文摘

某些rhizobacteria可以应用于去除砷在环境生物修复和植物修复。本研究确定的最低抑制浓度(MIC)的砷在确定rhizobacteria隔绝的根源Ludwigia octovalvis(Jacq)。乌鸦。砷的吸附能力也进行了分析。10中孤立rhizobacteria,五是革兰氏阳性(节细菌属globiformis,蜡样芽胞杆菌、芽孢杆菌、短小芽孢杆菌megaterium,葡萄球菌lentus)和五个是革兰氏阴性(肠杆菌属asburiae, Sphingomonas paucimobilis Pantoeaspp。,根瘤菌rhizogenes,根瘤菌radiobacter)。r . radiobacter显示的最高麦克风> 1500 mg / L的砷。所有的rhizobacteria能够吸收砷,美国paucimobilis显示最高的砷吸附能力(146.4±23.4毫克/克干电池重量)。动力学分析表明,速度b的仙人掌后孔隙扩散模型(R²= 0.86),大肠asburiae遵循符合一级动力学模型(R²= 0.99)r . rhizogenes跟着pseudo-second-order动力学模型(R²= 0.93)。确定rhizobacteria砷吸附重金属的机理不同,砷吸附能力,在砷吸附动力学模型。

1。介绍

目前,大多数研究植物修复的生理机制上强调植物运输和宽容,以及工厂的存储的金属。一些信息可以在流程的hyperaccumulator植物phytoextraction金属(1]。Rhizobacteria通常存在于土壤自然,尽管大量的金属。

许多菌株含有抗重金属的遗传因素如砷、铋、镉、铬、铅、汞、镍、银等(2]。砷的生物有效性和可抽出的形式显著抑制土壤微生物群落,虽然可利用砷展品的抑制作用比总砷(3]。有些细菌耐砷由于删除它从周围环境的能力4]。许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌有解毒机制(5]。细菌有不同的方式来应对高水平的砷,包括减少吸收,减少后的甲基化砷酸亚砷酸盐、砷的吸附带负电荷的离子电荷相反的氨基酸组细菌细胞壁,由一系列cysteine-rich肽封存,螯合,上、排斥、砷酸固定,异化的呼吸(5,6]。虽然许多细菌是有毒的砷,metal-accumulating细菌是经常发现在细菌耐金属(4]。南达和亚伯拉罕2)发现,砷的毒性高于铬、镁和铜(Mg >铜> Cr >)。砷是有毒的细菌,因为它类似于磷酸激酶等可以抑制酶(7]。

Rhizobacteria能够积极的殖民植物根系和促进植物生长通常被称为植物刺激Rhizobacteria (PGPR) [8]。PGPR可以入侵的内部细胞内和生存(细胞内PGPR,如根瘤菌),或仍在植物细胞(细胞外PGPR,如芽孢杆菌,假单胞菌,固氮菌)。PGPR等农杆菌属(根瘤菌)、产碱杆菌属(Ralstonia)节细菌属、Azospirillum固氮菌,芽孢杆菌,洋葱,沙雷氏菌属,假单胞菌有趣的生物金属萃取的植物,因为它们增加金属和生物量积累的速度由植物(9]。受污染的土壤往往缺少营养物质有时缺乏营养由于损失有用的微生物。然而,这样的土壤可以通过应用metal-tolerant微生物营养丰富,尤其是PGPR,这不仅提供必需营养素植物属性允许植物去除重金属,然后可以用于农业生产或者污染土壤的植物修复(11,12]。因此,建议为种植者接种植物生长在受污染的网站也扮演了重要的角色在净化重金属8,10]。这些rhizobacterial微生物提高植物生物量和稳定,再生长,恢复重metal-contaminated土壤(9]。

截至砷rhizobacteria和植物的相互作用研究。根据Titah et al。13];six-rhizobacterial财团的应用减轻了砷的毒性作用Ludwigia octovalvis和提高植物生物量。根据聂et al。14],油菜籽植物接种肠杆菌属下水道增长到一个程度显著高于noninoculated油菜籽植物由于砷的存在。格里克et al。15]报道拍摄的增加生物量和砷浓度的芽向日葵接种后荧光假单胞菌。

l . octovalvis是一个植物物种能够生存在原油受到石油污染的网站(16),可以吸收和积累砷在其组织(17]。本研究旨在确定砷(如砷酸)的水平阻力的确定rhizobacteria隔绝的根源l . octovalvis生长在温室和受污染的土地在马六甲,马来西亚。它还旨在确定砷的吸附能力。

2。材料和方法

2.1。附生植物Rhizobacterial隔绝的根源l . octovalvis

的详细步骤rhizobacterial隔离被Titah et al。18]。

2.2。识别Rhizobacteria

Rhizobacterial识别进行了使用两个生化方法:生物测井的第三代微生物识别系统(生物测井公司、美国)和Vitek2系统紧凑(美国Biomerieux)。rhizobacteria标识的详细步骤被Titah et al。18]。

2.3。测定砷的最低抑制浓度(MIC)

测试使用的改性方法进行了郭et al。19]。麦克风的砷酸rhizobacterium物种决心在三个复制的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)解决方案系列浓度的0(控制),250,500,750,1000 mg / L的砷以砷酸形式(砷酸钠氢七水硫酸锌(AsHNa₂O₄h·7₂O)) (FlukaChemika、瑞士)。用于这两种不同的控制方法:PBS溶液与细菌但没有砷酸(负控制)和另一个PBS溶液与砷酸但没有细菌(积极的控制)。基于研究哈雷和普雷斯科特(20.),10×PBS原液含有80克氯化钠(默克公司、德国),2 g氯化钾(R&M化学品、印度),11 g Na₂HPO₄h·7₂O (R&M化学品、印度)和2 g KH₂阿宝₄(R&M化学品、印度)。麦克风进行了测定与50毫升250毫升锥形烧瓶工作容积。砷酸在无菌PBS溶液的pH值是衡量使用Accument基本AB 15酸度计(费舍尔科学,美国)。平均pH值读数是7.3,7.4,7.5,7.6,和7.7的砷酸浓度0,250,500,750,和1000 mg / L,分别。文化是使用一个孵化器孵化瓶(普鲁泰克、模型si - 100 d、马来西亚)在37°C和150 rpm。细菌生长测定的吸光度为0 550海里,3、6日19日和24小时。

2.4。砷吸附实验使用识别Rhizobacteria在批处理系统中

一个砷吸附实验进行了使用修改后的方法[发表21- - - - - -23]。选择rhizobacteria被接种到Trypticase(胰蛋白酶的)大豆琼脂(TSA)媒体没有砷酸24 h。之后,选择rhizobacteria接种到无菌大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)。细胞悬液的选择rhizobacteria准备收获细胞在对数生长期中期根据所选rhizobacteria增长率图的典型。此时,光密度1.0 (OD)在550海里。细胞通过离心收获(5804年埃普多夫离心机,德国)4000 rpm,持续15分钟。获得的颗粒就洗两次通过使用8.5克氯化钠/ 1000毫升的解决方案。

砷的吸附是测试在250毫升锥形烧瓶。rhizobacterial细胞悬液为20% ( )或者10毫克干电池重量(起重集团)加入50毫升的无菌PBS的解决方案,它有一个100 mg / L的砷浓度稀释砷酸钠氢七水硫酸锌(AsHNa₂O₄h·7₂0)(丙烯酰胺Chemika、瑞士)。colonyforming单元(CFU)的初始rhizobacteria大约是1.4×10⁹CFU /毫升。pH值7.3测定砷酸为100 mg / L无菌PBS溶液中通过使用Accument基本AB 15酸度计(费舍尔科学,美国)。

所有样品都测试一式三份。所有的文化都使用一个孵化器孵化瓶(普鲁泰克、模型si - 100 d、马来西亚)在37°C和150 rpm。样本收获在0、2、6、17、24小时。OD是测量在每个采样通过Genesys 10 550 nm紫外线(美国热液体)。最后,这些rhizobacterial悬浊液连续稀释,和0.1毫升的这个样品是传播到TSA。殖民地的数量增长在CFU /毫升数。rhizobacteria细胞的干重是由过滤悬浮培养通过真空过滤机使用0.2μm膜滤纸(德国绘画纸)。隔夜干燥后的起重集团决心在105°C (24]。

10毫升的文化是在每个采样时间,上层清液和颗粒通过离心分离(5804年埃普多夫离心机,德国)10000转了15分钟。剩余数量的总砷存在于上层的是储存在−80°C (6]在电感耦合plasma-optical发射光谱仪(ICP-OES)分析利用最适条件7300 dv PerkinElmer总砷(美国)。细胞颗粒在室温下干了2天(25]。然后,HNO 1毫升的69%₃1毫升30%的H₂O₂,3毫升无菌纯净水被添加到细胞颗粒24 h。细胞样本存储在−20°C (24],砷浓度的细胞决定使用ICP-OES最适条件7300 dv PerkinElmer(美国)。

2.5。Stastitical分析

所有统计测试进行使用SPSS 17.0版(美国IBM)。双向方差分析(方差分析)在95%置信水平( )被用来评估重大变化在上层清液中总砷浓度和rhizobacteria的吸附能力。之间的关系进行相关分析来确定上层清液中砷的浓度和砷吸附重金属的能力rhizobacteria利用皮尔逊相关性。

2.6。透射电子显微镜(TEM)分析

选择rhizobacterium TEM图像,生物吸附能力最高,得到砷酸接触后48 h。砷的浓度是根据麦克风实验的结果。TEM进行横向和纵向结构的细胞暴露于砷后与未暴露的细胞。进行了客观分析光谱元素来确定rhizobacterium细胞中砷的含量,这是使用TEM设备模型进行飞利浦12厘米(荷兰)。

2.7。生物吸附动力学模型

在批处理实验中,进行了动力学研究来确定吸附剂和被吸附物的接触时间和评估反应系数。分析吸收动力学,许多模型,如符合一级pseudo-second-order,孔隙扩散,Elovich方程可以被使用。符合一级Lagergren方程是基于坚实的能力(26),而pseudo-second-order反应模型是基于固相吸附和意味着化学吸收作用是速率控制步骤27]。孔隙扩散模型是基于intraparticle扩散过程(28),而Elovich方程模型是基于最适合吸附机制。

2.7.1。符合一级模型

符合一级方程通常是表示如下: 在哪里和的吸附能力平衡和时间吗(毫克/克生物质)是符合一级吸附的速率常数(h)的线性形式被Lagergren符合一级模型。通过积分方程,应用边界条件来 ,和来在 ,它变成了

的一块对给了斜率和拦截。

2.7.2。Pseudo-Second-Order模型

pseudo-second-order模型是用来描述吸附动力学(27]。模型假定病原反应步骤可能是化学吸附或化学吸收作用涉及价部队通过分享或之间的电子交换吸附剂和山梨酸酯(29日]。这个模型是由下列方程(30.]: 在哪里是pseudo-second-order吸附的速率常数(毫克/克生物质/ h)。通过应用边界条件来 ,和来在 ,综合形式的方程 这是集成pseudo-second-order反应速率定律,可以重新获得以下线性形式:

的一块与应该提供一个线性关系的适用性二阶动力学。速率常数( )和吸附平衡( )分别可以获得的截距和斜率。

2.7.3。孔隙扩散顺序模型

几乎在大多数吸附过程,吸收不同比例 : 在哪里(毫克/克/分钟^1/2)是扩散速率常数和被吸附物吸附的数量在哪里 。的一块对收益率的斜率 。Weber-Morris情节和应该是一个斜率的直线呢和拦截C当吸附机制遵循intraparticle扩散过程(31日]。据韦伯和莫里斯(28),问吸附过程将由最慢的病原反应步骤控制。

第2.7.4。Elovich方程模型

Elovich方程是常用于确定动力学在气体和固体化学吸收作用[29日]。然而,一些研究人员这个模型应用于固液吸附系统,特别是在重金属的吸附32,33]。Elovich方程如下: 在哪里单位被吸附物吸附的数量吗和和Elovich常量,Elovich是初始吸附速率方程(毫克/克·h),然后呢与表面覆盖的范围(毫克/克)和活化能化学吸收作用[34]。的一块对收益率( )斜率和拦截。

3所示。结果与讨论

3.1。麦克风

十rhizobacteria的根源l . octovalvis测试抗砷酸包括节细菌属globiformis,芽孢杆菌megaterium、蜡样芽胞杆菌、芽孢杆菌、短小,葡萄球菌lentus,肠杆菌asburiae, Sphingomonas paucimobilis, Pantoeaspp。,根瘤菌rhizogenes,和根瘤菌radiobacter。表1显示了所有rhizobacteria砷酸麦克风的总结。r . radiobacter最高麦克风(> 1500 mg / L),表明它是最耐rhizobacterium砷(砷酸的形式)。r . rhizogenes有一个麦克风的砷酸750 mg / L。这两个根瘤菌最高的物种被孤立于砂飙升砷酸浓度(80毫克/公斤)35]。的增长r . rhizogenes和Sphingomonas paucimobilis砷酸抑制在一个水平的750 mg / L。砷酸的麦克风葡萄球菌lentus a . globiformis b、短小,和大肠Asburiae是500 mg / L,而b . megaterium,b的仙人掌,和Pantoea种虫害是250 mg / L。

的抗砷酸答:globiformis高于b . megaterium和b的仙人掌,同意的结果Achour et al。36]。根据Achour et al。36),砷酸的麦克风节细菌属sp.固体培养基(Luria-Bertani(磅)琼脂)是160毫米,而芽孢杆菌sp.是50毫米。另一项研究报告砷酸的麦克风节细菌属sp.和芽孢杆菌sp.上面磅琼脂是75毫米(37]。

砷酸的麦克风革兰氏阳性rhizobacteria低于革兰氏阴性rhizobacteria。这一发现表明,革兰氏阴性rhizobacteria更被砷酸或抗砷酸比革兰氏阳性rhizobacteria少。这种情况可能是由于细胞壁结构的差异革兰氏阴性和革兰氏阳性rhizobacteria之间。革兰氏阴性的细胞壁比革兰氏阳性rhizobacteria rhizobacteria更为复杂。革兰氏阴性rhizobacteria的细胞壁外层膜(OM)的选择性保护rhizobacteria有害物质,如抗生素、重金属和其他有毒化学物质(38]。OM含有蛋白质、脂肪和脂多糖。一项研究报道Anyanwu和Ugwu [39)显示,67%的12种革兰氏阴性细菌耐砷暴露比革兰氏阳性细菌。

3.2。确定Rhizobacteria的吸附能力

图1显示了上层清液中总砷的浓度在整个生物吸附测试。总砷浓度下降在第一2 h,在增加a . globiformis b . megaterium和b的仙人掌17小时,减少上层清液的三年底rhizobacteria曝光(24小时)。上层清液中总砷浓度的增加可能是由于砷酸转换成由rhizobacteria亚砷酸盐,这是后来抽出细胞(5]。机器人等。6)报道,hyper-resistant细菌可以占用50% - -100%的砷酸盐和亚砷酸出口约15% - -25%。

b、表现出不同的趋势。上层清液中总砷浓度增加到17小时然后减少在年底前曝光。葡萄球菌lentus也表现出不同的趋势,增加和减少上层清液中砷浓度从2 h 24 h。在大肠asburiae和Pantoeaspp,上层清液中总砷浓度增加6 h,然后降低。上层清液中砷浓度Sphingomonas paucimobilis降低最高2 h,而那些r . rhizogenes和r . radiobacter在年底前增加曝光(24小时)。砷去除rhizobacteria 24小时后可以安排如下:Sphingomonas paucimobilis>b、>B megaterium>b的仙人掌>答:globiformis>葡萄球菌lentus>r . radiobacter>大肠asburiae>Pantoeaspp。>r . rhizogenes。

砷酸进入细菌细胞壁通过快速、不具体的、本构吸收系统磷酸(40]。砷酸解毒涉及其减少砷酸还原酶的亚砷酸盐,之前通过膜电位驱动泵控制的流出反式行为抑制因子(ArsR)。ArsR蛋白质包含一个非常具体的结合位点对亚砷酸盐和磷酸盐能有效区分,硫酸、钴、镉。尽管ArsR特定亚砷酸盐、砷酸的清除可能发生砷酸通过最初的砷酸转化为亚砷酸盐还原酶和随后的封存ArsR [40]。

方差分析的结果表明,上层清液中总砷浓度显著不同取决于rhizobacteria物种和曝光时间( )。上层清液中总砷浓度Sphingomonas paucimobilis明显不同( )相比与其他九rhizobacteria 0 h。然而,在24 h,上层清液中总砷浓度Sphingomonas paucimobilis明显不同( )比其他七个rhizobacteria但不是不同( )从r . rhizogenes和r . radiobacter。

图2显示每个rhizobacterium物种总砷浓度在不同的细胞,这表明每个物种的砷吸附能力不同。Sphingomonas paucimobilis砷吸附最高(146.4±23.4毫克/克起重集团)在2 h。的最大吸附重金属砷b的仙人掌,b . megaterium和b、发生在24小时和16.8±4.2,15.4±3.1,9.4±0.6毫克/克起重集团。根据释迦et al。41),砷的积累b的仙人掌减少从24 - 96 h的接触。另一项研究报道,最大的砷积累芽孢杆菌种虫害应变DJ-1,观察到在增长,固定相为9.8±0.5毫克/克起重集团(42]。砷的吸附答:globiformis在24 h为32.2±5.0毫克/克起重集团。砷的吸附葡萄球菌lentus增加了6小时(19.2±2.8毫克/克起重集团),然后下降24 h(2.8±0.6毫克/克起重集团)。砷的吸附Pantoea种虫害下降6 h(2.0±0.2毫克/克起重集团),增加,然后下降到24小时(4.8±0.3 mg / g细胞干重)。砷的吸附大肠asburiae增加了17 h(13.5±1.9毫克/克起重集团)然后降低24小时(8.7±3.7毫克/克起重集团)。砷的吸附r . rhizogenes和r . radiobacter拒绝砷含量为11.2±0.1,3.9±0.1,25.9±0.4,4.3±0.9毫克/克起重集团。平均砷吸附重金属能力rhizobacteria 24小时后可以安排如下:Sphingomonas paucimobilis>答:globiformis>r . radiobacter>b、>葡萄球菌lentus>b的仙人掌>Pantoeaspp。>r . rhizogenes>大肠asburiae>b . megaterium。

方差分析表明,砷吸附能力之间的差距显著rhizobacteria物种( )。然而,曝光时间没有显著差异( )。LSD分析砷吸附重金属的能力表明,砷的吸附能力Sphingomonas paucimobilis和答:globiformis明显不同( )相比之下,其他八rhizobacteria。

进行相关分析来确定上层清液中砷的浓度之间的关系,以及砷的吸附能力rhizobacteria使用皮尔逊相关测试。结果表明相关系数0.3−0.01置信水平。负值表示一种负相关的关系。上层清液中砷的浓度降低,rhizobacteria拿起砷的能力增加。

3.3。TEM分析

TEM分析显示了显著差异Sphingomonas paucimobilis细胞暴露于砷酸浓度的750 mg / L和未曝光(控制)细胞。图3显示了TEM分析的结果Sphingomonas paucimobilis与细长的细胞(数字3(一个)和3 (b))和横向(数据3 (c)和3 (d))。没有观察到未暴露的细胞损伤Sphingomonas paucimobilis。图3 (c)表明,细胞壁(D), OM,浆细胞(M),细胞胞浆及其内部核糖体(R),染色体(K),包涵体(BI)在控制治疗。砷酸细胞暴露于砷(在形式,麻生太郎₄⁻³或(V))增厚,皱巴巴的细胞壁和细胞的质膜。Sphingomonas paucimobilis细胞生长在750 mg / L的砷酸浓度小于控制介质(数字增长3(一个)和3 (b))。胶囊(C)的存在可能与细胞的方法防止砷酸暴露。

3.4。砷的生物吸附动力学模型

生物吸附动力学的研究,各种动力学方程对数据进行测试,以确定他们的健康。表2显示了四个动力学模型的总结了十rhizobacteria识别。

基于图4符合一级模型,Lagergren对砷的吸附大肠asburiae和b的仙人掌显示了一个高相关系数(R²)。biosorbents导致了情节R²0.82 (b的仙人掌)和0.91 (大肠asburiae)。这一发现表明,符合一级Lagergren最好的解释了砷的吸附模型大肠asburiae和b的仙人掌。的问_e和k₁从方程的截距和斜率(2)是12.68毫克/克生物质和0.04 /小时大肠asburiae和11.35毫克/克生物质和0.03 /小时b的仙人掌。其他四个rhizobacteria显示低R²值。摘要Lagergren的符合一级动力学模型是列在表中2。

图5展示了七rhizobacteria pseudo-second-order情节。的R²的r . rhizogenes值最高(0.93),表明pseudo-second-order模型有利于砷吸附重金属r . rhizogenes。获得的问_e6.02毫克/克生物量,而获得的k₂从截距为0.5毫克/ g生物量/ h(表2)。其他rhizobacteria显示低R²值。

的k_d从方程的斜率(6)是3.11毫克/克生物质/分钟^1/2为b的仙人掌(图6)。孔隙扩散模型提供了最高R²砷吸附重金属的价值b的仙人掌为0.86。它表明,砷的分子扩散b的仙人掌的吸收能力发挥了重要作用b的仙人掌。的R²Elovich动力学模型b的仙人掌是远高于其他rhizobacteria相应的值(图7)。

的动力学模型b的仙人掌可以使用这四个模型计算,但R²孔隙扩散模型下最高。与此同时,符合一级动力学模型大肠asburiae最高R²价值。pseudo-second-order动力学模型r . rhizogenes表现出更高的R²价值比其他rhizobacteria。它可以得出结论,每个物种rhizobacteria对砷吸附不同的动力学模型。

4所示。结论

十孤立rhizobacterial . octovalvis(答:globiformis,b . megaterium b的仙人掌、b、葡萄球菌lentus, e . asburiae Sphingomonas paucimobilis, Pantoeaspp。r . rhizogenes, r . radiobacter砷酸接触后)有不同的麦克风。r . radiobacter是最耐rhizobacteria用麦克风砷酸> 1500 mg / L。所有rhizobacteria biosorb砷。Sphingomonas paucimobilis显示高砷吸附(146.4±23.4毫克/克起重集团)比其他九rhizobacteria。所有抗性rhizobacteria PGPR提高砷植物修复的潜力。基于动力学速率,b的仙人掌,大肠asburiae, r . rhizogenes最高R²值为0.86,0.99和0.93在孔隙扩散下,符合一级动力学,pseudo-second-order动力学模型。它可以得出结论,麦克风,砷吸附容量和砷吸附动力学模型依赖于rhizobacterial物种。

数据可用性

Excel表包括数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢世界级教授方案b的研究、技术和高等教育2018(合同编号。123.14 / D2.3 / KP / 2018)。