分子特性的低密度聚乙烯(LDPE)降解细菌和真菌从Dandora垃圾场,肯尼亚内罗毕

文摘

本研究旨在分子和生化特性的低密度聚乙烯(LDPE)降解真菌和细菌从Dandora垃圾场,内罗毕。二十10细菌和真菌隔离被确定使用16 s rDNA和18 s rDNA序列对细菌和真菌,分别。真菌降解是由于最高米曲霉应变A5 1,而细菌降解是由于最高蜡样芽胞杆菌和应变A5Brevibacillus borstelensis菌株B2,分别为2。分离筛选的能力产生胞外漆酶和酯酶;来自烟曲霉属真菌菌株B2, 2表现出最高的漆酶(15.67毫米)米曲霉应变A5, 1表现出最高的酯酶(14.33毫米)。烷烃hydroxylase-encoding基因筛查使用底漆AlkB 1扩增片段的大小870个基点。四种细菌样本阳性基因。真菌分离的最适生长温度是30°C。拥有漆酶、酯酶和烷烃羟化酶活动建议低密度聚乙烯降解能力的重要分子基础。最佳生长条件的知识将有助于更好地利用微生物生物修复的低密度聚乙烯。的应用米曲霉应变A5, 1和蜡样芽胞杆菌应变A5,在聚乙烯降解是一种很有前途的选择在这样的生物修复明显表现出高水平的生物降解。进一步调查的烷烃降解基因降解微生物将通知合适的微生物财团的选择生物强化策略。

1。介绍

低密度聚乙烯环境污染的主要原因是由于其抗拉强度高、轻、耐水,和微生物的攻击。塑料在该国的消费已经增加到每年4000吨的聚乙烯袋连同硬塑料最终散落在环境中创建“塑料威胁”[1]。通过国家环境管理局(NEMA),肯尼亚已经接受了3 rs,减少,重用和回收,固体废物管理的概念(2)和最近禁止使用聚乙烯塑料袋,但这并没有解决的问题仍然是分散的聚乙烯环境(3]。

生物降解物质的分解是通过微生物活动和是一个复杂的过程包括以下步骤4):生物腐蚀、解聚、同化和矿化。之前各种属的细菌和真菌有牵涉的生物降解聚乙烯尽管低利率。不动杆菌sp。被发现能使用吗n烷烃链长度C10-C40作为唯一的碳来源报道(5]。细菌属,即假单胞菌,不动杆菌,Brevibacillus,红球菌属,和微球菌(6,7,1),分别从不同来源分离是聚乙烯的潜在生物降解。真菌属、Gliocladium,Cunninghamella,青霉菌,曲霉属真菌,镰刀菌素,毛霉菌,Mortierella,从土壤1)后被证明有可能降低聚乙烯降解通过各种方法的分析。

塑料生物降解由于某些酶的活性会导致聚合物链的乳沟为单体和低聚物。酶分解塑料进一步吸收的微生物细胞代谢。有氧分解产生二氧化碳和水。在微生物的参与酶生物降解聚乙烯的调查,和酶如漆酶和酯酶已确认在这个过程中扮演一个角色直接或间接(8]。漆酶酶的生产聚乙烯为唯一碳源的存在是清楚地表明,漆酶在分解的一些中介在这个过程中生产的产品。在这项研究中,细菌和真菌的分子特征,证实了降解聚乙烯做以及评估最佳pH值、温度和氯化钠浓度在它们茁壮成长。AlkB基因编码的烷烃羟化酶水解烷烃也被调查。

2。材料和方法

2.1。细菌的DNA提取

总基因组DNA从细菌纯培养分离指数后期阶段通过标准协议(9)如下:1.5毫升的隔夜细菌培养(生长在LB培养基)被转移到1.5毫升埃普多夫在13000 rpm管和离心1分钟颗粒细胞。浮在表面的被丢弃。细胞颗粒悬浮在600年μl TE缓冲和离心机在13000 rpm和上层的丢弃。细胞颗粒resuspended于200年μl TE缓冲,以下是补充道:5μl溶菌酶(20毫克/毫升),5μl RNAnase(20毫克/毫升)和10μl蛋白酶K(20毫克/毫升)其次是隔夜孵化在37°C。在第二天早晨,温度调整到56°C一人力资源和同等体积的苯酚/氯仿(1:1)添加和混合通过倒相管,直到阶段完全混合。旋转是在13000 rpm在室温下15分钟。上层水相是小心翼翼地转移到一个新的管通过使用1毫升吸管。此步骤重复了两次,以确保所有蛋白质都被移除。同等体积的氯仿和异戊(24:1)被添加到水层和离心机13000 rpm,持续15分钟。水层被新管。这一步也是重复以确保所有苯酚。同等体积的异丙醇添加并存储在一夜之间−20°C。样本然后解冻,离心机在4°C 30分钟粒DNA。 The pellet was washed in 70% ethanol and centrifuged at 13000 rpm for 5 min, and then, the ethanol was carefully pipetted out. The pellet was air dried on the bench for 20 min, and the isolated genomic DNA was viewed on a 1% agarose gel.

2.2。细菌DNA扩增和测序

放大的16 s rDNA基因的5′末端执行与通用引物(正向引物(8-F) 5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′)和反向引物((1942 r) 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3”)[10]。PCR GeneAmp PCR系统上执行9600(应用生物系统公司),使用1µl聚合酶(应用生物系统公司),1µl每10点的正向和反向引物浓度,27岁µl无菌去离子水,8µl含有核苷酸和MgCl PCR缓冲₂,2µl DNA模板,反应总量的40岁µl。自行车计划使用如下:1 94°C的周期5分钟;30 94°C的周期为30秒,30秒55°C, 72°C 1.5分钟;和最后一个扩展的10分钟72°C。PCR产品可视化通过1%的琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭直接添加。1.5 kbp产品受到桑格双脱氧法使用正向引物测序和反向引物在Macrogen DNA, Inc .(荷兰)。序列文件编辑使用浓度版本2.6.2相比,使用基本的局部比对基因库核苷酸数据库搜索工具(爆炸)。系统发育关系推断使用大型7 (11)和最大似然算法在Phylip可用。最大似然和parsimony-derived树引导使用PHYML [12,13]。

2.3。真菌DNA提取

真菌DNA提取协议由Gontia-mishra et al。14使用了)。真菌菌丝生长了7天在马铃薯葡萄糖琼脂55°C。菌丝在液态氮冷冻和地面细粉用研钵和研杵。粉是转入2毫升管,600µl(预热提取缓冲了。内容是在65°C水浴孵化与混合每10分钟后30分钟。270年µl 5 M乙酸钾添加量和离心机在13000转10分钟。700年µL的上层清液转移到干净的管子,和5µL核糖核酸酶(10毫克)添加然后孵化30分钟37°C。氯仿和异戊醇合成了24的比例:1,同等体积是添加到混合物中。600年µL用移液器吸取上层清液的清洁管子。DNA是沉淀通过添加3 M乙酸钾的体积的十分之一,三分之二的异丙醇的体积。这是孵化−20°C 30分钟然后在13000转离心10分钟。颗粒被使用70%的乙醇之后,使离心10分钟,然后,DNA被筛选了50µL RNASE-free水和储存在−20°C。

2.4。真菌DNA扩增和测序

PCR GeneAmp PCR系统上执行9600(应用生物系统公司),使用1µl聚合酶(应用生物系统公司),1µl每10点的正向和反向引物,27岁µ去离子水,8µl含有核苷酸和MgCl PCR缓冲₂,2µl DNA模板,反应总量的40岁µl。自行车计划使用如下:1 95°C的周期5分钟;35周期为30秒95°C, 60°C 45秒,72°C 40秒;和最后一个扩展72°C的5分钟。引物对F -566:5′-CAGCAGCCGCGGTAATTCC-3′和R - 1200:5′-CCCGTGTTGAGTCAAATTAAGC-3′放大平均650 bp长片段从V4和V5地区使用(15]。PCR产品可视化通过1%的琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭直接添加。产品受到桑格Macrogen双脱氧法测序,Inc .(荷兰)。SeqMan Pro是用来组装两个正向和反向序列文件(16]。获得的序列比较与NCBI数据库中可用的序列使用基本的局部比对工具(爆炸)。18 s rDNA获得的基因序列在当前的研究中,与那些最亲密的邻居菌株,结合使用ClustaX 2.1版。系统发育关系推断使用大型7 (11)和最大似然算法在Phylip可用。最大似然和parsimony-derived树引导使用PHYML [12,13]。

2.5。筛查酶的生产

细菌的分离筛选的能力产生胞外酶,即。,漆酶和酯酶。隔离的能力利用基质如木质素和渐变20表现出他们的能力产生相应的酶(17]。

2.5.1。测定酶漆酶的存在

lignin-modifying真菌的媒体选择是由普通琼脂和最小的盐的使用媒体结合了木质素(鼓励选择lygninolytic真菌)和愈创木酚,它充当一个色度指标的lignin-modifying漆酶或酶氧化酵素。所有化学品都从西格玛化工有限公司,圣路易。红颜色的存在3 - 5天后孵化是一个漆酶活动的迹象。漆酶测定每1升:400μ愈创木酚,琼脂15克,2 g麦芽提取物,0.5 g KH₂阿宝₄,0.001 g ZnSO₄,0.4 g K₂HPO₄,0.02 g FeSO₄和0.2 g MgSO₄,0.5 g KH₂阿宝₄,0.1 g NH₄没有₃KOH 0.1 g氯化钾5毫升、0.25 g氯霉素,形成红色的区域是一个积极的结果。

2.5.2。测定酶酯酶的存在

隔离的基础上培养的媒体(KH的1%₂阿宝₄,0.01% MgSO₄h·7₂啊,0.005% CaCl₂h·2₂啊,4%氯化钠和1% Na₂有限公司₃)补充1%渐变20(国内成绩)为唯一碳源。中被发现然后此后接种的隔离板和孵化至少48小时37°C的细菌和真菌分离株在28°C 3 - 5天。媒体观察区域的降水的钙晶体在每个隔离。表示了积极的隔离酯酶生产沉淀钙晶体的殖民地。

2.5.3。基因筛查生产Alkane-Degrading酶

放大了使用套AlkB引物(18表所示)1。PCR GeneAmp PCR系统上执行9600(应用生物系统公司)使用Taq DNA聚合酶。共有30个周期放大了的模板DNA变性为1分钟在94°C,引物退火在40°C 1分钟,在72°C和底漆扩展2分钟(19]。PCR产品可视化通过1%的琼脂糖凝胶电泳和2µ溴化乙锭直接添加。

2.6。对真菌的分离温度对增长的影响

马铃薯葡萄糖琼脂增强和250毫克/毫升氨苄青霉素抑制细菌生长在pH值7.0准备,消毒,无菌培养皿中。每个板接种真菌隔离和孵化温度20 30和40^oc .隔离增长检查经过4天的孵化。增长水平得分采用菌落直径,即0毫米表示没有增长,1 - 2毫米表示最小的增长,表明平均增长3 - 4毫米,5 - 7毫米表示满意的增长,8 - 10毫米表示良好的增长。

3所示。结果与讨论

3.1。系统发育关系的低密度聚乙烯降解真菌隔离

放大的真菌18 s rDNA使用1200 r和566 f通用引物产生了约640个基点的预期带大小的PCR产品放大样品(图1)。这些产品是纯化、排序和分析。结果被用来获得加入数字从NCBI基因库。的序列分析与那些最亲密的邻居使用ClustalX 2.1版。系统发育关系推断从18 s rDNA序列的系统发育比较使用大型7和最大似然算法生成系统树(图2),显示了各种之间的系统发育关系曲霉属真菌物种。的树显示四个演化支隔离集群。从我们之前的研究20.),米曲霉(MG779508)导致体重最高的36.4±5.53%。米曲霉是一个有前途的生物降解聚乙烯的能够降低30%的聚乙烯200天(21除了微裂隙的形成和增加脆化的LDPE表面SEM分析。在一项研究中使用未经处理的低密度聚乙烯孵化答:oryzae,5%体重记录与控制(未经处理的和未曝光)。来自烟曲霉属真菌菌株B2, 2 (MG779513)记录减肥24±3.26%在我们之前的研究[第二高20.]。来自烟曲霉属真菌也是物种中已经研究了降解聚乙烯和其他聚合物的能力。在一项研究中,三个真菌物种降解聚乙烯的能力,进行了调查答:来自烟是最好的降能器相比答:terreus和f .以上后LDPE表面的SEM和FTIR分析(22]。包括其他真菌参与这项研究曲霉属真菌nidulans,答:flavus,答:terreus,答:neoflavipes导致减肥的LDPE表。将减肥作为衡量聚乙烯生物降解的程度已经被许多作者(被广泛接受和使用23]。

3.2。系统发育关系的低密度聚乙烯降解细菌的分离

放大的细菌16 s rDNA使用1492 r和8 f通用引物片段(图产生了1420个基点3)的纯化、排序和分析。结果被用来获得加入数字从NCBI基因库。的序列分析与那些最亲密的邻居使用ClustaX 2.1版。系统发育关系推断从16 s rDNA序列的系统发育比较使用大型7和最大似然算法生成系统树(图4),显示了该属物种系统发育之间的关系。Brevibacillus,芽孢杆菌,Lysinibacillus在一个主要的进化枝假单胞菌,Ochrobactrum,Cellulosimicrobium被分组在另一个主要的进化枝。细菌的属芽孢杆菌,Brevibacillus,Ochrobactrum,Lysinibacillus,Cellulosimicrobium,假单胞菌确认为有效聚乙烯降能器。细菌隔离A5, 1 a -蜡样芽胞杆菌(MG645256)产生的降解效率最高的体重,也就是说。35.2%,紧随其后的是孤立B2, 2 -Brevibacillus borstelensis(MG645267)从早先的研究显示20.28%20.1)在隔离B1, -假单胞菌putida(MG645283)和D4, yn -Brevibacillus borstelensis应变(MG645261)产生2.88%的减肥和−6.8%,分别。属芽孢杆菌最常发现在低密度聚乙烯降解属在这个研究。在这属包括物种鉴定蜡样芽胞杆菌,芽孢杆菌toyonensis,苏云金杆菌,枯草芽孢杆菌,芽孢杆菌pseudomycoides,芽孢杆菌safensis,芽孢杆菌niacini。各种研究已经完成调查属的功效芽孢杆菌聚乙烯降解,根据本属不同的物种被发现有潜在降解聚乙烯(24,25]。蜡样芽胞杆菌被发现是一个很好的候选生物修复的生物降解聚乙烯由于其产生漆酶酶和锰过氧化物酶的能力。在比较研究中,b的仙人掌被发现更有效b . sphericus在photo-oxidized退化和thermos-oxidized LDPE (26]。根据(6),Brevibacillus borstelensis加入数量未照射聚乙烯AY764129能够降低11%的重量在30天。两个细菌隔离芽孢杆菌amyloliquefaciens(BSM-1)和芽孢杆菌amyloliquefaciens(BSM-2)隔绝城市土壤和用于聚合物降解研究和被发现在LDPE在减肥方面产生重大变化,抗拉强度降低,出现新的官能团27]。一种新型的假单胞菌,假单胞菌citronellolisEMBS027,加入基因库KF361478孤立了(28从印多尔的垃圾填埋场,印度,退化17.8%的聚乙烯4天。不同种类的假单胞菌分析了降解聚乙烯的能力和孵化为120天。假单胞菌putida导致9%的减肥(29日]。

3.3。筛查酶生产

细菌的分离筛选酶漆酶和酯酶的生产(图5)与低密度聚乙烯降解酶。细菌的分离Brevibacillus borstelensis菌株B2, 2,Brevibacillus parabrevis2、应变C2假单胞菌putida菌株B1, 1表现出最高的漆酶的存在。只有两个隔离芽孢杆菌toyonensis和芽孢杆菌大环内酯类负了漆酶的活动。酯酶活性最高的隔离Brevibacillus borstelensis应变D4 yn,芽孢杆菌烟酸1、应变C4假单胞菌putida菌株B1, 1。真菌分离筛选酶漆酶和酯酶的生产(图6)。隔离B2, 2 -来自烟曲霉属真菌,1 - A5米曲霉2、A4 -黄曲霉表现出最高水平的漆酶酶在最高水平的酯酶酶真菌米曲霉。

生产胞外酶起着重要的作用在聚合物降解解聚作用,聚合物的分解成更小的子单元(30.),然后保持酶的降解成中间产品,可以融入微生物细胞(31日),利用碳源导致生产能源,水,二氧化碳和甲烷的厌氧呼吸(32]。在这项研究中,生产胞外酶、漆酶和酯酶研究。真菌和细菌隔离在这个研究中被审查的能力产生漆酶酶和隔离B2, 2 -来自烟曲霉属真菌(MG779513),低密度聚乙烯降解效率为24%,最高的颜色由于直径漆酶生产。这可能归因于它能够产生大量的漆酶和其他细胞外酶被认为在聚乙烯降解中发挥作用。根据(33),这种酶的生产增加当微生物与聚乙烯附近。文献[34)是能够提取的原油漆酶酶孵化与聚乙烯和导致退化是通过减肥,证明红外光谱和扫描电镜。酯酶催化酯键的乳沟35的短链甘油三酯或酯。酯已确定作为中介的一部分产品在聚乙烯降解当postincubation培养基进行gc - ms分析,可以融入微生物细胞,发生水解产生后续的羧酸和酒精,最终进行呼吸作用产生的能量(36]。隔离A5, 1 -米曲霉(MG779508)体重的36.4%高酯酶酶活性的10%。这可能是造成其高降解潜力相比其他真菌分离株降解较低。

3.4。基因筛查AlkB生产Alkane-Degrading酶

放大AlkB基因的PCR是使用三套AlkB引物。只有一组的AlkB底漆可以放大AlkB基因产生一个片段的大小870个基点。AlkB基因是负责生产水解酶酶负责烷烃降解。该基因在4细菌样本(图放大7)。许多烷烃下降的共同特征是,他们包含多个烷烃羟化酶与底物范围重叠(37]。AlkB——alkB-related alkane-degrading酶的基因代码,烷烃羟化酶(38]。细菌样品的分析显示存在AlkB 1基因4的细菌样本。细菌分离株阳性alkB D4 yn - 1基因Brevibacillus borstelensis,1 - B1假单胞菌putidaA5, a1 -蜡样芽胞杆菌。烷烃降解是通过终端发起相应的伯醇氧化,由脱氢酶进一步氧化脂肪酸可进入三羧酸循环(39]。这种遗传信息的遗传能力的微生物降解长链烷烃通过这种酶的生产。

3.5。对真菌的分离温度对增长的影响

真菌的生长在不同的温度下(20°C, 30°C,和40°C)(图所示8)显示,增长30°C是明显高于增长20°C和40°C答:oryzae应变A5, 1有最高的增长(10±0)。然而,孤立E4, 1 -答:nidulans最优增长40°C。这可能归因于这样一个事实,这些细菌的采样站点是一个垃圾场,气温一般环境,因此有利于嗜中温微生物的生长。由真菌漆酶生产受到碳源的类型和浓度、pH值和温度。

4所示。结论

目前的研究表明,土壤细菌和真菌降解聚乙烯的孤立的垃圾场的潜力。这是第一个研究当地的细菌和真菌的隔离,可以降低低密度聚乙烯塑料在肯尼亚是最常见的。特别的应用米曲霉应变A5, 1和蜡样芽胞杆菌应变A5,将是有益的生物修复方面表现出显著的聚乙烯降解效率。是确定生产酶漆酶和酯酶的微生物已被证实在聚乙烯降解中发挥作用。烷烃的分离具有hydroxylase-producing基因(AlkB),低密度聚乙烯的分子的解释退化在调查之中。真菌在这项研究中被发现在30°C的温度下生长。

数据可用性

数据(数据1- - - - - -8和表1)用于支持本研究的结果中包括这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作已经完全由非洲联盟委员会通过锅非洲大学研究所的科学,技术和创新。我们高度赞赏支持从诚实的同事约翰斯通博士Neondo,史蒂夫•Ogada Eliud奥库穆博士和爸爸在给了我们真诚的和建设性的批评,帮助塑造了这最后的产品。我们感谢员工和管理生物技术研究所(IBR)有关,a . b . Nyende教授理查德•Rotich凯瑟琳Eyiinda和恩典Mungai实验室和研究工作提供一个有利的环境。

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