肠球菌都有效TIR-Domain基因是基因簇的一部分,促进细菌生存的血液

文摘

肠球菌都有效经历了一个过渡到一个耐多药医院病原体。的人口结构大肠都有效特点是明显的区别的演化支,hospital-adapted血统主要负责菌血症。到目前为止,在hospital-adapted紧张因素被识别,促进了医院的发病机理大肠都有效主要是在坚持中发挥作用和生物膜的生产,而生存因素所知甚少的血液。这项研究发现了一个基因簇,其中包括基因编码细菌人数/ interleukin-1受体-(行动)domain-containing蛋白质(轮胎)。集群被发现的院内菌株和位于一个假定的移动噬菌体的遗传因素。集群内的三个基因似乎被表示为一个操纵子。表达式中检测出细菌培养基和人类血液的存在。轮胎是释放到细菌上层清液,TirE2与膜囊泡相关联。此外,轮胎基因集群促进人体血液中细菌增殖,表明轮胎可能导致菌血症的发病机制。

1。介绍

在过去的三十年中,革兰氏阳性细菌肠球菌经历了明显的过渡从人类肠道共生的耐多药院内机会病原体(1- - - - - -3]。肠球菌的感染主要引起的肠球菌都有效和粪大肠(4,5]。粪大肠历史上占80 - 90%的临床分离株,和5 - 10%大肠都有效(6]。然而,大肠都有效上升的原因34%的肠球菌的感染7]。

的进化枝结构大肠都有效显示不同的团体,同桌的菌株分为支系B和医院的菌株为进化枝(8,9]。肠球菌的基因组高度塑料和能够获取和交换DNA大片段。特别是在进化枝,自适应基因吸收累积是反映在一个大的基因组大小8]。

最严重的感染所致大肠都有效心内膜炎,此外,大肠都有效经常导致尿路感染和菌血症(4]。血流感染是建立在易位,通过摄动肠或从医院环境污染或皮肤吸收(4]。

宿主先天免疫系统提供的第一道防御微生物的攻击。这是诱导通过高度保守的微生物结构的识别,即其分子模式(pamp),通过模式识别受体,其中toll样受体(通常)是主要的10,11]。pamp的识别通常介导抗菌反应,如吞噬作用和微生物杀死。目前的人类通常描述,TLR2已被确认是中央的大肠都有效(12]。MyD88 TLR2的关键细胞内的适配器,并刺激其细胞内途径导致NF-kB激活,导致炎性介质表达(13- - - - - -15]。自从最初识别病原体的免疫细胞是至关重要的主机的所有后续抗菌反应,干扰入侵细菌的先天免疫反应是一个重要的优势,和反作用是通过分子拟态和免疫逃避的因素(11,16]。

细菌行动——(人数/受体-)domain-containing蛋白质结构模拟主机域名,这是至关重要的蛋白质相互作用的TLR信号级联适配器(17,18]。细菌的免疫逃避性质行动第一次描述的蛋白质沙门氏菌血清,蛋白质被命名为“TlpA”(TIR-like蛋白质)[18]。从那时起,行动蛋白与免疫逃避属性描述的一系列革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,包括金黄色葡萄球菌(19,20.),粪大肠(21]。在一般情况下,细菌行动蛋白质负面干扰TLR信号通过适配器封锁或适配器退化(22]。TIR-domain-containing蛋白质分享几个氨基酸序列图案,如盒子1和2以及WxxxE主题(22,23]。TIR-domain-containing蛋白在粪大肠(TcpF)被描述为主要在尿路感染分离株,减弱MyD88-mediated信号,促进细菌生存在巨噬细胞(21,24]。密切相关的大肠都有效然而,TIR-domain-containing蛋白质尚未被描述。迄今为止发现的毒力因素大肠都有效主要是与粘附、聚合增长,生物膜的形成(25- - - - - -42]。识别毒力因素可能揭示新的治疗方法的目标。

我们的目标是识别TIR-domain-containing蛋白质大肠都有效(轮胎),比较他们在院内患病率和community-associated菌株,探索他们的遗传背景,并研究其功能。

2。材料和方法

2.1。菌株、质粒和生长条件

普遍筛查轮胎基因和基因hp1两者之间的轮胎基因进行多元化大肠都有效收集。不同地理来源的菌株(24个国家),主要的国家是荷兰(587隔离),拉脱维亚(96株)、挪威(88株)、瑞士(82株)、希腊(79株)、德国(61株)、葡萄牙(56隔离),丹麦(40隔离)。共有1194个菌株由血培养(161隔离),其他医院的隔离(意思粪便、尿液或伤口,875隔离),和人类社会(158株)隔离(表S1)。

大肠都有效和大肠杆菌菌株和质粒用于实验室实验表列出在这个研究S2。大肠都有效是生长在脑心浸液(BHI)介质或Luria-Bertani(磅)中在30°C或37°C和震撼;大肠杆菌菌株生长在LB培养基或磅补充20毫米葡萄糖在37°C。

为大肠都有效,使用抗生素庆大霉素和壮观霉素浓度为300µ25克/毫升和红霉素µ克/毫升。为大肠杆菌,使用庆大霉素和壮观霉素浓度的30µ克/毫升和100年µ分别g / ml。

pLysS Rosetta-gami (DE3)大肠杆菌蛋白表达菌株,100以下使用抗生素浓度:氨苄青霉素µ50 g / ml,氯霉素µ12.5 g / ml,四环素µ15 g / ml,卡那霉素µ50 g / ml,链霉素µ克/毫升。所有的抗生素都来自Sigma-Aldrich(美国)。

2.2。生物信息学分析TIR-Domain-Containing蛋白质

假定的基因编码TIR-domain-containing蛋白质被发现大肠都有效E1162基因组(基因库:ABQJ00000000)和蛋白质序列中发现contig107 (ABQJ01000097.1)轨迹标记EFME1162_RS19585(旧的轨迹标记EfmE1162_2149)和EFME1162_RS19595(旧的轨迹标记EfmE1162_2151),分别。

行动领域和蛋白质家族在守恒验证通过搜索域数据库(CDD) [43]。对齐前所述细菌和真核蛋白质行动(BtpA布鲁氏菌melitensis[EXU84762.1], TcpC大肠杆菌[NP_754290], YpTdp鼠疫杆菌[WP_002213208.1], PdTir副球菌denitrificans[WP_011746463.1],行动金黄色葡萄球菌[SAS0038, WP_000114516.1], SaTlp1金黄色葡萄球菌[CAQ50581.1], TcpF粪大肠[CCO72761.1], Myd88智人[AAH13589.1], TLR2智人[AAC34133.1])在多重序列比对程序执行MAFFT version 7 (44),和对齐被手动策划AliView [45]。说明使用ESPript 3对齐。x BtpA的二级结构元素(464下),访问lzp RCSB蛋白质数据银行(47,48]。系统发育树构建算法PROTGAMMAAUTO 100引导程序复制这些蛋白质序列使用RAxML v8.2 [49]。二级结构预测蛋白质折叠识别服务器Phyre2 [50),晶体结构的叠加TIR域的人类MyD88使用PDBe折叠v2.59 [51),见PyMOL [52]。

2.3。通过PCR基因检测

与gene-specific引物进行PCR(患病率筛选引物(表S3))和DreamTaq绿色PCR主混合(热费希尔科学、美国)根据制造商的指示。1微升的细菌培养BHI汤作为模板。10分钟的标准程序初始变性在95°C紧随其后30周期30年代变性在95°C, 30年代退火55°C, 30年代伸长在72°C最终伸长步骤7分钟在72°C。此后PCR产品可视化1%琼脂糖凝胶。

2.4。Phylogenomics

研究的分布轮胎的基因,大肠都有效基因组装配下载6月27日,2017 (n= 516),从国家生物技术信息中心(NCBI)。BLASTp [53,54搜索是对所有的下载基因组蛋白质执行TirE1 (EFF33949.1) Hp1 (EFF33950.1)和TirE2 (EFF33951.1)。一个核心基因种系发生树了大肠都有效基因组使用Parsnp [55]。结果树可视化和注释的存在与否tirE1,hp1,tirE2无花果树的基因,在v1.4.3 [56]。元数据包括原产地、隔离源、疾病信息、装配水平,并为每个收集antimicrobial-resistant表型轮胎艾滋病患者的基因组(表S4)从NCBI和帕特里克57]。

2.5。一个假定的转座因子的识别

-和下游的基因区域轮胎轨迹的大肠都有效E1162基因组序列比较的相应区域社会压力大肠都有效17 om39缺乏轮胎地区。被比较和分析使用阿耳特弥斯比较工具(58]。2.2.2成对比较数据用EasyFig [59,60]。插入E1162是公认的可动遗传因子的识别,并且每个基因在这一地区受到爆炸(53]和CDD [43]搜索识别相似的蛋白质和蛋白质域和Phyre2 [50)的结构、功能、进化分类预测(表1)。

插入的基因区两侧噬菌体整合酶提取的轮胎-locus-positive基因组。基因组包含不完整的插入元素,由于装配的不完全性,被排除在进一步分析。移动遗传元素reannotated Prokka 1.11 (61年),和蛋白质聚集了Roary 3.8.2 [62年]。要理解这些元素的守恒性质,创建一个热图和胃肠道的可视化工具(63年,64年]。

2.6。mRNA表达分析逆转录PCR (RT)

接触血液、细菌(E1162和K60-39)生长在BHI OD_600年0.4、用PBS和resuspended在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)中有0.05%的人血清白蛋白(RPMI-HSA)。新鲜的人类血液收集从水蛭素的健康志愿者血液管(瑞士罗氏诊断),添加到细菌最终浓度为80%,和孵化转向轮在37°C 3 h。冰冷的皂素血细胞溶解在0.3%,细菌颗粒与PBS洗。所有细菌样本存储在RNAprotect解决方案(试剂盒,德国)。RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、德国)制造商的指令后长期使用mutanolysin (0.1 U /初始裂解的一步µ左)和溶菌酶(1毫克/毫升)1 h在37°C。DNase治疗后(热量和运行设备;ArcticZymes、挪威),RNA的完整性和数量被NanoDrop检查以及琼脂糖凝胶。执行反转录(高容量cDNA逆转录设备;美国应用生物系统公司)100 ng RNA和DNA污染排除通过-逆转录酶(−RT)控制。的基因之后放大cDNA通过PCR(患病率筛选引物(表S3);30个周期;退火温度55°C),和1%的琼脂糖凝胶产品可视化。

为了评估是否基因表达在一起,连接引物被用于cDNA模板扩增基因间区域(结引物(表S3);30个周期;退火温度55°C)。此外,内部引物(患病率筛选引物(表S3);30个周期;退火温度55°C)是联系基因产物相结合。基因产物的身份证实了PCR产物测序。

2.7。克隆、表达和纯化的重组N-His-TirE

的E1162tirE1,hp1,tirE2基因扩增与BamHI-Fw NotI-Rv引物(表达引物(表S3))和克隆在坐标系到表达质粒pRSETB含有一个氨基端₆标签(美国英杰公司)(表S3),如前所述65年]。验证正确的序列的DNA测序后,pRSET / TirE1, pRSET / Hp1, pRSET / TirE2结构变成了大肠杆菌Rosetta-gami plysS (DE3)。表达诱导与1毫米异丙mid-logarithmic增长阶段β- - - - - -D1-thiogalactopyranoside (IPTG) 4小时或隔夜(图S1A)。

蛋白质分离从一个HiTrap螯合惠普列在本机(图印地)或变性(8 M尿素(图就是S1C)条件,筛选了使用一个咪唑梯度,从10到500毫米的AKTA FPLC蛋白质净化系统(通用电气医疗集团生命科学、澳大利亚)。protein-containing分数集中。分数包含变性蛋白质通过透析用盐复合缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷和30毫米氯化钠,液pH值7.8)。最后,来自本地和蛋白质变性条件与PBS透析。证实了纯净的蛋白质sds - page。计算蛋白质的大小与他的标签TirE1 20.4 kDa, TirE2 34.9 kDa, Hp1 56.9 kDa。

2.8。Anti-TirE血清、免疫沉淀反应和免疫印迹

纯化TirE1、Hp1 TirE2被用来进行免疫接种肠球菌消极的兔子,Eurogentec(比利时)。Preimmune血清测试无反应性对肠球菌的溶解产物前注入。

细菌(E1162和K60-39)一夜之间从25毫升文化是颗粒状和resuspended裂解缓冲(溶菌酶10毫克/毫升,mutanolysin 6 U /µl),孵化1 h在37°C,用近1分钟开关(4倍)。离心分离的细菌上层清液集中40倍使用10 kDa截止滤光片,用近1分钟开关(4倍)。免疫沉淀反应进行使用SureBeads蛋白G磁珠(美国Bio-Rad)根据制造商。总之,珠子是用PBS-T (PBS渐变为0.01%),和50%的anti-TirE1, anti-TirE2或anti-Hp1血清在PBS补充道。三次洗涤后,细菌溶菌产物或上层清液珠孵育1 h在室温下摇晃。最后,样本筛选了15µl免疫印迹样本缓冲区。

如前所述(执行免疫印迹66年]。immunodetection的多克隆抗血清对TirE1 (1: 300), Hp1(1: 300),和TirE2(1: 300)是使用。猪辣根过氧化物酶(合)共轭anti-rabbit免疫球蛋白抗体(1:3000)被用作二次抗体。

2.9。膜泡隔绝肠球菌

膜囊泡是隔绝大肠都有效如前所述(67年]。简而言之,细菌(K60-39做)磅固定相的生长,和细菌细胞被旋转下文化30分钟在4°C 6000 g。通过0.22上层清液的过滤µm保温瓶顶级过滤器(美国微孔)。水泡颗粒然后得到的上层清液通过超速离心法在4°C 100.000 g 4 h,用PBS洗净,再离心机在4°C 100.000 g 4 h。水泡颗粒是通过密度梯度离心法之后清洗使用OptiPrep (Sigma-Aldrich、美国),在哪里MV-containing样本底部加载。200年µl在sds - page分析了分数,vesicle-containing分数被选中。蛋白质从各自的分数和柠檬酸沉淀在热科学Q-Exactive质谱仪分析(热费希尔科学、美国)胰蛋白酶化后的解决方案。蛋白质组发现者2.1中的原始数据处理软件。碎片光谱搜索与WGS菌株本身的数据(大肠都有效做和K60-39)使用Sequest HT程序。

2.10。Markerless突变体建设

利用Cre -液态氧复合系统,markerless基因缺失突变体轮胎基因簇(locus_tag: EFME1162_RS19585 EFME1162_RS19595)创建如前所述[40,68年,69年]。简而言之,gblock (TirE1_up-Tir2_down(表S3)组成的5′和3′侧翼地区(大约每500个基点)的目标生态国际扶轮网站之间的碎片放大tirE1_up和tirE2_down引物(表S3)和克隆到向量pWS3 [70年),导致pDELtir。然后,gentamicin-resistant盒两侧lox66和lox71网站(69年被克隆到生态国际扶轮网站包含在TirE1_up-Tir2_down gblock之间的5′和3′侧翼地区pDELtir。

由此产生的质粒pDELtirGenta随后electroporated主管大肠都有效E1162,如前所述。标志着gentamicin-resistant突变体是获得越来越多的转化株在适当的温度下补充相应的抗生素。质粒pWS3-Cre携带基因编码的Cre重组酶被引入电穿孔的明显变异。后续培养消除gentamicin-resistant盒式执行,从而确保pWS-Cre损失如前所述[69年]。切除pWS3-Cre gentamicin-resistant磁带和损失的被使用引物PCR验证tirE1-check-up tirE1-check-down, RT-qPCR使用内部引物(患病率筛选引物(表S3)),以及通过全基因组测序(WGS)这也确保了没有其他突变发生。

markerless突变体的基因组DNA是孤立使用向导基因组DNA净化设备(美国Promega)和溶菌酶(20毫克/毫升),溶解在水中,2500 HiSeq测序平台(美国Illumina公司)。

大肠都有效及其基因敲除突变体基因组比较成对使用阿耳特弥斯比较工具(58]。2.2.2成对比较数据用EasyFig [59]。GATK用于变体打电话来估计SNP区别这两种变体(71年,72年]。

2.11。GFP-Expression质粒在肠球菌

pEF25向量与GFP克隆SmaI网站导致pEF451变成了大肠杆菌如前所述EC1000 (在提交(73年])和electroporated到主管大肠都有效E1162和markerless同基因的变异E1162Δ轮胎。转化株(GFP-E1162和GFP-E1162Δ轮胎)选择抗生素压力和经PCR以及共焦激光扫描显微镜(样品形貌徕卡SP5),配备了一个石油plan-Neofluar(×63/1.4客观)。GFP在395海里很兴奋。

2.12。细胞系和文化

外周血单核细胞(PBMCs) (1×10⁷细胞/毫升)和人类中性粒细胞(中性粒细胞)(5×10⁶细胞/毫升)被孤立的从肝素化的血液如前所述65年]。

所有哺乳动物细胞种植在37°C孵化器有限公司为5%₂。HEK293T细胞,从写明ATCC获得人类胚胎肾细胞系,美国被用来稳定表达人类TLR2如前所述(在提交(74年])。简而言之,人类TLR2 (NM_003264.3)克隆及其信号肽(aa1-20)取代PreProTrypsin信号肽(MSALLILALVGAAVA),改编自pFLAG-CMV-1向量(美国Sigma-Aldrich)。n端,国旗标签(DYKDDDDK)紧随其后的是一个灵活的连接器(gg)。HEK293T细胞中稳定表达,使用慢病毒表达系统。国旗标签检测使用anti-FLAG M2抗体(美国Sigma-Aldrich),随后沾phycoerythrin-labeled goat-anti-mouse抗体,并在流式细胞分析仪检测(美国BD生物科学FACSVerse)。HEK293T-TLR2细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和10% (v / v)胎牛血清(FCS)(生命表达载体技术,美国)和100单位/毫升的青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich,德国)。

美国Thp-1细胞(写明ATCC)人类单核细胞的细胞系,RPMI 1640介质中保持2毫米谷酰胺补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫;消息灵通的擤鼻涕,美国),10毫米,1毫米丙酮酸钠,葡萄糖4.5 g / L, 0.05毫米beta-mercaptoethanol(从Gibco,生活技术,美国)。Thp-1 macrophage-like细胞的分化,RPMI 1640 2毫米谷酰胺无酚红的使用与上面相同的补充剂,但随着添加25 nM佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)。

2.13。细胞因子的生产上大肠都有效感染

的影响轮胎轨迹在细胞因子释放了通过测量引发释放Thp-1感染大肠都有效野生型菌株E1162或E1162Δ轮胎。

细菌生长在BHI OD_600年0.4、用PBS和resuspended细胞培养基和稀释到适当的CFU /毫升。

Thp-1细胞被播种在RPMI 24-well板1×10⁵每口井的细胞和分化为24小时25 nM PMA。感染,100µ细菌悬液l(等于我300,我100,莫伊10)添加每细胞培养好,孵化37°C。上层清液收集后2、4、6 h,和残骸是在13000 rpm在4°C。

使用引发引发上层清液中检测到酶联免疫试剂盒(热费希尔科学、美国)后,制造商的指示。吸光度测量在450海里。

2.14。干扰Ligand-Induced细胞因子的生产

哺乳动物细胞被镀在2.5×10⁴细胞/在96孔培养板实验前24小时达到融合。抑制剂(轮胎和/或Hp1 SSL3 [75年])的最终浓度增加了10µ克/毫升,在37°C细胞孵化1 h。6 h后孵化与刺激(3 ng / ml MALP-2(美国圣克鲁斯);3 ng / ml PAM-2-Cys和3 ng / ml PAM-3-Cys (EMC Microcollections、德国),上层清液的收集和引发测量使用特定引发酶联免疫试剂盒(Sanquin、荷兰)后,制造商的指示。简而言之,Nunc MaxiSorp盘子被涂上一层anti-IL-8,洗和阻塞PBS-T脱脂奶粉4%,再洗和孵化与上层的高性能ELISA (HPE)缓冲区在37°C 1 h。洗后,生物素化的anti-IL-8和随后streptavidin-HRP补充道。Tetramethylbenzidine(三甲)作为底物,并与硫酸反应是停止尽快改变颜色是可见的。OD_450年为量化测量。

2.15。在流式细胞仪Serum-Dependent吞噬作用

从健康志愿者血液收集,允许凝块。离心后,人类血清收集和集中。血清是储存在−70°C。在需要时,热失活血清进行30分钟的56°C。

GFP-E1162和GFP-E1162Δ轮胎是生长在OD嗨吗_600年0.4、用PBS和暴露在血清中15分钟在96 - 37°C好圆底板(格林尼奥地利)吞噬作用之前颤抖的高原。

中性粒细胞和PBMCs (200µl和300µ分别为l)被添加到细菌,和细胞coincubated 15分钟37°C。细胞在RPMI-HSA之后在1.5%多聚甲醛固定,通过流式细胞仪和荧光测量(FACSCalibur;美国,正欲)。

2.16。细胞内的巨噬细胞内存活

细胞内生存在gentamicin-vancomycin保护试验评估。Thp-1细胞被播种在RPMI 12-well板与所需的补充1×10⁶每口井的细胞和分化为24小时25 nM PMA。细菌生长在BHI OD_600年0.4、用PBS和resuspended在细胞培养基。感染,200µl细胞培养的细菌悬液添加和孵化1 h。PBS洗Thp-1细胞后,16µg / ml万古霉素和150年µg / ml庆大霉素被添加到井为了杀死细菌细胞外。Thp-1细胞之后收获后24、48、72和120 h和细胞溶解在0.3%的皂苷。释放细胞内的细菌被镀在血琼脂平板和计算。

2.17。遗传损伤吞噬作用和血液化验生存

GFP-E1162和GFP-E1162Δ轮胎血琼脂平板稀释的BHI OD_600年0.1和增长37°C OD_600年0.4、用PBS和resuspended RPMI-HSA。血从健康志愿者获得水蛭素血管(瑞士罗氏诊断)和RPMI-HSA稀释。所有遗传实验,血液80%如果未以其他方式表示。

吞噬作用在圆底聚苯乙烯管执行严格的摇晃在37°C为20分钟。红细胞被添加细胞溶解流式细胞仪赖氨酸溶液(BD) 20分钟25°C。剩下的免疫细胞与RPMI-HSA洗和固定在150年µl RPMI-HSA 1%的多聚甲醛。荧光测量通过流式细胞术(FACSCalibur;美国,正欲)。

血液化验生存,E1162 E1162Δ轮胎是生长在OD嗨吗_600年0.4、用PBS和孵化与80%的新鲜水蛭素血硅化管(美国Sigma-Aldrich)转向轮在37°C 3 h,如果不是另有指示。皂素血细胞溶解在0.3%,血琼脂平板菌落计数。

2.18。统计分析和数据验证

统计数据分析GraphPad棱镜7。提出了数据表示为均值±SEM汇集实验。至少在3种不同捐赠者的血液实验,代表男性和女性。

2.19。道德声明

人类的血液分析进行了符合赫尔辛基宣言的道德原则,乌特勒支大学医学中心的医学伦理委员会(荷兰),和伦理批准(2014/1653)用挪威北方与参与者的书面知情同意。

3所示。结果

3.1。识别和预测三级结构的轮胎

两个公认的蛋白质注释的行动领域被确定大肠都有效在蛋白质在NCBI数据库。这两个开放阅读框(orf)被发现,用一个假想的蛋白质(hp1他们之间)。在大肠都有效E1162, TIR-domain-containing轨迹标记EFME1162_RS19585 EfmE1162_RS19595跨度492和864个基点,分别。与先前的研究[19),指定的蛋白质编码基因tirE1和tirE2。的预测质量TirE1 18.5 kDa, TirE2 32.9 kDa, Hp1 55.0 kDa(表1)。通过搜索(CDD TIR-domains被验证43),发现属于蛋白质家庭pfam08937 (TirE1)和pfam13676 (TirE2)。

多种细菌TIR-domain-containing蛋白质的氨基酸序列比对显示高TIR域跨物种的保护。氨基酸序列是特别保守盒1和2,以及WxxxE主题。在TirE1 WxxxE主题的色氨酸、酪氨酸相反但芳香族氨基酸。WxxxE图案被发现在大多数细菌TIR-domain-containing蛋白质包括PdTir SaTlp1, TlpA,以及真核蛋白质TLR TLR1、2, 4, 6, 10和热红外适配器蛋白质的指控76年)(图1(一))。变化在链之间的地区βB和螺旋αB,所谓的BB循环(图1(一))。表示空气循环被描述为同型TIR-domain surface-exposed和必要的交互TLR / IL-1R信号(77年]。两个轮胎的预测三级结构(图1 (b))显示了一个典型的flavodoxin-like行动褶皱,中央平行β床单被α螺旋两岸的表(77年]。

系统发育树说明彼此对齐TIR-domain-containing蛋白质之间的亲缘关系表明,人类TLR2和MyD88分组在同一集群,而细菌TIR-domain-containing蛋白质组在不同的集群(图S2)。尽管TirE1和TirE2源自大肠都有效他们属于两个不同的集群,表明这是可能不仅仅是基因的复制,而是两个不同的基因。

3.2。的轮胎在院内轨迹是普遍的,但是却没有在社区隔离

总共有1194大肠都有效分离筛选了tirE1,tirE2,hp1通过定期使用患病率筛选引物PCR或爆炸搜索排序隔离。tirE1,hp1,tirE2基因被发现在血培养分离株(非常普遍tirE137%,hp136%,tirE235%),其中占主导地位的STs ST17, ST203, ST192。频繁的基因也在其他医院的样品(tirE132%,hp122%,tirE231%)与最普遍的STs ST78, ST389, ST192。84医院筛查阳性样本tirE1和tirE2,但缺乏hp1正值的存在vanB79年vancomycin-resistant集群(表S1)。对比血培养分离株的高患病率和其他医院的样本,这三个基因在社区隔离缺席(图2)。

此外,搜索显示,爆炸轮胎轨迹被发现在14%的460年草案院内菌株的基因组序列,尽管这些基因在基因组序列草案缺席的菌株(图56个社区S3)。

这种二分法的存在轮胎医院和社区之间的轨迹分离表明的占有轮胎轨迹是有益的细菌在医院设置。

3.3。的轮胎轨迹是本地化的假定的转座因子的噬菌体

的基因环境的分析轮胎轨迹表明,基因定位在一个假定的两侧是两个整合移动遗传元素。这一假定的兆欧指定MGE-TirE(包含移动遗传元素轮胎。成对比较的基因组区域包括MGE-TirE应变与社区E1162压力大肠都有效17 om39不包含轮胎轨迹显示MGE-TirE的大小(图14.425 kbp和网站的集成3(一个))。orf的假定的函数(n=在MGE-TirEs表示在图13)3(一个)和表1。六子的预测编码转录监管机构(n= 2)或dna结合蛋白(n= 4)。31%的GC含量MGE-TirE尤其低(GC含量计算4代表菌株),因为平均GC的内容大肠都有效是38% (78年]。这两个orf侧翼MGE-TirE预测编码假定的整合。他们都显示高相似性噬菌体整合。此外,一个假想蛋白(hp9)是类似的乳杆菌前噬菌体遗迹LP4蛋白(79年]。爆炸分析该地区作为一个整体并没有显示任何相似性序列在NCBI nonredundant数据库或序列读取存档。orf的越轨GC价值和假定的功能表明外源基因,可能起源于噬菌体。

在多次MGE-TirE可能是收购大肠都有效进化,因为它发生在不同分支的核心基因种系发生树(图S3)。此外,MGE-TirE集成在附近一个相同的网站主机噬菌体整合酶基因(int1在所有TirE-positive基因组),指示特定站点集成。描述保护MGE-TirE的内容,创建一个热图,说明大多数的基因识别的一部分MGE-TirE非常丰富在所有MGE-TirE-containing菌株的单个元素,包括整合和TIR-domain-containing蛋白质(图3 (b))。

3.4。基因的表达轮胎轨迹

rt - pcr显示的基因轮胎轨迹在E1162和K60-39表示。表达式中检测出的固定相BHI和暴露在人类血液的3 h;所有三个基因在E1162(图显示增强的表达式4)。启动子预测分析发现只有三个基因之间的弱启动子的轮胎轨迹,所以链接rt - pcr,选择引物不同的基因杂交,进行确定的基因是一个操纵子(图的一部分5(一个))。的连接tirE1和hp1以及hp1和tirE2给产品(图5 (b)),而向外连接(数据未显示)。测序证实的身份PCR产品(数据未显示)。这表明这两个概念轮胎年代和hp1由相同的链编码转录在一起。

3.5。轮胎-Locus-Encoded蛋白质释放到上清液和膜囊泡

因为没有信号肽乳沟网站在轮胎和Hp1 SignalP预测的,这是一个悬而未决的问题是否细菌能够释放这些蛋白质(表1)。轮胎和Hp1特定抗体但不幸的敏感度较低(结果未显示)。为了检测蛋白质释放,anti-TirE / Hp1血清用于免疫沉淀反应的蛋白质的细菌溶菌产物和上层清液。免疫沉淀反应的蛋白质被免疫印迹之后发现。所有三个蛋白质检测的细胞溶解产物以及上层清液E1162和K60-39文化,说明通过一个未知的机制(数字6(一)- - - - - -6 (c))。

膜囊泡(MVs)曾被认为是一个分泌系统(80年]。TirE2和Hp1被发现与MVs K60-39和做有关。指数修改蛋白质丰度指数(emPAI) HP1 TirE2值为0.389,为0.089(图6 (d))。鉴定信心被描述为“高”在蛋白质错误发现率(罗斯福)信心,罗斯福是低于1%,1肽和2 peptide-to-spectrum匹配(67年]。

3.6。建设tirE1-hp1-tirE2基因敲除菌株的功能研究

一个markerless变异缺乏轮胎轨迹构造,经PCR基因表达和全基因组测序(数字S4A- - - - - -C)。全基因组序列的比较野生型菌株(E1162)和突变株(E1162Δ轮胎)没有确认tirE1-hp1-tirE2(图自己),除了这三个基因,菌株份额99%核苷酸身份(数据未显示)。的删除tirE1-hp1-tirE2不影响细菌生长的BHI(图S4D)。不幸的是,我们没有成功构建单基因淘汰赛也在补充删除,可能是因为有重复序列基因区域,它有一个GC含量很低。

3.7。的轮胎轨迹不干扰细胞因子释放

差异化的Thp1细胞感染E1162或其同基因的变异E1162Δ轮胎在我10,100年和300年。引发的上层清液中检测到。见图7(一),E1162 E1162Δ轮胎在所有通过诱导引发释放以类似的方式。

检查轮胎是否能够干扰TLR2信号,HEK293T细胞稳定表达TLR2刺激了合成lipopeptides MALP-2, Pam2Cys,和Pam3Cys轮胎和Hp1重组的存在与否,这是之前添加到细胞的刺激。通过ELISA引发是浮在表面的测量。TirE1和TirE2抑制Malp2, Pam2Cys和Pam3Cys-induced TLR2激活显著(图7 (b))。这种效应被SSL3类似于抑制,一个著名的葡萄球菌抑制剂TLR2信号(75年]。然而,TirE1的结合,Hp1 TirE2没有抑制作用TLR2-mediated释放引发(图7 (b))。

3.8。的轮胎轨迹并不影响在巨噬细胞吞噬作用或细菌的生存

自吞噬enterococci血清依赖性(81年- - - - - -83年),拥有的效果轮胎轨迹上serum-induced吞噬作用进一步检查。因此,GFP-expressing enterococci (GFP-E1162和GFP-E1162Δ轮胎)在人类血液孵化1 h,之前水平的荧光细菌内中性粒细胞通过流式细胞术分析。没有显著差异水平的吞噬作用的野生型菌株及其同基因的突变(图S5A)。实验被重复使用血细胞。在这里,GFP-E1162 GFP-E1162Δ轮胎之前通过添加50%或100%血清调理接触人类中性粒细胞和PBMCs。再一次,没有显著区别GFP-E1162和GFP-E1162Δ的吞噬作用轮胎(图S5B)。这清楚地表明轮胎轨迹不影响host-mediated吞噬的细菌。

接下来,所扮演的角色轮胎轨迹在巨噬细胞对细胞内生存调查。E1162和E1162Δ轮胎enterococci与Thp-1 coincubated随着时间的推移,在镀前CFU的决心。E1162和E1162的0.5%ΔtirE24小时后幸存下来,120 h后,很少有细菌活了下来。的存在与否轮胎轨迹的能力没有任何影响细菌生存在巨噬细胞(图S6)。

3.9。的存在轮胎轨迹提高血液中细菌生存和增殖

最后,评估是否存在轮胎轨迹起着作用大肠都有效血液中生存。E1162和E1162Δ轮胎在人体全血孵化为镀金前3 h CFU的决心。野生型菌株在菌落会增加19-fold血液孵化,而其同基因的突变体显示只有一个CFU(图13倍增加8(一个))。此外,不同的生存和复制E1162和E1162之间ΔtirE随着时间的推移增加(6小时)(图8 (b))。这表明的存在轮胎轨迹有利于细菌生长在人类血液。

4所示。讨论

菌血症明显增加所致大肠都有效(7,84年)和有限的知识肠球菌的毒力因素导致搜索TIR-domain-containing蛋白质在这个物种。这项研究发现了一个轮胎轨迹编码两个轮胎蛋白质和一个中间Hp1蛋白。的轮胎轨迹在院内隔离是普遍的,但是却没有在共生体(图2),位于一个假定的噬菌体起源的转座因子(图3)。三个基因可以被表示为一个操纵子(图5),确定这三个蛋白在细菌细胞溶解产物和上层清液(图6)。此外,轮胎位点基因表达当细菌被暴露于血液(图4),的存在轮胎轨迹增加血液中细菌增殖(图8)。

Hp1分割的两个基因编码两个轮胎这里介绍的蛋白质。因为我们能够将两个基因之间通过rt - pcr和没有强启动子识别基因,我们建议他们表示为一个操纵子。的轮胎轨迹被发现在一个假定的转座因子。噬菌体的元素是推定地起源由于其低GC含量和噬菌体的存在蛋白质。同样的,tcpF的粪大肠被发现在一个热点噬菌体重组事件的起源(24]。事实上,它已经多次观察到细菌行动噬菌体的基因中发现地区起源,如tlpA(美国血清)[18),tcpC(大肠杆菌),tcpB(布鲁氏菌)[85年等),或在移动元素行动(金黄色葡萄球菌鳞状细胞癌(上)86年]。因此,横向转移的细菌行动基因是可能的。此外,假定的MGE-TirE出现在多个分支机构大肠都有效种系发生树(图S3),说明水平基因转移。然而,它不能得出元素是否获得或失去了几次。

的发病率很高轮胎轨迹被发现在临床和血液文化隔离,而基因缺失在社区隔离(图2)。类似的观察了tcpC,这是存在于uropathogenic菌株的40%和8%在同桌的菌株(85年]。TcpF主要在尿路感染隔离,还经常在同桌的隔离在同桌的菌株在入侵(76%和58%)(21]。不过这可能是由于的进化枝结构的差异大肠都有效和粪大肠:当大肠都有效特点是寄主专一性的血统和演化支,分明进化枝(A1)隔离来自住院病人,这个差异不是见过的吗粪大肠(1,87年]。在这种情况下,它是有意义的大肠都有效轮胎没有找到在社区隔离,而粪大肠tcpF是多少。为粪大肠,这是建议的占有tcpF基因也是有益的社区隔离,因为对同桌的胃肠道体内平衡是至关重要的。因此,避免NFkB激活通过TLR信号抑制减少稳态失衡的风险(21]。除此之外的高发病率轮胎位点基因在临床和血培养,观察到10%的医院筛查阳性样品tirE1和tirE2,但缺乏hp1也呈阳性vanBvancomycin-resistant集群(表S2)。hp1别名HMPREF0351_10592,以前称为共轭插入站点vanB转座子Tn1549年/5382年在不同应变背景(ST192, ST78、ST927 ST202隔离)(88年]。这vanB转座子也已被证明能够喜欢at富集序列(89年),和31%的假定的MGE-TirE GC内容丰富。然而,这还有待调查未来的研究hp1提供了一个插入的网站vanB转座子在我们集合。

不需要直接接触细菌宿主细胞产生细菌TIR-domain-containing蛋白质的功能,例如,大肠杆菌TcpC [90年),金黄色葡萄球菌行动(19),和细菌TIR-domain-containing宿主细胞内蛋白质已发现之前(85年]。然而,大多数的细菌TIR-domain-containing蛋白质缺乏分泌信号(22,蛋白质是如何释放,转移到其他细胞在很大程度上仍是个未知数。在这里,我们发现轮胎-locus-encoded蛋白在细菌上层清液和证明TirE2 Hp1可以找到与细菌MVs有关。同样的,金黄色葡萄球菌行动也与MVs隔绝细菌生长在BHI(结果未显示)。这可能表明,细菌通过MVs TIR-domain-containing蛋白质可以被释放。为了验证这个假说,水泡蛋白质组学的内容行动-gene-possessing细菌相比应该评估和检查参与组成分泌腺nonmembrane绑定。

本研究发现纯化轮胎负面干扰引发释放HEK293T细胞表达TLR2刺激之前添加到细胞培养时其特定的配体(图7 (b))。这些发现符合NFkB-reporter化验的结果粪大肠在hTLR2-expressing进行的TcpF HEK293细胞刺激PamCys3 [21),类似的研究金黄色葡萄球菌行动(19,86年]。从革兰氏阴性细菌(细菌TIR-domain-containing蛋白质18,22,90年)也被证明妨碍宿主先天免疫反应通过TLR信号干扰。轮胎的抑制作用引发释放被废除的轮胎和Hp1时使用。同样,没有差别在细胞因子释放macrophage-like细胞感染E1162或E1162ΔtirE(图7(一))。这种现象背后的机制是难以捉摸的,但可能包括Hp1的监管作用。不幸的是,它是不可能让单淘汰赛中区分蛋白质的影响。两个葡萄球菌TIR-domain-containing蛋白质,SaTlp1 SaTlp2,人畜共患ST398,也显示偏离典型的主题:他们调节NFkB信号而不是表达下调(20.]。

在大肠都有效,轮胎轨迹提升人类血液中细菌增殖(图8)和血液也诱导轮胎表达式(图4)。这表明轮胎轨迹提供了大肠都有效血液中幸存的优势通过干扰TLR-2信号。这也可以解释的优势轮胎和hp1血培养和医院隔离。

5。结论

提出了研究描述了轮胎,大肠都有效TIR-domain-containing蛋白质,作为小说毒性因素。的轮胎轨迹是独家的大肠都有效医院隔离和位于一个假定的移动噬菌体的遗传元素来源。在人类血液细菌增殖是增强的占有轮胎轨迹,暗示了轮胎在菌血症和致病性中的作用大肠都有效。

数据可用性

数据分析在当前的研究中包括补充材料文件,可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为潜在的利益冲突。

作者的贡献

莫娜Johannessen和克里斯汀Hegstad同样这项工作。

确认

我们感谢a . Didriksen a . Mekhlif Aerts p和k Julin优秀的技术援助。这项研究是由挪威北部地区卫生权威医学研究项目(SFP1157-14和SFP1231-15)和差旅补助从研究学校非功能性需求的项目编号为249062。这篇文章出版费用由出版基金的资助大学UiT-The北极挪威。

补充材料

图S1:表达和纯化TirE1 TirE2。图S2:真核和原核TIR-domain-containing蛋白质的系统发育树。图S3:中点的树显示的存在和缺失tirE1-hp1-tirE2。成功的建设E1162ΔtirE图S4:确认。图S5:tirE1-hp1-tirE2不影响免疫细胞吞噬细菌的能力。图S6:存在tirE1-hp1-tirE2不影响巨噬细胞内细菌的生存。表S1:流行的轮胎轨迹。表S2:菌株和质粒用于实验。表S3:引物用于这项研究。表S4:元数据的大肠都有效基因组窝藏tirE1-hp1-tirE2基因。(补充材料)

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