文摘

背景。Fluoroquinolone-resistant肺炎克雷伯菌治疗挑战当与尿路感染、肾盂肾炎、肺炎、皮肤感染、骨髓炎、呼吸道感染。突变预防浓度(MPC)代表一个浓度阈值上面增加耐药突变体发生很少。本研究的目的是确定货币政策委员会在耐环丙沙星k .肺炎临床分离株。材料和方法。共有240名临床分离株k .肺炎收集从一个三级保健医院。mpc是决定24所选菌株使用10的培养液¹⁰CFU /毫升Muller-Hinton琼脂板与串行/各种浓度(0.003 -100μ环丙沙星的g)。除了货币政策委员会,表型筛查ESBL, AmpC, "。的检测qnr基因24隔离和六个隔离进行DNA测序。结果。耐环丙沙星在19.6%的观察k .肺炎临床分离株。耐环丙沙星隔离,隔离14显示了MPC的价值超过100μg。货币政策委员会在100年不等μg和20μg耐环丙沙星隔离。ESBL生产者和qnrgene-producing株高MPC。11分离显示的存在qnrB或qnrS基因。所有的样品显示的存在qnrA基因。结论。从我们的研究中,我们推断ESBL生产者和qnrgene-possessing菌株常常耐环丙沙星。估计货币政策委员会在耐多药的情况下隔离在临床的设置可以帮助治疗这些耐药菌株。

1。介绍

氟喹诺酮类原料药有显著的临床疗效肠杆菌科包括克雷伯氏菌。然而,耐环丙沙星的复发肺炎克雷伯菌最近全球扩张(1,2]。这些药物的口服生物利用度好,组织和液体浓度往往超过血清药物浓度(3- - - - - -5]。抗生素耐药性人类病原体目前在上升中每一个细菌的抗生素治疗的另一种形式是必要的6- - - - - -8]。介绍了原氟喹诺酮类药物在1980年代末。此后不久,成为全世界最常用的抗生素环丙沙星(9]。环丙沙星是最有效的第二代氟喹诺酮类具有广泛的临床应用治疗复杂的尿路感染,肾盂肾炎,性传播疾病、肺炎、皮肤感染、骨髓炎、和呼吸道感染(10- - - - - -12]。

喹诺酮影响细菌DNA合成的机制是通过抑制DNA促旋酶和IV型拓扑异构酶在革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌,分别。DNA促旋酶和IV型拓扑异构酶都是必不可少的放松DNA超螺旋DNA复制过程中(13- - - - - -15]。

革兰氏阴性细菌的抗氟喹诺酮类原料药报道伴随他们使用(16- - - - - -18]。细菌突变发生在喹诺酮治疗,从而限制其有效性包含感染。这种阻力可能发生任何三个机制,即改变喹诺酮酶目标(DNA促旋酶),外膜通透性降低,射流的发展机制。

最低抑制浓度很高的发展对环丙沙星的隔离肠杆菌科物种,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌(19)是由于一些细菌突变体积累的结果。改变细菌渗透率和射流泵的其他机制的发展阻力。这种阻力机制与抵抗其他喹诺酮类抗菌药物结构无关,如β内酰胺、四环素和氯霉素20.]。这种阻力不同种类的抗生素增加了近年来,尤其高extended-spectrumβ内酰胺酶——(ESBL)生产菌株21,22]。

虽然染色体突变通常导致耐喹诺酮,plasmid-mediated抵抗最近被发现。基因负责plasmid-mediated阻力,qnr大小不一,被发现在质粒从54 -≥180 kb的临床分离株k .肺炎和大肠杆菌从低级耐喹诺酮可以通过接合转移到一个敏感的受体(23,24]。Plasmid-mediated耐喹诺酮介导的基因(qnr)编码的蛋白质属于五肽重复家庭和保护DNA促旋酶和拓扑异构酶IV喹诺酮化合物(25]。的三个主要群体qnr决定因素是qnrA,qnrB,qnrS(26,27]。

突变预防浓度(MPC)是一种新型的概念创造的董和他的同事们认可后两级下降集落形成单位当高密度细菌接种物暴露在不同抗菌药物浓度(28]。

东等人已经定义了突变预防浓度(MPC)作为参数可以阻止或干扰耐药突变体的产生和发展。这种耐药突变可能与治疗有关的失败和浮出水面的电阻(28]。MPC代表一个浓度阈值上面增加耐药突变体发生很少(29日]。看来MPC可能作为一个简单的抗生素效价测量了复合的能力限制的耐药突变体(30.]。突变选择窗(垃圾)定义了耐药突变体的药物浓度范围很容易开发。垃圾是MPC值的上限和下限是麦克风的值(29日]。

目前,革兰氏阴性杆菌的耐药性是关于ESBL-producing上升k .肺炎。最近,plasmid-mediated耐喹诺酮类第一次被确定在临床菌株k .肺炎(23]。喹诺酮耐药与意外发现在extended-spectrum高频(18%对56%)β内酰胺酶(ESBL)生产隔离31日- - - - - -33]。在高剂量氟喹诺酮类原料药可以防止选择突变体的数量,特别是在ESBL-positive菌株,通过管理更高浓度(MPC)以上氟喹诺酮类原料药的感染的网站。

因此,本研究的目的是确定货币政策委员会在耐环丙沙星k .肺炎临床分离株。

2。材料和方法

2.1。细菌的分离

共有240名临床分离株k .肺炎收集从一个三级保健医院2015年10月至2018年12月。临床分离株的来源包括血( ),脓( ),痰液( ),尿液( ),阴道拭子( ),和伤口拭子( )。240年的隔离,47耐环丙沙星。耐环丙沙星( )和ciprofloxacin-susceptible ( )隔离受到MPC化验。

考虑ESBL阳性菌株,修改CLSI-ESBL证实试验(34)是采用磁盘执行的头孢噻肟(CTX)和头孢他啶(CTZ),在boronic酸(BA)和乙二胺四乙酸(EDTA)分发。琼脂板在37°C 18 h孵化。≥5毫米的增加的增长抑制区直径CTX-CA或CAZ-CA结合英航和EDTA与CTX的区域直径或CAZ磁盘包含英航和EDTA为ESBL生产被认为是积极的。检测",MER磁盘(10μg)单独和400μ克苯boronic酸和292年μ使用g (EDTA (35]。表型检测AmpC生产是由使用磁盘的头孢替坦和没有BA (36]。

2.2。麦克风和MPC的决心

所有临床分离株的环丙沙星麦克风决心用VITEK - 2系统7.0版本按照CLSI指南。分析了MPC 24临床分离株按布朗多等的研究。37]。新鲜文化的细菌隔离种植在Muller-Hinton琼脂(尼古拉斯)孵化一夜之间在37°C包含MPC化验。≥3×10的细菌悬液¹⁰CFU /毫升制备蛋白胨水并与麦克法兰的标准1。MPC的决心,100μl的细菌悬液接种到含有环丙沙星尼古拉斯板块。环丙沙星介于200和0.003之间的浓度μg。这些板块在37°C和观察孵化殖民地每24小时/ 2天确认数量稳定的殖民地。

2.3。筛选和排序qnr基因

DNA被煮沸裂解法提取。上层清液被转移到无菌管和存储在20°C到分析。使用常规PCR检测的存在qnrA,qnrB,qnrS基因。PCR掌握混合(25μ(18.4 l)包含无菌毫问水μ(2.5 l), 10 x PCR缓冲区μl)核苷酸(1混合μl)、16 s正向引物(1μl), 16 s反向引物(1μl),Taq聚合酶(0.1μl)和DNA模板(1μl),用于筛选的引物qnr基因中提到的表1(38]。热循环条件下在最初的变性是95°C 5分钟,其次是30变性的周期为45秒95°C。退火是在55°C为30秒qnrA和60°CqnrB和qnrS在72°C和延长45秒。最后扩展在72°C 5分钟。放大产品被发现在1%琼脂糖凝胶电泳紫外透照器下与溴化乙锭和可视化。

2.4。基因测序

PCR扩增子的qnr使用特定的基因测序引物如上所述。进行了测序在Macrogen Inc .(首尔,韩国)使用ABI棱镜®BigDye™终结者,ABI 3730 xl音序器(美国应用生物系统)。的qnr代表分离株的基因序列与已知序列在NCBI数据库中通过使用爆炸分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。序列在414320年加入数字可提交基因库,MK414318, MK414319, MK414320 MK414321, MK414322。

3所示。结果

3.1。麦克风和MPC的决心

在240年临床分离株k .肺炎47岁的分离株对环丙沙星的耐药性。源耐药隔离的血( ),脓( ),痰液( ),尿液( ),阴道拭子( ),和伤口拭子( )。耐环丙沙星隔离所有显示出类似的MIC值(≥4)。有九个耐多药菌株。没有隔离抵抗药物粘菌素的杀手锏。

环丙沙星的麦克风和MPC结果24隔离表所示2。ciprofloxacin-susceptible菌株的MIC值≤1,而耐药菌株的麦克风≥4,无论ESBL阳性菌株,AmpC或"。临床分离株k .肺炎显示对环丙沙星的耐药性( )随机选择( )对货币政策委员会的决心。四个敏感隔离被用作控制。耐环丙沙星隔离,隔离14显示了MPC的价值超过100μg(图1)。剩下的隔离MPC价值100μg。货币政策委员会在100年不等μg和200μ耐环丙沙星的临床分离株中gk .肺炎。3.15的MPC范围ciprofloxacin-susceptible菌株之间μg和50μg。两个隔离显示高MPC值175μg和200μg,这两个分离株表型AmpC阳性,ESBL和"遗传型的阳性qnrB。11这些24隔离被发现拥有qnrB( )或qnrS( )基因。只有一个隔离都是积极的qnrB和qnrS基因(图2)。的qnrA基因中没有检测到任何24隔离(表2)。耐环丙沙星隔离( )这些表型ESBL阳性( ),AmpC ( ),和" ( )显示的存在qnrB或qnrS基因。

4所示。讨论

肺炎克雷伯菌菌株产ESBL和AmpC是困难的一个主要卫生问题,因为在治疗严重的微生物引起的感染。此外,他们可能显示抵抗其他抗菌药物组32]。因为这些压力经常引起尿路感染,交叉耐氟喹诺酮类原料药是一个非常具有挑战性的问题,因为静脉注射疗法不推荐在这些感染除了最严重的一个(肾盂肾炎)。氟喹诺酮类耐药性的ESBL菌株是一个额外的负担在治疗复杂的泌尿道感染患者(29日]。在我们的研究中,11个20也耐环丙沙星隔离ESBL生产商。这一发现符合Tolun et al。39),而这个结果不赞同Azargun et al .,显示34% ESBL生产(40]。氟喹诺酮类原料药是首选治疗复杂的泌尿道感染和前列腺炎肾浓度高和革兰氏阴性的抗菌活性。使用氟喹诺酮类原料药的重要限制因素之一是突变的发展治疗期间(14]。达乌德等人报道的困难治疗ciprofloxacin-susceptible ESBL生产商MPC是高的。我们的研究结果中耐环丙沙星隔离ESBL生产显示高MPC,在合作与达乌德等人的研究。29日]。的plasmid-mediatedqnr基因检测与高频耐环丙沙星克雷伯氏菌隔离这些菌株也表现出较高的麦克风和MPC。的一些耐环丙沙星隔离并没有显示的存在qnr基因也表现出升高MPC。这样一个高架MPC阳性之间的隔离qnr可能导致耐药突变体。这很符合我们的研究结果显示的耐药菌株k .肺炎(41]。研究细菌隔离较大可能澄清的存在之间的双向关系qnr分离基因和MPC很高的抵抗力。的菌株并没有显示任何基因的存在可能港口的其他变体qnr基因。治疗高剂量的氟喹诺酮类原料药高于MPC价值在耐多药菌株的情况下可以提供根除这些隔离感染的网站。MPC值可能被认为计划剂量治疗的患者感染隔离显示coresistance环丙沙星和ESBL (7,42]。不同剂量的环丙沙星生物利用度在不同的身体部位可能是一个额外的援助MDR的治疗计划。环丙沙星在不同身体的生物利用度网站报道了口服给药和静脉注射的路线Brunner et al。43]。

货币政策委员会的概念可以被认为是治疗决策的选择和剂量的抗生素来控制耐药突变体的发展肠杆菌科家庭。我们的研究也强调了频繁发现ESBL-producing耐氟喹诺酮类原料药k .肺炎菌株。mpc的决心在耐多药的情况下隔离在临床的设置可能是重要的治疗计划。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢DST-FIST (Ref。不。SR /置/ College-23, 2017),印度,提供研究设备。