文摘
真菌通过表型方法识别经典,即使这些方法,有时候,仍然困难或不确定。另一方面,核苷酸序列分析的内部转录间隔器(它)rDNA已经证明是一个有用的方法鉴定真菌。本研究的目的是比较表型方法和DNA测序鉴定其区域的皮肤真菌物种隔离在达喀尔塞内加尔。一组32株从患有脚气真菌分离。真菌学的身份透露毛癣菌属soudanense(n= 13),t . interdigitale(n= 10),Microsporum audouinii(n= 5),一个应变为每个以下种类:t .石,t . mentagrophytes,m .犬属和一个身份不明的应变。相比之下,ITS-based PCR和DNA测序申请鉴定的孤立的真菌。其在爆炸序列显示,搜索分析,99 - 100%的相似性。通过常规方法对皮肤真菌的分离鉴定DNA测序证实了该地区84%的病例。差异主要关注t .石误判为t . interdigitale。PCR测序提供了一个很好的工具识别皮肤真菌菌株不出现典型的形态特征。它也能够给正确的非典型菌株的鉴定m . audouinii负责足分支菌病的头皮。
1。介绍
Dermatophytoses相对通用的和次要的真菌感染,这显然是均匀地忽视了非洲大陆(1]。真菌是负责不同的临床表现,从表面的体癣、头癣、脚癣、甲癣等皮下感情dermatophytic足分支菌病(pseudomycetoma) [2]。
特别是,头癣需要特定的治疗(3,4]。γ射线激光器等人引用几个原因的识别个人皮肤真菌物种造成感染仍然是重要的(5]。首先,他们给了促进再感染的流行病学情况。例如,Microsporum犬属一般表示一种动物源,而Nannizzia gypsea(m . gypseum),导致病变相似,表明接触受污染的土壤。这种感染源的识别为一个更好的管理是很重要的。其次,他们调用实际的治疗方案也可能不同,不同的皮肤真菌物种;例如,毛癣菌属tonsurans在头癣往往需要较短的治疗时期m .犬属即在一定程度上回避药物暴露通过形成arthroconidia以外的头发轴。第三,真菌从nondermatophytic物种的区别,不响应antidermatophyte治疗感染,导致dermatophytosis-like指出尤其是甲真菌病。典型的例子是dermatophytosis-like感染Neoscytalidium dimidiatum。同样,真菌必须区别不致病的真菌,真菌表面上像等t . terrestre,Aphanoascus fulvescens,Myriodontium keratinophilum,定期从dermatophytic病变。目前,terbinafine阻力毛癣菌属临床分离株是越来越多的报道来自亚洲,特别是印度(6]。因此,真菌鉴定物种水平的重要性可能是有用的。
皮肤真菌隔离可以鉴定到属/物种表型方法,基于殖民外观、微观考试,和生化试验等增长模式毛癣菌属琼脂和脲酶3]。表型方法可以准确时由熟练的技术人员,使用标准化的基准来识别和确定准确的特性的物种7]。
皮肤真菌物种的形态识别文化有时是困难的或不确定的,因为有变化从一个孤立到另一个物种之间和重叠的字符(4]。这就是为什么需要开发更可靠的方法来识别真菌(7]。
越来越多的分子生物学技术适应了真菌和更有效的识别比传统的测试(8]。几个技术提出了真菌的基因组分析,为准确测定和DNA条码技术是非常有用的。内部转录间隔器的多态性(ITS1和ITS2)侧翼DNA序列编码5.8 s rDNA非常敏感和可靠的区分不同种类的真菌(4,8]。
本研究旨在比较的结果集合的表型和分子序列分析鉴定临床真菌分离株在达喀尔,塞内加尔。
2。材料和方法
从2014年到2017年之间,菌株患者被诊断出患有头癣(n从MN691044 = 16,基因库加入数字MN691059),指状组合型脚癣(n= 9,基因库从MN691060 MN691068),加入数字甲癣(n= 5,基因库加入数字从MN691069 MN691073),体癣(n= 1,加入基因库MN691074数量),和头皮足分支菌病(n= 1,加入基因库MN691075)寄生虫学和真菌学实验室的达喀尔Le Dantec大学医院后皮肤磋商。
诊断dermatophytoses做寄生虫学和真菌学实验室的达喀尔Le Dantec大学医院的基础上真菌学的考试包括直接和文化考试前一篇文章中描述的那样(9]。微观直接检测的标本进行了20% KOH溶液。所有标本培养2盘/管,一个包含Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)添加氯霉素(Bio-Rad、法国)和其他包含SDA与氯霉素和补充放线菌酮(Bio-Rad、法国)。文化孕育在27°C和评估增长48 h后一旦每周一个月。
阳性标本真菌被确定基于增长的增长率和宏观和微观特征的殖民地,有时生化特性(脲酶试验)10,11]。
真菌的形态学鉴定后,殖民地被定期维护亚文化与环己酰亚胺SDA补充。
2.1。DNA提取
DNA提取EZ1 XL先进仪器,执行试剂盒®殖民地独立的4到10天文化25°C。殖民地的一部分培养基上引入一个包含700珠管μ裂解缓冲G2的l (EZ1 DNA调查员工具包,提供的试剂盒®)。其次是机械裂解FastPrep®-24: 2分,在10000转离心1分钟。最后,200年μl已被删除的上层清液,放置在一个EZ1扁管在启动EZ1之前先进XL仪器根据制造商的指示。基因组DNA提取,筛选了200年μl洗脱缓冲,储存在−20°C下游分析。
2.2。DNA测序
分子识别是由核苷酸序列分析rDNA。测序反应进行了相同的引物用于放大。后者是5μL (DNA和45μ包含25 L反应的量μL AmpliTaq黄金®360主混合(应用生物系统公司®),17岁μL无菌水DNase /核糖核酸酶的自由,和1.5μL的正向和反向引物。PCR程序如下:94°C 10分钟,其次是40 94°C的周期为20多岁和53°C 30年代和72°C 1分钟,在72°C延迟7分钟。每个样本处理与ITS1/2三次,ITS3/4,和ITS1/4放大ITS1 ITS2,和ITS1 - 5.8 - s - ITS2地区,分别为(表1)[12]。在2%琼脂糖凝胶启示后,与溴化乙锭染色,和可视化紫外光照下(E-gel®成像仪),最好的扩增子是用于测序。放大产品的净化进行了使用交联葡聚糖®G50 DNA纯化和测序反应加工使用3500基因分析仪(应用生物系统公司,Inc .)。获得序列组装使用CodonCode对准器软件(CodonCode®公司)。
2.3。DNA分析
其序列受到爆炸(基本局部比对搜索工具)在基因库搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和MycoBank (http://www.mycobank.org)。识别的数据库时保留的提议都是相同的。基于物种识别序列相似性定义为≥99%。
3所示。结果
总的来说,我们使用32皮肤真菌菌株的集合。
根据表型鉴定,确认为隔离t . soudanense13例(40.6%)t . interdigitale在10例(31.3%),Microsporum audouinii在5例(15.6%),1例(3.1%)t .石,以及t . mentagrophytes m .犬属,一个身份不明的应变(图1)。
其爆炸序列显示99 - 100%的相似性在我们的研究中确定的5种。
隔离是确定其区域的DNA测序,13例(40.6%)t . soudanense,9例(28.1%)t . interdigitale在6例(18.8%)m . audouinii3例(9.4%)t .石,1例(3.1%)m .犬属。
因此,我们的身份菌株的DNA测序证实了27日的地区在物种水平的32例(84.4%)和31属水平的32例(96.9%)(表2)。
t . soudanense和m . audouinii真菌物种表型是最易于识别方法和比例的92.3%(12/13)和83.3% (5/6)。
揭示了分子表型鉴定文化研究的比例被误诊为15.6% (5/32)。
的细节差异星号的表型和分子方法表2。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们测序rDNA其地区的32个皮肤真菌菌株孤立在达喀尔患有头癣、体癣、脚癣、甲癣,足分支菌病的头皮。我们的目的是比较使用表型方法获得的数据和生成的数据来评估孤立的物种鉴定的准确性。
的表型鉴定菌株的DNA测序证实了其地区84.4% (27/32)。
这个结果与发现阶段由李等人有81%(102/126)的表型之间的相关性和ITS-based皮肤真菌物种的分子识别,使用一组临床分离株13]。
另一方面,其他作者更好的报道比例94%的表型之间的相关性和ITS-based分子识别与真菌(32临床分离株的集合14]。
考虑识别的物种包括在这项研究中,我们的研究结果表明t . soudanense和m . audouinii是最易于识别皮肤真菌物种表型方法比例为92.3%(12/13)和83.3%(5/6),分别。
这个结果可以解释为这些物种是最常见的真菌在塞内加尔(孤立15)和真菌学家识别他们的习惯。
一株,身份不明的表型方法最终确定由DNA测序m . audouinii。加入这个非典型应变(基因库MN691075)生产谷物足分支菌病。显微镜检查的谷物,柔软,20%氢氧化钾,洗后在生理盐水和破碎之间滑动和盖玻片,显示有隔膜的透明真菌菌丝在/谷物。头皮活检显示大型谷物组成一个紧凑的菌丝体和vesicules,质量和病例报告这一毒株是最近发表(2]。
它最近强调,DNA测序,尽管一个可靠的技术鉴定真菌物种,不能正确区分t .石,t . violaceum,t . soudanense(16]。这三个真菌形成t .石复杂的是不断变化的。根据γ射线激光器等人(2007年7),复杂的anthropophilic皮肤真菌的物种t .石s.l.包含两个类群,t .石和t . violaceum非洲流行,主要引起头癣、体癣。之后,t . soudanense是重新建立“非洲人口”的一部分t .石(5]。然后,最近根据皮肤真菌物种的修订和这些真菌的命名法德这位et al .,t . soudanense被认为是一个不同的物种t . violaceum(17]。因此,t . violaceum,t . soudanense,t .石可以被看作是独立的物种尽管他们密切的相似之处。基于其核糖体DNA条形码基因的序列,他们可以区分为组。的t . violaceum组包含t . violaceum var. indicum和t . glabrum。的t . soudanense组包括t . circonvolutum t gourvilii var.媒介,t . gourvilii,t .石组包含的类型t . fischeri t . flavum t . fluviomuniense t . kanei t .足,t . raubitscheckii和t . rodhainii,所有这一切,因此,可以被看作是证明的同义词t .石(18]。
根据数据库,t . soudanense被确认为等或t .石(非洲人口)。
因此,孤立的解剖部位可能是非常有用的定向,因为作为一个标准t . violaceum和t . soudanense普遍地出现在头皮(分别为80.85%和71.43%的人类来源的菌株),而t .石主要是无毛的皮肤上发现人类来源的菌株(6.98%)(18]。
因为人们的旅游和移民的增加,压力是不可靠的地理起源。与某些次要的例外,这是发现t .石和t . violaceum有一个全球分销,而t . soudanense非洲是有限的(18]。然而,t . violaceum主要是发现在地中海盆地(特别是在北非),以及在非洲中部,中东,东欧(10]。
基于这些考虑,似乎合理的情况下由于脚癣t . soudanense因为这个物种是主要在非洲西部特别是在塞内加尔(19,20.]。
5例差异发现32物种鉴定。他们担心在2例,t .石误判为t . interdigitale。
与我们的结果相反,大多数的差异(11/14)由李等人t . mentagrophytes误判为t . interdigitale(13]。Pryce等人也观察到两个不和谐的表型鉴定和识别结果序列识别包括一个案例t . mentagrophytes误判为t . interdigitale和另一个Chrysosporium indicum误判为t . interdigitale(14]。
伊朗的作者,在2015年,使用PCR-RFLP方法,指出同样的不调和我们指出但有80.8% (76/94)t .石误判为t . interdigitale(21]。同样,突尼斯作者报告这个错误识别,t .石作为t . mentagrophytes或反向的24例(4 16.6%)(22]。必须说,突尼斯作者没有说明区别t . mentagrophytes和t . interdigitale在t . mentagrophytes复杂。
这可能是有道理的,因为只有识别是基于表型的方法,因为形态,t .石展品的光谱重叠的角色。这就是为什么如此多的品种或同义词被描述在过去(引用)。同时,文化对溴甲酚紫琼脂(BCP)、尿素的水解,头发射孔测试包括的证实试验t .石(11]。
在当前分类,这个名字t . interdigitale是专门留给anthropophilic隔离,主要发现在甲真菌病和脚癣情况下,而不是zoophilict . mentagrophytes隔离,也可以找到在临床情况下除了指甲和脚感染(23]。
这符合我们的结果88.9% (8/9)t . interdigitale隔离的指状组合型脚癣(6/8)和甲癣(2/8)。
Taghipour等人在2019年指出的一个统计上的显著差异影响其基因型分布在不同地区的真菌感染(23]。另一方面,他们没有发现t . interdigitale菌株与头癣的情况下与我们发现的一个案例t . interdigitale头癣(MN691059)。
除此之外,对于我们的压力,只有脲酶试验进行urea-indole浴缸是有用的区分t . interdigitale(脲酶阳性2天)t .石(负面测试2天)。
虽然该研究关注表型的比较真菌使用DNA测序和分子识别的区域,这将是有趣的扩展,包括其他分子标记与高鉴别力,因为高遗传多样性可能意味着更好的适应能力在选择性压力下(24]。
5。结论
在定义,表型方法似乎并不构成真菌主要诊断问题有关的识别主要常见的隔离皮肤真菌的物种在塞内加尔。在这项研究中,表型方法经DNA测序的一些物种的地区高达90%。然而,似乎不足的非典型形态或多形性。因此,分子技术必须在我们的实验室更好地识别为确保更好的保健。
数据可用性
数据用于支持本研究的结果中包括这篇文章。然而,序列存入基因库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi从MN691044 MN691075)与基因库加入数字。
伦理批准
这项研究是由国家健康研究伦理委员会批准的塞内加尔(CNERS / 0212/2016 /陶瓷/ UCAD)和依照程序建立的大学逃往安踏迪奥普的达喀尔(UCAD)伦理批准任何研究涉及人类参与者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
k·d和d . n .负责研究设计;k·D。,L. B., and S. R. were involved in development and methodology; data analysis and interpretation was performed by K. D., L. B., and S. R.; K. D. wrote the manuscript; and M. A. D., M. N, A. S. B., and M. C. S. revised the manuscript.
确认
执行这项工作的一部分逃往安踏迪奥普大学间的合作机构-达喀尔,塞内加尔,“地中海感染”研究所的马赛,法国。