和2,反映出其可能的区别于其他SS-O157隔离测试。

牛和其他食用动物帮助养活全世界数十亿人,但可以水库的传染性病原体和抗生素耐药性46,65年- - - - - -67年]。已经35年以来第一个与O157食源性疫情报告(3),仍然O157感染的预防和控制继续是一个挑战由于复杂的影响因素O157殖民牛(66年,68年- - - - - -70年)和O157菌株之间的遗传多样性显著,只有一个子集能够引起人类感染(45,47]。广泛使用的细菌指纹识别技术相比,脉冲场凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现;48),多态放大输入序列(拍)是一个简单的,友好的,容易执行和解释方法,利用indels和snp在细菌基因组中确定菌株的遗传多样性50,51]。在这项研究中,我们使用拍分类和易用性评价101 SS-O157隔离。拍分配SS-O157隔离成五个主要演化支,与大多数SS-O157菌株但是脉冲场凝胶电泳的出现人类疫情相关的配置文件(18)被分成两个演化支,进化枝1和2,明确区分他们从其他SS-O157 [49- - - - - -51]。

O157持久性的牛已被证明是可能依赖于细菌细胞的粘附在拉吉(71年]。重大干预策略来减少O157马车和脱落在牛可以由宿主-病原体相互作用的理解rectoanal结(RAJ) [52]。Rectoanal结鳞状上皮(交易所)细胞粘附试验,在牛模仿自然的殖民化过程,已成功用于确定O157的依从性特点,non-O157 STEC,志贺氏杆菌spp。52- - - - - -56]。交易所细胞粘附试验被用来识别一些蛋白质,如外膜蛋白的作用(OmpA) (72年)和curli菌毛(54),在牛的调制O157的殖民化。类似于其他SS-O157菌株(19,20.),101年SS-O157隔离评估本研究综合坚持牛证交所与多数展示hyperadherence细胞;如此强烈的坚持可能导致他们坚持牛。相比之下,SS-O157菌株表现出扩散坚持HEp-2细胞和一些菌株不坚持。这个观察证实了先前的报道,坚持常用non-GIT人类细胞系,HEp-2,不能反映真正的细菌与人类的互动或牛肠细胞(52- - - - - -56,72年这是依赖于宿主的方式。hyperadherent表型观察在交易所细胞69%的牛SS-O157菌株的但是脉冲场凝胶电泳的出现人类爆发模式是相同的大肠杆菌CDC脉冲网上O157菌株数据库(18)建议增加牛RAJ之间可能存在联系的持久性和确保肉/环境的污染导致人类感染(14- - - - - -17]。这些结果强调的重要性低于细胞粘附试验研究O157隔离和强调需要描述因素可能导致O157持久性和脱落的牛。

很难预防或者控制牛STEC脱落,因为普遍流行的63年),存在多种毒力因素(73年],致病性[74年,有效的生存机制75年),和多个影响因素脱落(66年,70年]。人类对STEC抗生素治疗感染的疗效是有争议的27),但抗生素如rifaximin、磷霉素,阿奇霉素,meropenem不刺激志贺毒素的释放STEC被建议用于治疗早期STEC疾病预防溶血性尿毒综合征(23- - - - - -27]。虽然目前还没有支持,广泛的抗生素耐药性STEC孤立从牛76年),环境(77年],和人类[40)可以阻止未来可能使用的抗生素来控制STEC人感染(78年]。此外,尽管抗生素不习惯明显STEC牛、AR基因STEC的存在可以帮忙增加抗生素耐药性的传播环境。几项研究在美国和国外报道耐氨基糖甙类,β-lactams、碳青霉烯头孢菌素、红霉素、phenicols,链霉素,sulpha-drugs,四环素,除了多药耐药性STEC孤立从人类和动物31日,76年,79年- - - - - -82年]。六个荟萃分析的基于“增大化现实”技术的数据控制O157,注释在Pathosystems资源整合中心(帕特里克)生物信息学资源中心(https://www.patricbrc.org;(83年)还表示∼70个基因的存在,直接或间接地与AR有关。这个基因组数据以及AR基因的分析发表在STEC电阻剖面的确定提供了动力SS-O157隔离分析在目前的研究领域。

在我们的研究中,所有的细菌隔离测试不同易感性17抗生素AST试验,与大多数演示sulfisoxazole阻力。电阻对sulfisoxazole检测由AST和麦克风在三SS-O157隔离测试(c - 66 c - 87 c - 104;表1只)和PCR检测sul2基因,这是可变电阻的一部分地区小,nonconjugative质粒肠杆菌科成员造成抗链霉素和sulfisoxazole [84年]。Sulfisoxazole阻力大肠杆菌隔离来自猪的粪便样品和其他食用动物有关sul1、sul2 sul3 dhfr,和dfrA1基因(85年,86年]。在另一项研究中,高麦克风(> 256μ对sulfisoxazole g / mL)沙门氏菌。隔离从零售肉,食用动物,和人类是与抗性基因相关联sul1 sul2,和sul3(87年AST),抗分离测定了高麦克风(μ抗g / mL),而中间隔离有麦克风的易感或中间范围相应的抗生素。AR基因放大一些细菌分离株的基因组DNA测试与应变应变变化在SS-O157和牛大肠杆菌隔离;一套统一的基于“增大化现实”技术的基因被放大在六控制O157菌株。integron-integrase基因,int,与AR收购/传输,SS-O157确定在92%和69%的控制O157和牛大肠杆菌隔离(88年,89年]。因为我们评估只有有限数量的基因与表型相关抵抗相应的抗生素,我们可能错过了其他基因导致相同的一些阻力和缺乏特异性引物可能进一步驳倒这个结果。的mcr-1(短或全长度)基因并不是确定的细菌隔离。SS-O157隔离的AR基因的序列分析显示低或没有同源性与NCBI数据库中之前报道AR基因PCR扩增子从牛大肠杆菌身份分离株同源性很高(> 99%)与之前报道的基于“增大化现实”技术的基因。有趣的是,我们还发现了stx2基因在某些大肠杆菌从牛没有同源隔离stx2在EDL933等人类爆发O157菌株,酒井法子或EC4115表明这些可能变种stx2。自大肠杆菌non-O157并没有与血清凝集针对“六大”STEC血清型O26, O45, O103, O111, O121, O145,这个结果表明,这些不同STEC株需要进一步鉴定。

5。结论

总之,我们的结果表明,SS-O157可能持续更长时间的牛拉杰和港口几个AR基因提供有限的电阻对临床上有用的抗生素。因素综合依从性表型,依从性表型的作用在牛殖民和持久性,和相关的基于“增大化现实”技术的功能相关性基因SS-O157目前被评估。

数据可用性

所有生成的数据或分析在本研究中包括发表的这篇文章(及其补充信息文件)。

信息披露

资助者没有作用的设计研究;收集、分析和解释数据;和写作手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

优秀的技术支持提供的布莱恩·惠勒和艾伦詹森是承认。细致的技术支持也由实验室提供的暑期实习生:阿帕纳Ajjarapu,医学院毕业Anantharam, Raegan霍弗勒,克里斯蒂娜·艾伦和汉娜Mazon在不同阶段的研究。作者承认mcr-1阳性菌株收到Drs / DNA和引物。尼科尔·雷克和希瑟·艾伦FSEPRU NADC,农业研究所/农业部,艾姆斯,IA。动物资源单位是感激地承认提供的援助在证交所细胞的收集终端直肠的牛。这项工作是由USDA-ARS短剑项目5030 - 32000 - 100 - 00 - d和5030 - 32000 - 112 - 00 - d。

补充材料

补充文件包含补充表支持手稿中的结果,在相同的上市,包括以下:表S1:抑制区直径用于确定AST概要文件的控制大肠杆菌(写明ATCC®25922™)和所有细菌隔离测试试验。表S2:确定麦克风(CLSI破发点μg / mL)的控制大肠杆菌(写明ATCC®25922™)和所有细菌隔离测试试验。表S3:引物用于这项研究。表S4:拍SS-O157概要文件(n= 101)隔离。表S5:坚持SS-O157模式(n= 53)O157隔离和控制(n= 6)压力低于细胞。表S6:坚持SS-O157模式(n= 53)O157隔离和控制(n= 6)压力HEp-2细胞。表S7: AST的53 SS-O157隔离对17抗生素。表S8: AST的六个控制O157菌株对抗生素17。表S9: AST的20牛大肠杆菌隔离与17抗生素。表S10:基于“增大化现实”技术和整合酶基因SS-O157概要文件(n= 53)隔离。表S11:基于“增大化现实”技术和整合酶基因控制O157概要文件(n= 6)菌株。表S12:基于“增大化现实”技术和整合酶基因的20牛大肠杆菌隔离。表向:基于“增大化现实”技术和整合酶基因测序结果代表SS-O157隔离。表S14系列:AR基因测序结果代表牛大肠杆菌隔离和控制O157菌株。表S15: Stx2基因序列的估计进化趋异内两组,每组之间的配对。图S1: AST(面板)和麦克风(面板B)测试显示代表SS-O157菌株c - 104对氨苄青霉素和四环素。图S2:核苷酸(A)和(B)氨基酸序列的Stx2基因扩增和测序从六个控制O157和四个牛大肠杆菌隔离。使用ClustalW序列对齐,多重序列比对程序。图S3:邻居加入(A)和最大似然(B) Stx2基因序列的系统发育树从六个控制O157和四个牛大肠杆菌隔离。沿着Stx2基因核苷酸序列的差异可能解释牛之间的细微差别大肠杆菌和控制O157隔离组。(补充材料)

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