在体外和体内丁香抗真菌活性(丁香)及胡椒(Piper初步l．）精油和功能性提取物对尖孢镰刀菌和黑曲霉在番茄（茄属植物lycopersicumL.）

抽象的

本研究采用水蒸气蒸馏法从辣椒(Piper初步丁香和丁香(丁香）和加入氢化物（加入脂肪酸乙酯作为萃取共溶剂）以获得功能性提取物（FES）。通过测定最小抑制浓度（MIC）来评估EOS和Fe的抗真菌活性尖孢镰刀菌和黑曲霉。结果表明辣椒（Piper初步）和丁香（丁香）精油及其功能的提取物是有效的在体外at concentrations from 400 to 500 ppm after 10 days of culturing. The essential oils and functional extracts were used on tomato fruit samples at three different concentrations: 350, 400, and 450 ppm⁵．丁香精油抑制了丁香的生长黑曲霉从50％到70％和尖孢镰刀菌到40％。丁香和胡椒的功能萃取物（FES）与癸酸乙酯混合（FES-C.₁₀)，是保护番茄果实免受两种病原菌侵染的最佳组合。采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对丁香油、柠檬烯、沙宾烯和丁香酚进行了鉴定β-花椒油中的石竹烯。

1.介绍

番茄(茄属植物lycopersicumL.）是全球第二次消耗的蔬菜[1］.番茄是番茄红素、胡萝卜素、抗坏血酸和钾的重要来源[2］.然而，该作物受到多种病原菌引起的多种病害的影响，导致果实产量和品质下降，并造成巨大的经济损失[1，3.］.由尖孢镰刀菌是一种严重的番茄土壤病害[4］.病菌通过根感染来攻击易受感染的植物，然后用菌丝或孢子堵塞维管系统，导致维管和叶子变色，通常导致植物死亡[5，6］.同样的,黑曲霉番茄果实中主要的病原真菌之一是长蠕孢属以上和青霉菌digitatum［7常规农业最突出的替代方案之一是使用植物产品，这些产品已被证明可以控制先前报道的许多植物病原体[7，8］.精油是这些植物产品具有巨大潜力的用于控制植物疾病中的一种，因为它们存在抗菌，抗病毒，抗真菌和杀虫活性8，9］.精油的抗菌活性与它们的生物活性挥发性成分的存在直接相关，如萜化合物(单、倍半和二萜)、醇、酸、酯、环氧化合物、醛、酮、胺、醚和酚[9，10］.精油的抗真菌作用可能归因于他们的能力来破坏细胞壁和细胞膜并凝结细胞质中，因此它们会损坏细胞器和大分子允许逸出[11- - - - - -13］.EOs的亲脂特性允许它们穿过细胞壁，破坏细胞质膜，同时破坏不同层的多糖、脂肪酸和磷脂，最终使它们具有渗透性[14- - - - - -16］.近年来，通过测定被测真菌质膜麦角甾醇含量，报道了EOs的抗真菌作用机制[17］.麦角甾醇是真菌细胞膜负责维持细胞功能和完整性的主要固醇组分。麦角甾醇几乎只发现于真菌，因此广泛用作真菌生物量的一个指标[18］.精油提取的最常见的方法是通过水蒸气蒸馏，尽管石油衍生溶剂也用于纯化来自植物的化合物。然而，后一种方法可因为使用炸药和有毒溶剂的是危险的。一个选择是使用替代的溶剂，也称为绿色溶剂，因为它们不从石油产品衍生的;因此，它们并不像对环境有害。在这些替代溶剂，从植物中提取脂肪酸乙酯正成为一个重要的选择，因为它们的两亲性质和生物降解性的，并且它们也无毒和nonirritable [19］.本作本作的目的是评估精油和夹层功能提取物的抗真菌效应（丁香)及胡椒(Piper初步减轻疼痛的严重性尖孢镰刀菌和黑曲霉番茄枯萎(茄属植物lycopersicum使用一系列的在体外和体内评估。

2.材料和方法

2.1。原料

本研究中使用的植物材料是丁香（丁香)及胡椒(胡椒L.）由墨西哥奇瓦瓦的Comercial Cordona提供。用作共聚液中的脂肪酸乙酯作为共氢化物过程的共溶剂是癸酸乙酯（C_10，CAS号110-38-3，99％，西格玛 - aldrich），乙基未赤烷酸乙酯（C_11，CAS编号627-90-7,99%，Sigma-Aldrich)，十二酸乙酯(C_12，CAS编号106-33-2,99%，Sigma-Aldrich)和十四酸乙酯(C_14，CAS编号124-06-1,99%，Sigma-Aldrich)。隔离的尖孢镰刀菌和黑曲霉在本研究中使用。该菌株是化学科学学院的真菌菌种保藏中心的一部分。

2.2。精油（EOS）和功能性提取物的提取（FES）

丁香(丁香)及胡椒(Piper初步分别采用改进的Schilcher装置进行水蒸馏。在水蒸馏法中，工厂浸泡在水中，系统被加热到水的沸点。共水蒸馏时，加入脂肪酸乙酯作为共溶剂，所得均相混合物称为功能提取物(FEs)。本研究中使用的脂肪酸乙酯为癸酸乙酯(C₁₀， CAS编号110-38-3)，十一酸乙酯(C_11，CAS编号627-90-7)，十二酸乙酯(C_12，CAS号106-33-2），和乙基十四烷ë_14，化学文摘号124 - 06 -(1)。在这个过程中，200克植物材料，4升水，20毫升乙基酯用于丁香和胡椒[20.］.

２.３.精油及功能提取物分析

收集精油和功能性提取物并用体积烧瓶中的己烷稀释;通过GC-MS（气相色谱 - 质谱法）分析所得溶液。The analysis of essential oils and functional extracts was conducted using a gas chromatographic system (Perkin-Elmer Instrument, Auto system XL, USA) equipped with a DB-5 column (5% phenyl methylpolysiloxane, 20 m × 0.1 mm i.d. and 0.4 µm film thickness) and a mass spectrometer (Perkin-Elmer instruments TurboMass Gold) as detector.. The carrier gas was helium, at a flow rate of 1 ml/min. For the GC-FID analysis, the temperature was increased from 60°C to 180°C at 1°C/min. The injector and detector temperature were set at 180°C.

2.3.1。精油对径向生长的影响:最小抑制浓度(MIC)

为了证明个EO和FeS的针对生物活性化合物的功效病圃和一个．尼日尔、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的最终浓度分别为100、200、300、400和500 ppm。对照组用琼脂、乙醇和纯癸酸乙酯、十一酸乙酯、十二酸乙酯和十四酸乙酯制备，浓度为100 ppm。随机安排4个处理重复。为了促进感染，处理过的番茄果实被保存在30°C的黑暗潮湿的室内。径向生长引起的直径尖孢镰刀菌接种10 d后测定黑曲霉含量。

2.4。接种生产

通过培养制备接种物尖孢镰刀菌和黑曲霉在黑暗中在25℃下在PDA上进行培养皿中14天。The conidial suspension was prepared with sterile distilled water and Tween 80 and quantified by a Neubauer chamber to adjust at 1.5 × 10⁵Conidia / ml。

2．5．体内保护试验

为了体内丁香精油(EO)和不同的丁香提取物(FEs)含有不同的酯类。

新鲜健康圆西红柿(番茄大号)，用90%乙醇消毒，用无菌蒸馏水冲洗。用无菌的蛀木虫在番茄果皮上钻一个直径6毫米的洞，然后100μ.L (1.5 × 10⁵分生孢子/mL);然后表皮放回并密封用无菌凡士林（仅在切割，以避免水果氧化的边缘）。一个fter fungal inoculation, tomato fruits were sprayed with EO and FEs at 350, 400, and 450 ppm. Control tomato fruits were sprayed with sterile distilled water-ethanol (2%). Treatments were randomly arranged with three replications. To promote infection, treated tomato fruits were kept in a humid chamber at 28°C in darkness. The diameter of the rotting area caused by尖孢镰刀菌和黑曲霉接种后15天，每天测定。

3.结果与讨论

3．1.植物精油及功能提取物的化学成分

结果表明，通过对每种香料的水蒸馏法和共水蒸馏法的提取率进行比较，丁香的得率高于辣椒。这种行为同样可以在从每个功能性提取物中获得的百分比中观察到。这可以普遍地解释，因为在植物中，精油储存或位于腺体、导管、囊或腺毛或植物的储藏库中;因此，当这些储层暴露在蒸馏蒸汽的作用下时，蒸汽就会软化或打破油腺的壁，释放出油，从而有利于萃取率的提高。11］.色谱分析结果见表1，其示出了丁香和胡椒精油和提取物的功能的主要部件。在丁香提取物，丁香酚被鉴定为多数成分，也存在多数比例(70-85%)。其他测定组分为癸酸乙酯、十一酸乙酯、十二酸乙酯和十四酸乙酯，其百分比占相对组成的4-17%;这些是在共水蒸馏过程中加入的。除上述成分外，还鉴定出乙酸丁香酯(15%)和β石竹烯。这些结果相符埃尔南德斯 - 奥查娅等人。［21和Jirovetz等人[22[WHO报道，除了乙酸烯乙烯酯（2％至7％）之外，还可以含有多达90％的丁香酚，以及亚芳基烯基的存在。在辣椒精油的情况下，确定了柠檬烯的存在（18.8％），Sabinene（16.5％），β石竹烯（15.6％），和β-蒎烯(10%)为主要化合物;此外，另一组化合物以较低的比例测定(见表)2)．这些结果与几位作者的报告一致[23，24]，这些化合物被确定为大多数化合物;然而，他们提到在某些情况下总共存在22种化合物，这与在较低比例下确定的总共8种化合物不同。这种化学成分的差异可能是由于果实的来源，以及不同的生长和/或简单的保存条件。

3.2。真菌识别

尖孢镰刀菌呈指数增长，呈扁平的棉花状，趋向于扩展，如图所示，形成白色气生菌丝1．它可以观察到产生的特征性白色的菌丝体，变成粉红色的鲑鱼;还观察到，白菌落将着色沉淀到培养基中。72小时后，菌落的生长为2厘米。观察到丰富的微生物的显微镜，在横向出现的简单分子梯中产生的细微稀有的微生物;它们呈现略微弯曲的椭圆形素，而且缺乏隔膜。Macroconidia还呈现了一种脚踏板;有些人有三到五个隔膜;三豆瓣孢子更常见。这些结果与纳尔森的研究相匹配[25，其中提到存在三种孢子:大孢子，带有3至5个隔的细长孢子，具有该属的典型形状;小孢子，椭圆形，丰富;和允许区分的衣原体孢子病圃从串珠镰孢［10］.在…的情况下黑曲霉，观察到殖民地最初是白色的，快速增长;但是，菌丝表面覆盖着代表曲霉菌头的黑点覆盖（图1)，直径达1毫米，充满黑色孢子，变成粉末状培养物，形成浓密的直立分生孢子。显微观察结果表明，它是一个单独的分生孢子体，起源于分裂的菌丝;这种气生分生孢子端部为一个扩大的囊泡，囊泡包含双或单突出物;这些是孢子囊，从孢子囊中伸出一个单一的，有时是长链的小圆形分生孢子[26］.

3.3。评价在体外EOs和FEs的抗真菌活性

3.3.1。丁香的抗真菌活性(Eugenia caryophyllata)

提取的在体外杀菌剂的活性是通过测定抑菌能力的菌丝生长所研究的每个物种。丁香精油在所有处理中表现出更大的生物活性，达到了对物种生长的全面抑制。在处理丁香精油抗尖孢镰刀菌中，所述生物活性是成比例的浓度的增加，如表3.．在100 ppm浓度下观察到菌丝生长5.6 cm，菌丝生长显著减少到400 ppm (0.44 cm)。在500ppm时，它被观察到完全抑制病圃，与相应的对照样品的生长在7.72cm下相比，精油显示出更大的抑制。对物种观察到相同的行为黑曲霉；结果表明，在浓度为100 ppm时，菌丝生长为6.12，在浓度为200 ppm时，菌丝生长为1.98 cm;在400ppm及以上时观察到完全抑制。在丁香功能提取物的情况下，抑制菌丝生长病圃（桌子3.），the same behavior of the essential oil was observed, that is, an average growth of 6.5 cm was observed at a concentration of 100 ppm. The extracts of clove-C₁₀和丁香-C₁₂表现出菌丝生长A.尼日尔分别为6.23 cm和6.38 cm，与相同浓度丁香精油的生长情况非常相似。以丁香C提取物为例₁₁和C₁₄观察到类似的菌丝生长A.尼日尔在100ppm的7.17-7.19 cm，比丁香精油获得的值高。不同的研究表明，丁香精油具有在体外抗真菌活性，影响经常在食物中生长的物种，例如拟青霉属，青霉sp。根唑.sp, Rhizomucor属，甚至有些品种曲霉属真菌［27］.这一点也得到了证明在体外丁香能抑制黄曲霉，黑曲霉，尖孢镰刀菌，F.黄青霉， 和青霉素sp．，起价为百万分之500及千[28］.一般来说，精油的主要成分反映了精油的生物物理和生物学特性[9］.然而，这是合理的假设，丁香精油的生物活性可以与高浓度的存在下丁香酚（75-100％）[29］.具有酚类结构的成分，如丁香酚，对微生物具有很高的活性[30.］.这种酚类化合物可以使蛋白质变性，并与细胞膜上的磷脂发生反应，从而改变细胞膜的渗透性[31]，这是由羟基，其形成有活性的酶核的氢键的酸性质说明。

3.3.2。辣椒的抗真菌活性（吹笛者nigrum）

辣椒精油和功能性提取物并没有表现出对一个显著抑制活性尖孢镰刀菌和黑曲霉。在精油的情况下，观察到它在100ppm时增长7.5厘米，在200ppm时增长7.3厘米，证实它在500ppm时仍然保持不变，当观察到它减少到6.0厘米。在所有的胡椒功能提取精油有非常相似的行为,因为在提取观测平均增长7.3厘米的浓度为100,200,和300 ppm,而在400 - 500 ppm,有减少6.8厘米和6.5厘米,分别。在…的情况下黑曲霉，辣椒精油对植株生长无显著影响，在100 ~ 300 ppm浓度下，辣椒精油的生长在7.33 ~ 7.36 cm之间;但在400ppm时略有下降，为6.81 cm。在功能性提取物中，观察到类似的行为，获得较低的生长在提取物辣椒c₁₄of 7.25 cm and a maximum mycelial growth of 7.7 cm after the incubation period. Therefore, it may be concluded that pepper did not show fungistatic and fungicide activity before both fungi. However, studies have shown that pepper essential oil presents antifungal activity particularly against fungi such as土毛癣菌、tonsurans、白色念珠菌、apiospermum、A. fumigatus、A. nidulans、Sporotrichum schencki、和荚膜组织胞浆菌［32];精油的这种抗菌活性受其化学成分的影响，这些化学成分由单萜类和倍半萜类组成，被认为是对生物具有抗菌活性的[33］.一些作者(34，35]提到抗真菌化疗药物的主要靶点是真菌膜。除部分卵菌外，大多数真菌的膜主要成分是麦角甾醇。因此，许多抗真菌药物作用要么固定麦角甾醇，要么阻断生物合成，抑制细胞色素P-450组的一种酶，该酶催化真菌和动物细胞中甾醇生物合成的第一步，产生羊毛甾醇的去甲基化，胆固醇和麦角甾醇的生物合成前体。其他抗真菌药物可阻断角鲨烯环氧化酶，常作为局部药物使用。因此，改变或阻断麦角甾醇合成的策略会影响细胞膜的通透性和与细胞膜相关的酶的活性，从而导致生长受到抑制，随后导致细胞死亡。

3．4．评价体内EOs和FEs的抗真菌活性

根据在在体外测试中，它被评价精油和对功能性提取物的生物活性病圃和A.尼日尔与体内方法。在番茄果实的损伤进行了分析。在该评价中，使用具有较高的抑制活性的提取物，即，丁香精油和提取物的功能：丁香-C₁₀，丁香-C₁₁，丁香-C₁₂和clove-c₁₄，在浓度为350ppm, 400ppm和450ppm时。得到的结果如表所示4，可以观察到番茄表面有一个圆形区域，开始是白色的，逐渐演变成较深的颜色。病变表面覆盖着一簇白色菌丝，使植物组织软化和破坏;不产生渗出物，但会发生脱水和组织破坏。通过观察，无法确定丁香精油和一些功能提取物是否具有抑制生长的作用病圃，除了提取物丁香c₁₀在每个处理中都可以观察到显著的差异。软腐病A.尼日尔在没有抑制作用的处理中也可以观察到，有真菌团存在;此外，在果实表面没有真菌生长，导致从接种部位到内部区域的组织坏死。因此，我们可以确定精油和功能提取物的评价体内对物种A.尼日尔和病圃在番茄果实中未表现出较强的抑制作用;然而，完全抑制可以在在体外测试;这可以归因于一些可能影响抗真菌效率的因素的存在，如食物成分、由于添加其他成分而失活、pH值对抗真菌稳定性和活性的影响、食物基质中分布不均、提取物的低溶解度[36］.此外，Aguilar-gonzalez等。［37]证实体外芥末EO蒸汽的效力针对A.尼日尔结果表明，芥菜油中含有具有较强抑制作用的挥发性化合物。然而，这些结果是用精油在气相中使用得到的。

4.结论

总之，丁香(丁香)及胡椒(Piper初步L.）要领油和功能提取物均可储存和运输，以减少收获后感染期间提供的替代解决方案使用有害化学杀真菌剂对番茄果实的治疗。鉴于番茄的经济重要性，使用产品具有较低的风险对人类健康和环境比控制合成杀虫剂的可能性尖孢镰刀菌和黑曲霉威尔特很有前途。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者宣称，他们对这篇文章的发表没有利益冲突。

致谢

作者感谢Automa De Chihuahua Universidad Autonoma De Chihuahua的Chimultad de Cencias Quimicas进行经济支持，以进行这项研究。

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